占慧慧,丁 嬋,彭思源,劉 媛,孟俊華,肖作為,崔培梧*

1湖南中醫(yī)藥大學藥學院;2國家中醫(yī)藥管理局中藥藥性與藥效三級科研實驗室;3湖南中醫(yī)藥大學菌物藥研究室,長沙 410208

茯苓又名茯菟、茯靈、松腴等,系多孔菌科真菌茯苓Poriacocos(Schw.) Wolf的干燥菌核,味甘、淡,性平,歸心、肺、脾、腎經(jīng),有利水滲濕、健脾寧心的功效[1]。茯苓收載于《中華人民共和國藥典》(簡稱《中國藥典》)2020年版一部,是中藥四君八珍之一,有“十方九苓”之稱[2]。茯苓的主要藥效物質(zhì)是茯苓多糖和茯苓三萜[3],現(xiàn)代藥理學研究表明,茯苓三萜具有利尿[4]、抗腫瘤[5]、免疫調(diào)節(jié)[6]、抗炎[7]、抗衰老[8]、降血糖和調(diào)血脂[9]等作用,是當前用于表征茯苓質(zhì)量和效應的重要指標[10-12]。目前市場流通的茯苓主要為栽培品種,不同的產(chǎn)地、加工方式、飲片規(guī)格等都可能影響茯苓藥材和飲片的質(zhì)量[11,13]。2020年版《中國藥典》僅采用薄層色譜法鑒別控制茯苓和茯苓皮藥材的質(zhì)量,難以全面反映其質(zhì)量的優(yōu)劣。指紋圖譜研究是現(xiàn)代中藥領域內(nèi)普遍被認可、應用較廣泛的中藥質(zhì)量控制方法之一,具有整體性高、特征性強等優(yōu)勢,符合中藥多成分綜合作用的特點,有進一步鑒別、鑒定和分類的潛力[14,15]?；瘜W模式識別可對指紋圖譜的多維信息進行分析,準確反映藥材的質(zhì)量差異,從而達到整體描述和合理評價藥材質(zhì)量的目的[13]。本研擬究建立茯苓皮(源于茯苓菌核表皮)與白茯苓(源于茯苓菌核去皮后的部位)的HPLC指紋圖譜,并結合模式識別手段分析各共有峰對指紋圖譜的作用,找出其中的主要峰和特征峰,從整體上評價茯苓皮和白茯苓中各化學物質(zhì)的差異,為茯苓藥材的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1200高效液相色譜儀(美國安捷倫科技公司);JS-40型超聲波清洗儀(常州鴻澤實驗科技有限公司)。

1.2 試藥

對照品茯苓新酸B(批號140723,質(zhì)量分數(shù)≥98%)、茯苓新酸A(批號140314,質(zhì)量分數(shù)≥98%)、去氫茯苓酸(批號140903,質(zhì)量分數(shù)≥98%)、松苓新酸(批號140902,質(zhì)量分數(shù)≥98%)、茯苓酸(批號140212,質(zhì)量分數(shù)≥98%)購自成都克洛瑪生物科技有限公司;去氫土莫酸(批號AF21032,質(zhì)量分數(shù)≥98%)購自成都埃法生物科技有限公司;乙腈為色譜純,水為怡寶純凈水,其余試劑為分析純。

茯苓藥材樣品來源見表1,經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學劉塔斯教授鑒定為多孔菌科真菌茯苓Poriacocos(Schw.) Wolf的不同藥用部位,符合《中國藥典》2020年版各項規(guī)定。

表1 樣品信息

2 方法與結果

2.1 色譜條件

Agilent 5 TC-C18(2)(250 mm × 4.6 mm,5 μm)色譜柱;流動相為0.3%磷酸水溶液(A)-乙腈(B),梯度洗脫:0～18 min,50%→60%B;18～28 min,60%B;28～58 min,60%→92%B;58～68 min,92%B;檢測波長為242 nm和203 nm;進樣量10 μL;柱溫25 ℃;體積流量1.0 mL/min。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液的制備

精密稱取各茯苓三萜酸對照品適量,加甲醇溶解制成茯苓新酸B、去氫土莫酸、茯苓新酸A、去氫茯苓酸、茯苓酸、松苓新酸對照品質(zhì)量濃度分別為0.020 7、0.071 4、0.006 4、0.038 6、0.037 1、0.017 1 mg/mL的混合對照品溶液。放于4 °C冰箱保存,備用。

2.2.2 供試品溶液的制備

取茯苓樣品粉末2.0 g(過60目篩),精密稱定,置100 mL干燥具塞錐形瓶中,加甲醇50 mL,密塞,稱定質(zhì)量,超聲處理30 min,放冷,用甲醇補足減失質(zhì)量,濾過,茯苓皮樣品濾液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾,取續(xù)濾液,即得;白茯苓樣品濾液先旋轉蒸干后定容至2.0 mL,再經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾,取續(xù)濾液,即得。

2.3 方法學考察

2.3.1 精密度實驗

取云南茯苓皮樣品(S8),按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液,依據(jù)“2.1”項下的色譜條件,連續(xù)進樣測定6次,以茯苓酸(10號峰)為參照峰,計算得各色譜峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD值分別在0.04%～0.86%和0.22%～1.69%之間,表明儀器精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性實驗

取云南茯苓皮樣品(S8),按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液,依據(jù)“2.1”項下的色譜條件,分別于0、2、4、6、8、12、24 h進樣測定,測得各色譜峰的相對保留時間和相對峰面積并計算得RSD值分別在0.01%～0.27%和0.32%～1.19%之間,表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.3 重復性實驗

取云南茯苓皮樣品(S8)6份,精密稱定,按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液,依據(jù)“2.1”項下的色譜條件進樣測定,測得各色譜峰的相對保留時間和相對峰面積并計算得RSD值分別在0.02%～0.29%和0.81%～4.53%之間,表明方法重復性好。

2.3.4 溶劑峰和滯后峰的考察

取空白對照(甲醇)和云南茯苓皮樣品(S8)溶液,檢測時間延長至2 h,考察結果如圖1所示,測試結果表明空白溶劑無干擾且未見滯后峰出現(xiàn)。

圖1 溶劑峰(A)和滯后峰(B)的考察色譜圖Fig.1 Investigation chromatograms of solvent peaks (A) and hysteresis peaks (B)

2.4 指紋圖譜的建立

2.4.1 指紋圖譜共有模式的建立

將14批不同產(chǎn)地不同藥用部位茯苓樣品的色譜圖導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012版)”軟件分別生成茯苓樣品的疊加圖譜和對照指紋圖譜。14批茯苓皮和白茯苓樣品的疊加圖譜和對照指紋圖譜見圖2,茯苓皮和白茯苓各自的對照指紋圖譜及混合對照品HPLC色譜圖見圖3。由圖2和3可知,茯苓皮與白茯苓樣品共有的典型色譜峰有15個;經(jīng)與混合對照品溶液色譜圖比對,

圖2 14批茯苓皮與白茯苓飲片的指紋圖譜疊加圖和對照指紋圖譜Fig.2 Superimposed fingerprints and control fingerprint of 14 batches of Poriae Cutis and White Poria decoction pieces

圖3 不同產(chǎn)地茯苓皮(A)和白茯苓(B)飲片對照指紋圖譜與混合對照品HPLC圖(C)Fig.3 Control fingerprints of Poriae Cutis (A) and White Poria (B) decoction pieces from different regions and HPLC chromatogram of mixed standards (C)注:2:茯苓新酸B;3:去氫土莫酸;4:茯苓新酸A;9:去氫茯苓酸;10:茯苓酸;12:松苓新酸。Note:2:Poricoic acid B;3:Dehydrotumulosic acid;4:Poricoic acid A;9:Dehydropachymic acid;10:Pachymic acid;12:Dehydrotrametenolic acid.

指認了其中6個共有峰,分別為茯苓新酸B(2號峰)、去氫土莫酸(3號峰)、茯苓新酸A(4號峰)、去氫茯苓酸(9號峰)、茯苓酸(10號峰)、松苓新酸(12號峰);其中10號峰茯苓酸成分是茯苓中具有代表性的活性三萜酸類成分,性質(zhì)穩(wěn)定,峰面積所占比例較大,分離度好,因此確定其為參照峰(S)。

2.4.2 茯苓皮與白茯苓共有峰的相對保留時間與相對峰面積

以不同產(chǎn)地茯苓皮和白茯苓樣品HPLC色譜圖中的10號峰(茯苓酸)為參照峰(S),計算各個批次樣品中其他共有峰與S峰的相對保留時間與相對峰面積,結果見表2和表3。由表2和表3可知,茯苓皮與白茯苓樣品共有峰相對保留時間的波動較小(RSD值在0.02%～0.64%),而相對峰面積波動較大,表明茯苓皮與白茯苓HPLC指紋圖譜中主要峰群的整體面貌基本一致,但同一批次樣品各成分之間含有量及不同藥用部位樣品各成分含有量差別較大。

表2 14批茯苓皮與白茯苓飲片指紋圖譜共有峰的相對保留時間

表3 14批茯苓皮與白茯苓飲片指紋圖譜共有峰的相對峰面積

2.4.3 相似度分析

采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012版)”軟件計算14批茯苓樣品HPLC指紋圖譜的相似度(見表4),由結果可知,茯苓皮樣品相似度在0.951～0.998,白茯苓樣品相似度在0.894～0.993,表明不同產(chǎn)地同一藥用部位茯苓樣品相似度較好;茯苓皮與白茯苓之間相似度在0.389～0.765,說明不同藥用部位的茯苓指紋圖譜有明顯區(qū)別。

表4 14批茯苓皮與白茯苓飲片的相似度

2.5 各產(chǎn)地茯苓皮與白茯苓樣品的聚類分析

聚類分析(CA)是一種按“物以類聚”原則通過將觀察對象依據(jù)某些特征分類的多元統(tǒng)計分析手段,從而建立樣本與樣本之間的相似關系或親疏關系,目前在中藥方面的應用較廣泛,如真?zhèn)舞b別、品種分類及質(zhì)量評價等[16]。采用SPSS 26.0軟件,以14批不同產(chǎn)地不同藥用部位茯苓樣品的15個共有峰峰面積為變量,用組間連接法、歐式距離為度量標準進行聚類,聚類結果見圖4。由圖4可知,14份茯苓樣品被分成了2大類:第一大類為茯苓皮(S1～S9);第二大類為白茯苓(S10～S14),這與樣品的性狀鑒別結果吻合,表明不同藥用部位間茯苓樣品的差異較大,觀察“2.4.2”項下各共有峰的相對峰面積均值可發(fā)現(xiàn),茯苓皮中除峰6和峰9外其他共有色譜峰均高于白茯苓,提示各成分含量的高低可能是造成不同藥用部位藥材差異的主要原因。此外白茯苓樣品按產(chǎn)地分為兩類:I類樣品為S10和S11,產(chǎn)自湖南;II類樣品為S13和S14,產(chǎn)自云南。

圖4 14批不同產(chǎn)地茯苓皮和白茯苓樣品聚類分析樹狀圖Fig.4 Cluster analysis of 14 batches of Poriae Cutis and White Poria samples from different regions

2.6 各產(chǎn)地茯苓皮與白茯苓樣品的主成分分析

將不同產(chǎn)地茯苓皮與白茯苓樣品各共有峰峰號對峰面積作折線圖(見圖5),從圖可知在本實驗條下茯苓樣品峰面積數(shù)據(jù)擬合度較小,樣本組間差異較大,故采用無監(jiān)督的主成分分析(PCA)方法,使用的分析軟件為SPSS 26.0和SIMCA 14.1。

圖5 14批不同產(chǎn)地茯苓皮和白茯苓樣品峰面積折線圖Fig.5 Peak area line chart of 14 batches of Poriae Cutis and White Poria samples from different regions

2.6.1 主成分結果

以標準化后的各共有峰峰面積為變量進行PCA分析。表5為主成分結果,前2個主成分解釋了全部方差的90.387%,能夠反映茯苓皮與白茯苓指紋圖譜中共有峰的大部分信息,結合碎石圖(見圖6)可知,前2個主成分特征值相對較大,而其他主成分之間比較平緩,因此提取前兩個主成分并標記為Y1和Y2。圖7為14批茯苓樣品的PCA散點得分圖,結果表明,14批樣品可分為2類,I類樣品為S1-S9,II樣品為S10-S14,該現(xiàn)象與CA分析結果基本一致。

圖6 茯苓飲片樣品PCA碎石圖Fig.6 PCA scree plot of decoction pieces samples made from P.cocos sclerotium

圖7 14批茯苓飲片樣品的PCA散點得分圖Fig.7 PCA score scatter plot of 14 batches of decoction pieces samples made from P.cocos sclerotium

表5 茯苓飲片樣品的主成分結果

2.6.2 主成分表達式

根據(jù)標準化后的各個共有峰變量X1-15占主成分的權重(見表6),得到Y1、Y2的線性組合:Y1= 0.229X1+ 0.111X2+ 0.268X3-0.251X4+ 0.295X5+ 0.295X6+ 0.189X7+ 0.282X8+ 0.299X9+ 0.300X10+ 0.279X11-0.257X12-0.233X13-0.265X14-0.251X15,Y2= 0.331X1+ 0.504X2-0.091X3-0.304X4+ 0.094X5+ 0.015X6+ 0.360X7+ 0.191X8+ 0.041X9+ 0.077X10+ 0.157X11+ 0.290X12+ 0.360X13+ 0.231X14+ 0.265X15。

表6 茯苓飲片樣品PCA的成分得分系數(shù)矩陣

由上式可知,在Y1中,3、5和6、8～11號峰(X3、X5,6、X8-11)的系數(shù)絕對值大于其他共有峰變量的系數(shù)絕對值,所以主成分Y1是7個共有峰的綜合反應,觀察“2.4.2”項下各共有峰的相對峰面積可發(fā)現(xiàn),茯苓皮樣品3、5和6、8～11號峰的相對峰面積均值與白茯苓3、5和6、8～11號峰的相對峰面積均值較接近,而其他共有峰的相對峰面積均值都相差很大,說明這7個共有峰及所代表的成分(包括已指認的共有峰代表成分:去氫土莫酸、去氫茯苓酸、茯苓酸)在評價茯苓皮和白茯苓質(zhì)量優(yōu)劣時是必不可少的。在Y2中,1和2、4、7、12～15號峰(X1,2、X4、X7、X12-15)的系數(shù)大于其他共有峰變量的系數(shù),所以主成分Y2是由這8個共有峰來綜合反應,根據(jù)各共有峰的相對峰面積可知,茯苓皮樣品這8個共有峰的相對峰面積均值遠大于白茯苓樣品,提示這8個共有峰(包括已指認的共有峰,2號峰-茯苓新酸B、4號峰-茯苓新酸A、12號峰-松苓新酸)可以作為茯苓皮與白茯苓指紋圖譜(見圖2)中茯苓皮的特征鑒別分。

2.6.3 主成分得分和綜合得分

表7是根據(jù)主成分表達式計算的各樣本主成分得分和以各個主成分方差貢獻率占兩個主成分總方差貢獻率的比率為權重計算的綜合得分[17],主成分Y1得分比較高的是S10、S11、S13、S14,主成分Y2得分比較高的是S2、S4、S7、S10,綜合得分比較高的是S10～S14,結合茯苓皮和白茯苓各自的對照指紋圖譜(見圖3A和圖3B)或共有峰峰面積信息,可知在本研究的茯苓皮與白茯苓HPLC指紋圖譜條件下,白茯苓樣品(S10～S14)的3(去氫土莫酸)、5和6、8、9(去氫茯苓酸)、10(茯苓酸)、11號峰成分含量高于茯苓皮;而S2、S4、S7、S10樣品的1和2、4、7、12～15號峰成分含量高于其他樣品,其中S2、S4、S7都是茯苓皮樣品,提示在本實驗條件下測得的茯苓皮的1、2(茯苓新酸B)、4(茯苓新酸A)、7、12(松苓新酸)、13-15號峰成分含量普遍高于白茯苓;綜合得分較高的都是白茯苓樣品,說明白茯苓樣品15個共有峰成分含量間差異普遍比茯苓皮小。此外,載荷圖表明1、2(茯苓新酸B)、7號色譜峰對茯苓皮及白茯苓藥材的整體質(zhì)量起主要影響作用,如圖8所示。

圖8 14批茯苓飲片樣品的主成分載荷圖Fig.8 Loading scatter plot of PCA of 14 batches of decoction pieces samples made from P.cocos sclerotium

表7 主成分得分和綜合得分

3 討論與結論

本研究采用甲醇為提取溶劑、超聲處理30 min的樣品提取方法[18],考察了不同流動相(乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水、乙腈-0.1%磷酸水、乙腈-0.2%磷酸水、乙腈-0.3%磷酸水),不同色譜柱[Agilent 5 TC-C18(2)(250 mm × 4.6 mm,5 μm)、Welch Ultimate XB-C18(250 mm × 4.6 mm,5 μm)、Agilent Eclipse Plus C18(250 mm × 4.6 mm,5 μm)],不同體積流量(1.0、1.1、1.2 mL/min),不同色譜柱溫度(22、25、28 ℃),不同采集波長(203、210、242 nm)對指紋圖譜的影響,最終確定色譜條件為流動相為乙腈-0.3%磷酸水,Agilent 5 TC-C18(2)(250 mm × 4.6 mm,5 μm)色譜柱,體積流量為1.0 mL/min,色譜柱溫度25 °C,變波長方式采集,此條件下基線平穩(wěn),色譜峰峰形較好,分離效果較佳。

在此基礎上采用HPLC法建立了14批來自不同產(chǎn)地的茯苓皮與白茯苓指紋圖譜,在茯苓皮與白茯苓指紋圖譜的共有模式下共標定了15個共有峰,并通過化學對照品指認了其中6個化學成分:茯苓新酸B、去氫土莫酸、茯苓新酸A、去氫茯苓酸、茯苓酸、松苓新酸。通過14批不同產(chǎn)地茯苓皮和白茯苓樣品聚類分析樹狀圖和峰面積折線圖結合相似度數(shù)據(jù)可知不同藥用部位的茯苓樣品組間差異較大,組內(nèi)差異較小,白茯苓樣品與產(chǎn)地的關聯(lián)性較強。因此模式識別采用無監(jiān)督的PCA方法,PCA結果將15個共有峰變量分成2個主成分Y1和Y2,Y1是包括去氫土莫酸、去氫茯苓酸、茯苓酸成分在內(nèi)的7個共有色譜峰的綜合反應,表明7個共有色譜峰在進行茯苓皮與白茯苓指紋圖譜研究時必不可少;Y2是包括茯苓新酸B、茯苓新酸A、松苓新酸成分在內(nèi)的8個色譜峰的綜合反應,提示這8個色譜峰可作為在同時評價茯苓皮與白茯苓質(zhì)量時茯苓皮的特征鑒別峰。對指紋圖譜影響較大的共有峰變量參數(shù)為1、2(茯苓新酸B)、7號色譜峰。白茯苓這15個共有峰成分間含量差異比茯苓皮小。實際上白茯苓這15個共有峰成分含量都遠低于茯苓皮,為了使茯苓皮與白茯苓指紋圖譜的共有模式更完整和可測故而在制備白茯苓時加了一步濃縮步驟。

研究表明本文建立的方法簡便、可靠、準確,可以為茯苓皮及白茯苓的質(zhì)量評價、標準的制定及藥材的合理利用提供參考依據(jù)。