謝水香,雷彩燕

河南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院,鄭州 450002

油茶(Camelliaoleifera)是山茶科(Theaceae Mirb),山茶屬(CamelliaL.)的一種多年生常綠灌木。油茶中含有大量的活性物質(zhì),比如多酚、角鯊烯、黃酮以及微量元素等[1]。目前人們對(duì)油茶的開發(fā)和利用主要集中在油茶籽和油茶籽油[2],而油茶的葉子則成了廢料。

多酚(polyphenol)是指分子結(jié)構(gòu)中具有若干個(gè)酚羥基的化合物的總稱,在植物的根、莖、葉以及果實(shí)中都有廣泛的分布。多酚主要的衍生物是兒茶素類(catechins),還含有酚酸類(phenolic acids)、黃烷醇類(flavanols)等物質(zhì)。多酚作為一類植物次生代謝產(chǎn)物,是植物抵御病原菌入侵的重要生化物質(zhì)之一。目前關(guān)于茶多酚對(duì)動(dòng)物細(xì)菌的抑菌活性研究較多,而且已經(jīng)得到普遍公認(rèn)[3, 4]。而對(duì)于油茶多酚的研究,大多數(shù)僅僅是山茶籽油中多酚的提取及含量測(cè)定[5,6],關(guān)于其抑菌活性的研究相對(duì)缺乏。因此,本研究對(duì)油茶葉多酚進(jìn)行提取,研究其對(duì)植物病原真菌的抑制活性及機(jī)理,為植物源農(nóng)藥的開發(fā)以及病害的綠色防控提供基礎(chǔ)。研究有利于拓寬油茶資源的綜合開發(fā)利用以及多酚在生物農(nóng)藥領(lǐng)域的應(yīng)用[7]。

1 材料與方法

1.1 供試材料

實(shí)驗(yàn)所用油茶葉均采自江西省贛州市興國(guó)縣興江鄉(xiāng)江口村的油茶樹。

供試植物病原菌包括:假禾谷鐮刀菌(Fusariumpseudograminearum)[8]、新月彎孢霉(Curvularialunata)[9]、鏈格孢(Alternariaalternata)[10]、草莓多主棒孢霉(Corynesporacassiicola)[11]、大麗輪枝菌(Verticilliumdahliae)[12]、葡萄座腔菌(Botryosphaeriadothidea)[13]、尖孢鐮孢菌苦瓜專化型(Fusariumoxysporumf.sp.momdicae)[14]。

病原菌由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院病理實(shí)驗(yàn)室純化,在PDA培養(yǎng)基(馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基)上倒置培養(yǎng),培養(yǎng)溫度28 ℃,光照和黑暗培養(yǎng)各12 h,純化兩代以上。

酒石酸亞鐵溶液、磷酸鹽緩沖液:根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)茶多酚測(cè)定方法(GBT8313-2002),制作酒石酸亞鐵溶液和磷酸鹽緩沖液。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 多酚的提取

將采摘好的油茶葉用水清洗干凈,然后放置工作臺(tái)瀝干,在60 ℃下烘干至恒重,用高速離心粉碎機(jī)研磨成粉,過60目篩后置于密閉環(huán)境,低溫、遮光保存[15]。參考文獻(xiàn)[16,17]的方法進(jìn)行多酚提取,提取溫度為40 ℃,超聲波功率為300 W,液料比為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40,乙醇體積分?jǐn)?shù)為20%、40%、60%、80%,超聲波時(shí)間為20、40、60、80 min,每個(gè)提取條件重復(fù)4次。浸提完,離心(4 ℃,3 000 r/min),取上清液進(jìn)行多酚含量測(cè)定。根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)茶多酚測(cè)定方法(GBT8313-2002),使用沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品,在540 nm波長(zhǎng)處,采用0.5 cm比色皿測(cè)定上清液吸光度。根據(jù)多酚標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定多酚質(zhì)量,按照公式(1)計(jì)算多酚提取率。

(1)

式中:C為由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得出的樣品質(zhì)量濃度,g/mL;V為樣品溶液的體積,mL;L為樣品的總稀釋倍數(shù);m為樣品的質(zhì)量,g。

1.2.2β-環(huán)糊精對(duì)多酚的保護(hù)作用

按照“1.2.1”的方法,在1.0 g油茶葉粉末中添加不同質(zhì)量β-環(huán)糊精(0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g),提取和測(cè)定多酚提取率并研究β-環(huán)糊精對(duì)其影響[18, 19],每個(gè)濃度設(shè)置4個(gè)重復(fù)。

1.2.3 多酚的分離純化

采用文獻(xiàn)[20,21]的方法進(jìn)行多酚樣品的分離純化。離心后的上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至原體積的1/3,加入等體積氯仿,振蕩萃取;取上層液體;加入等體積的乙酸乙酯萃取上層液體,在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中蒸干,多酚固體用去離子水溶解,利用凍干儀得到精制的多酚樣品[22]。

1.2.4 多酚對(duì)植物病原真菌抑制效果研究

參考文獻(xiàn)[23,24]的方法進(jìn)行試驗(yàn)。供試植物病原真菌在PDA培養(yǎng)基上活化培養(yǎng),待菌株即將長(zhǎng)滿平板后,轉(zhuǎn)板繼續(xù)培養(yǎng),培養(yǎng)至長(zhǎng)滿整個(gè)平板后備用。在溫度為40～50 ℃的PDA培養(yǎng)基中,加入多酚溶液混勻,制成有效濃度為10%、5%、2%、0%的多酚PDA培養(yǎng)基。用內(nèi)徑9 mm的打孔器打取培養(yǎng)好的病原真菌菌餅置于平板中央,放入培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)。每個(gè)處理設(shè)置四個(gè)重復(fù)。從第三天開始,采用十字交叉法測(cè)定各菌株的菌落直徑(D),待空白對(duì)照組長(zhǎng)滿整個(gè)平板后停止測(cè)量,按照公式(2)計(jì)算多酚的抑菌率。

抑菌率=

(2)

1.2.5 多酚對(duì)植物病原真菌菌落形態(tài)的影響

方法步驟與“1.2.4”一致,當(dāng)空白對(duì)照組即將長(zhǎng)滿整個(gè)平板時(shí),使用相機(jī)拍攝處理組與對(duì)照組的菌落,比較各菌落顏色及形態(tài)。

1.2.6 多酚對(duì)真菌孢子萌發(fā)的影響

用打孔器打取培養(yǎng)好的病原真菌菌餅放在50 mL的PDB培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)(28 ℃,160 r/min),對(duì)照組PDB培養(yǎng)基中放入空白PDA餅塊。菌液開始渾濁后,吸取0.2 mL原液,在顯微鏡下觀察孢子數(shù)量。待PDB培養(yǎng)液中孢子量滿足實(shí)驗(yàn)要求,過濾得到孢子懸浮液,在生物顯微鏡下采用血球計(jì)數(shù)板法統(tǒng)計(jì)孢子數(shù)量,按照公式(3)、(4)計(jì)算數(shù)據(jù)。每個(gè)處理設(shè)置四個(gè)重復(fù)。

孢子量=孢子平均數(shù)×500

(3)

抑制率=

(4)

采用凹玻片計(jì)數(shù)法[25]觀察孢子萌發(fā)情況。在培養(yǎng)皿上面鋪一層濕潤(rùn)的濾紙,每個(gè)凹玻片中打入60 μL的孢子懸浮液后,將凹玻片放在濾紙上面,隨即放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(溫度28 ℃,光照∶黑暗 = 12∶12),每隔2 h在生物顯微鏡下觀察孢子萌發(fā)情況,按照公式(5)、(6)計(jì)算數(shù)據(jù)[26]。每個(gè)處理設(shè)置四個(gè)重復(fù)。

(5)

抑制率=

(6)

1.2.7 油茶多酚對(duì)病原真菌可溶性蛋白含量的影響

用打孔器打取培養(yǎng)好的病原真菌菌餅放入多酚有效濃度為10%的PDB培養(yǎng)基中,對(duì)照組為放入空白PDA餅塊的PDB培養(yǎng)基,28 ℃,160 r/min振蕩培養(yǎng)。待菌液開始渾濁后,在超凈工作臺(tái)過濾得到處理組原液和對(duì)照組原液。分別吸取0.01 mL對(duì)照組和處理組上清液于離心管中,隨即加入0.09 mL的蒸餾水以及0.50 mL的考馬斯亮藍(lán)G-250溶液,充分混合。室溫下靜置2 min后比色,并記錄吸光值(OD595)。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出空白對(duì)照組和多酚處理組的可溶性蛋白含量[27]。每個(gè)處理設(shè)置四個(gè)重復(fù)。

1.2.8 數(shù)據(jù)分析

使用WPS office Excel、GraphPad Prism 8.0整理數(shù)據(jù)和繪圖,利用SPSS 26.0進(jìn)行數(shù)據(jù)差異顯著性分析,采用單因素ANOVA檢驗(yàn),事后比較采用Bonferroni、Tamhane分析方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 多酚提取條件的優(yōu)化

目前人們對(duì)油茶葉的利用率較低,對(duì)油茶葉多酚的研究更少,不同的提取條件影響多酚的提取率[15,28,29]。為了提高油茶葉中多酚的提取率,分析了不同料液比、乙醇濃度和超聲時(shí)間下的提取率變化。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果(見圖1)看出,多酚的最佳提取方案為1∶30 g/mL的料液比,60%的乙醇濃度以及60 min的超聲波時(shí)間,多酚提取率達(dá)14.10%。

圖1 料液比、乙醇濃度、超聲波時(shí)間和β-環(huán)糊精添加量對(duì)多酚提取率的影響Fig.1 Solid-liquid ratio,ethanol concentration,ultrasonic time and addition amount of β-cyclodextrin on the extraction rate of polyphenols注:不同字母表示差異顯著(P<0.05)。Note:Different letters indicate significant differences (P <0.05).

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在多酚提取過程中,在多酚的最佳提取方案中加入0.80 g的β-環(huán)糊精,多酚提取率可提升至22.92%。添加β-環(huán)糊精可以提高多酚的提取率,這與前人報(bào)道相一致,即β-環(huán)糊精可以和多酚形成超分子復(fù)合物,可保護(hù)多酚,避免多酚降解[19,30],從而提高多酚的提取率,但是否影響多酚對(duì)植物病原菌的抑制作用尚未可知,還需進(jìn)一步研究。

2.2 多酚對(duì)常見植物病原真菌抑菌率的影響

從結(jié)果(見表1)看出多酚對(duì)不同病原真菌的抑菌率不同,濃度越高,抑菌作用越明顯。有效濃度為10%的多酚對(duì)假禾谷鐮刀菌、新月彎孢霉、鏈格孢、草莓多主棒孢霉、大麗輪枝菌、葡萄座腔菌的抑菌率達(dá)到50%以上;有效濃度為5%的多酚對(duì)假禾谷鐮刀菌、新月彎孢霉、草莓多主棒孢、大麗輪枝菌、葡萄座腔菌的抑菌率達(dá)到40%以上;有效濃度為2%的多酚對(duì)草莓多主棒孢、大麗輪枝菌、尖孢鐮孢菌苦瓜專化型的抑菌率達(dá)到30%以上。

表1 多酚對(duì)植物病原真菌生長(zhǎng)速率的影響

根據(jù)文獻(xiàn)可知,多酚的抑菌效果隨著濃度的增加而增強(qiáng)[31]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與先前文獻(xiàn)報(bào)道一致,即多酚提取物對(duì)植物病原菌具有一定的抑制作用,且多酚對(duì)不同病原菌的抑菌效果會(huì)隨著多酚有效濃度的增加而增加。

2.3 多酚抑菌機(jī)理研究

2.3.1 多酚對(duì)常見植物病原真菌菌落的影響

在研究多酚對(duì)常見植物病原真菌的抑菌作用時(shí),發(fā)現(xiàn)處理組的菌落顏色發(fā)生變化,因此拍攝了植物病原真菌的菌落。結(jié)果(見圖2)顯示,經(jīng)多酚處理后的菌落顏色和形態(tài)都發(fā)生變化,其中有效濃度為10%的差異最為明顯,5%的有效濃度也有較明顯差異。

圖2 多酚對(duì)菌落形態(tài)的影響Fig.2 Effect of polyphenols on colony morphology注:CK:對(duì)照組;10%:多酚有效濃度為10%的處理組;5%:多酚有效濃度為5%的處理組;A:葡萄座腔菌;B:鏈格孢;C:假禾谷鐮刀菌;D:大麗輪枝菌;E:新月彎孢霉;F:草莓多主棒孢霉;G:尖孢鐮孢菌苦瓜?；?。Note:CK:control group;10%:polyphenol with effective concentration of 10% of treatment group;5%:polyphenol with effective concentration of 5% of treatment group;A:Botryosphaeria dothidea;B:Alternaria alternata;C:Fusarium pseudograminearum;D:Verticillium dahlia;E:Curvularia lunata;F:Corynespora cassiicola;G:Fusarium oxysporum f.sp.momdicae.

2.3.2 多酚對(duì)常見植物病原真菌孢子數(shù)量、萌發(fā)以及形態(tài)的影響

多酚處理后,菌落顏色和形態(tài)發(fā)生了改變,為了進(jìn)一步探究多酚抑制常見植物病原真菌的機(jī)理,以抑菌效果最強(qiáng)的植病原真菌-大麗輪枝菌為研究對(duì)象,用有效濃度為10%的多酚對(duì)大麗輪枝菌進(jìn)行培養(yǎng),觀察植物病原真菌的產(chǎn)孢量以及孢子萌發(fā)情況。結(jié)果顯示,多酚處理后,大麗輪枝菌的孢子抑制率達(dá)97.79%,孢子萌發(fā)抑制率達(dá)81.77%,說明多酚對(duì)大麗輪枝菌孢子量和孢子萌發(fā)都具有抑制作用。

在探究多酚對(duì)植物病原真菌孢子量以及萌發(fā)是否有影響時(shí),發(fā)現(xiàn)經(jīng)多酚處理后的植物病原真菌孢子形態(tài)發(fā)生變化(見圖3)。光學(xué)顯微鏡下可見孢子形態(tài)呈現(xiàn)畸形,孢子變細(xì)、產(chǎn)生芽管,且在孢子一端或兩端聚集許多顆?；蛐∏虻痊F(xiàn)象;而對(duì)照組孢子粗細(xì)均勻且無膨大等情況,如圖3所示。文獻(xiàn)報(bào)道多酚影響病原菌的菌絲形態(tài)、孢子數(shù)量,例如紅豆皮多酚提取物處理李斯特菌ATCC19119和沙門氏菌ATCC14028后,能夠觀察到菌體細(xì)胞表面出現(xiàn)明顯的褶皺和凹陷;烏藥葉多酚處理金黃色葡萄球菌后,可以觀察到細(xì)胞變形、皺縮和塌陷等現(xiàn)象[32];茶多酚處理玉米小斑病菌、香蕉炭疽病菌和蓮腐敗病菌后,能夠抑制三種病原菌的孢子萌發(fā),并且觀察到孢子產(chǎn)生芽管以及在孢子的端部聚集了許多顆?；蛐∏?菌絲則扭曲、畸形[33],與本研究結(jié)果推測(cè)的多酚抑菌機(jī)理一致。

圖3 大麗輪枝菌對(duì)照組與處理組孢子形態(tài)對(duì)比Fig.3 Comparison of spore morphology between control group and treatment group of Verticillium dahlia注:CK:對(duì)照組;10%:多酚有效濃度為10%的處理組。Note:CK:control group;10%:treatment with polyphenol of 10% effective concentration.

2.3.3 多酚對(duì)常見植物病原真菌可溶性蛋白含量的影響

選擇有效濃度為10%的多酚處理后抑菌率在50%以上的病原真菌進(jìn)行培養(yǎng),研究多酚對(duì)植物病原菌可溶性蛋白含量的影響。從結(jié)果(見表2)可以看出,經(jīng)過10%的多酚處理后的病原真菌可溶性蛋白含量從高到低依次為:新月彎孢霉>葡萄座腔菌>草莓多主棒孢霉>大麗輪枝菌>假禾谷鐮刀菌>鏈格孢,其中新月彎孢霉的可溶性蛋白增量最高,處理組的可溶性蛋白質(zhì)含量約為空白對(duì)照組的5 443.00倍。經(jīng)多酚處理后,新月彎孢霉、草莓多主棒孢霉、大麗輪枝菌、葡萄座腔菌和假禾谷鐮刀菌的可溶性蛋白含量增加,而鏈格孢可溶性蛋白含量減少。

表2 多酚對(duì)植物病原真菌可溶性蛋白含量的影響

在研究茶葉中的茶多酚對(duì)細(xì)菌蛋白質(zhì)含量的過程中,發(fā)現(xiàn)茶多酚阻礙了蛋白質(zhì)的正常表達(dá),影響了酶的催化活性及其細(xì)胞結(jié)構(gòu)的組成,導(dǎo)致細(xì)菌喪失正常的生理活性[34,35]。前人研究及本文的研究均表明,多酚對(duì)多種植物病原真菌具有不同程度的抑制作用,多酚對(duì)不同病原真菌的抑制效果存在很大的差異,這可能與病原真菌本身的生物學(xué)特性有關(guān)。對(duì)植物病原真菌進(jìn)行多酚處理后,可溶性蛋白質(zhì)含量增加,可能是多酚提取物破壞了細(xì)胞膜的通透性,菌落顏色改變、菌絲形態(tài)畸形和孢子原生質(zhì)外溢的現(xiàn)象能夠支持上述假設(shè);也可能是病原真菌對(duì)化學(xué)脅迫做出的一種自我適應(yīng)和調(diào)節(jié)方式,當(dāng)這種脅迫超過植物病原真菌自身的一定極限時(shí),可能會(huì)導(dǎo)致病原真菌病變或死亡。然而鏈格孢可溶性蛋白含量減少這一現(xiàn)象的出現(xiàn),對(duì)其作用機(jī)理還未知,需進(jìn)一步研究。

3 結(jié)論

油茶葉多酚提取實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,料液比、乙醇濃度和超聲波時(shí)間對(duì)多酚的提取影響較大,應(yīng)用β-環(huán)糊精能夠提高多酚的提取率。β-環(huán)糊精輔助提取油茶葉多酚的最優(yōu)工藝條件為:料液比為1∶30、乙醇濃度60%、超聲波時(shí)間為60 min、β-環(huán)糊精添加量為0.80 g,該條件下多酚物質(zhì)的提取率為22.92%,該研究結(jié)果可為β-環(huán)糊精輔助提取油茶葉多酚提供理論基礎(chǔ)和參考。本研究表明多酚提取物能夠抑制常見植物病原真菌的生長(zhǎng)和孢子的形成與萌發(fā),改變菌絲形態(tài)和菌落顏色,以及改變病原真菌細(xì)胞膜的通透性,這為抗真菌新藥、轉(zhuǎn)基因抗病植物的研發(fā)提供了新選擇。