葉敬榕,劉 瑞,程 成,張鳳英,楊 雪*

1承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所 河北省中藥研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,承德 067000;2云南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,昆明 650021;3承德醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,承德 067000

酒精性肝病(alcoholic liver diseases,ALD)擁有著廣泛的臨床組織學(xué)譜系,既包括初期的單純肝細(xì)胞脂肪變性,還包括中、后期的酒精性肝炎、肝纖維化、酒精性肝硬化[1]。當(dāng)前對(duì)于ALD的最佳防治手段仍是戒酒,臨床用藥皮質(zhì)類固醇也只能適當(dāng)緩解部分癥狀,提供短期生存獲益,目前臨床仍無(wú)相對(duì)應(yīng)的特效藥[2]。根據(jù)ALD的病因、病機(jī)及臨床表現(xiàn),中醫(yī)將ALD分為:濕熱內(nèi)蘊(yùn)的“酒痞”前期,氣滯血瘀的“酒癖”中期和正氣虧虛的“酒臌”后期[3]。處在不同時(shí)期其治法也不盡相同,前期主要是疏肝解郁、清熱除濕,中期主要是活血化瘀,后期主要是健脾、滋補(bǔ)肝腎[4]。

黃芩(Scutellaria Radix)為唇形科植物黃芩的干燥根,隸屬于清熱類中藥,具有清熱燥濕、瀉火解毒、止血、安胎的功效,可以較好地應(yīng)用于ALD前、中期的治療。同時(shí)結(jié)合相關(guān)黃芩保肝研究可發(fā)現(xiàn),黃芩及其有效成分可通過(guò)抑制機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)、抑制炎癥因子浸潤(rùn)、減少肝細(xì)胞凋亡和調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝等對(duì)肝細(xì)胞起到保護(hù)作用、降低肝臟病理?yè)p傷程度[5]。但針對(duì)黃芩防治ALD的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)、作用途徑及機(jī)制尚未明確。本研究采用了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、分子對(duì)接技術(shù)和體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn),初步探究黃芩防治ALD的活性成分以及相應(yīng)的作用途徑,以期為黃芩及其有效成分在防治ALD方面的深入研究、新藥開發(fā)和臨床應(yīng)用提供參考[6]。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑

BRL 3A大鼠肝細(xì)胞、BRL 3A細(xì)胞專用培養(yǎng)基、胎牛血清(批號(hào)分別為:20220608、SA210518,武漢普諾賽);MEM培養(yǎng)基(批號(hào)為:8122489,Gibco有限公司);PBS緩沖液(pH7.2～7.4,0.01 mol/L)、胰蛋白酶-EDTA消化液(0.25%)、DMSO培養(yǎng)基、青鏈霉素混合液(批號(hào)分別為:20220723、20220928、710N0317、20220930,Solarbio有限公司);山姜素(CAS號(hào):36052-37-6,純度≥98%)、藥用級(jí)無(wú)水乙醇(批號(hào)分別為:G2226023、B2225811,上海阿拉丁試劑有限公司);0.9%氯化鈉溶液(批號(hào)為:2105242004,Bebolabs有限公司);CCK-8溶液(批號(hào)為:K10182833EF5E,APExBIO有限公司);乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate transaminase,AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(cerealthirdtransaminase,ALT)、總超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、細(xì)胞丙二醛(malondialdehyde,MDA)、蛋白定量(total protein,TP)等試劑盒(批號(hào)分別為:20220917、20220930、20220930、20221018、20220825、20221101,南京建成有限公司)。

1.2 黃芩治療酒精性肝病網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

1.2.1 黃芩有效成分檢索及化合物靶點(diǎn)篩選

利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP),以“黃芩”為關(guān)鍵詞檢索其含有的主要化學(xué)成分。傳統(tǒng)中藥主要采用口服形式,加以胃腸消化吸收、血液循環(huán)代謝而發(fā)揮作用。故需要對(duì)檢索獲得的化合物進(jìn)行吸收、分布、代謝和排泄(absorption,distribution,metabolism,excretion,ADME)性質(zhì)篩選。即以口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%和類藥性(drug-likeness,DL)≥0.18為標(biāo)準(zhǔn),初步篩選出具有較高活性的化合物。再將獲得的化合物分別導(dǎo)入PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)下載化合物2D Structure的SDF圖,并導(dǎo)入SwissADME數(shù)據(jù)庫(kù),以胃腸道吸收度(GI absortion)為“High”、滿足類藥性五原則預(yù)測(cè)(Lipinski,Ghose,Veber,Egan,Muegge)結(jié)果中有2個(gè)及2個(gè)以上為“Yes”再次篩選,將最終的結(jié)果導(dǎo)出并編號(hào)。

藥物主要是以所含化合物與相應(yīng)的靶點(diǎn)結(jié)合的形式來(lái)發(fā)揮藥效的,所以需要進(jìn)一步整理化合物的作用靶點(diǎn)。將篩選得到的化合物2D Structure SDF圖導(dǎo)入Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索相對(duì)應(yīng)的作用靶點(diǎn),收集靶點(diǎn)信息并進(jìn)行整理,構(gòu)建出藥物-化合物-靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)。

1.2.2 酒精性肝病相關(guān)疾病靶點(diǎn)收集

利用GeneCards、OMIM、DisGeNET、Therapeutic Target Database(TTD)和PharmGKB人類基因綜合數(shù)據(jù)庫(kù),以“alcoholic liver disease”為關(guān)鍵詞檢索相關(guān)疾病基因,收集、整理、去重后即為所需要的相關(guān)ALD作用靶點(diǎn)。

1.2.3 黃芩藥物靶點(diǎn)與酒精性肝病疾病靶點(diǎn)映射

利用在線網(wǎng)站Venny 2.1.0平臺(tái),輸入黃芩有效化合物作用靶點(diǎn)與ALD疾病靶點(diǎn),取二者的交集,即為藥物-疾病共同作用的關(guān)鍵靶基因。繪制相應(yīng)的Venn圖,導(dǎo)出交集結(jié)果。

1.2.4 構(gòu)建靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

利用String數(shù)據(jù)庫(kù),在選擇Multiple proteins后,導(dǎo)入黃芩和ALD共有的靶基因,物種選擇“Homo sapiens”,構(gòu)建蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)(PPI),將最低互相作用閾值調(diào)為“highest confidence(0.900)”,重新獲得蛋白互作信息圖,并導(dǎo)出相應(yīng)的TSV文件。利用Cytoscape 3.8.0軟件和TSV文件繪制優(yōu)化后的PPI網(wǎng)絡(luò)圖,并利用Network Analysis對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)湫再|(zhì)分析,以度值(Degree)進(jìn)行排序,篩選出關(guān)鍵核心靶點(diǎn),同時(shí)使結(jié)果可視化輸出。

1.2.5 靶點(diǎn)生物學(xué)功能分析

采用在線基因功能分析數(shù)據(jù)庫(kù)Metascape對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)中的核心靶點(diǎn)進(jìn)行京都基因與基因組百科全書(KEGG)信號(hào)通路富集分析,通過(guò)“All in One Zip File”鍵下載當(dāng)前所有文件,即可得到所涉及的主要治療ALD信號(hào)通路;同時(shí)分別對(duì)生物學(xué)過(guò)程(biological process,BP)、細(xì)胞組成(cellular component,CC)和分子功能(molecular function,MF)進(jìn)行基因本位(GO)生物過(guò)程富集分析,同樣通過(guò)“All in One Zip File”鍵下載當(dāng)前所有文件,即可得到藥物有效成分所對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)治療ALD的生物過(guò)程,兩者均以P<0.01為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。并利用在線工具微生信將結(jié)果可視化輸出。

1.2.6 構(gòu)建“有效成分-靶點(diǎn)-通路”互相作用網(wǎng)絡(luò)

選取KEGG富集獲得的前20條信號(hào)通路,利用Cytoscape 3.8.0軟件構(gòu)建“有效成分-靶點(diǎn)-通路”相互作用網(wǎng)絡(luò)。網(wǎng)絡(luò)圖中的節(jié)點(diǎn)(node)分別代表有效成分、靶點(diǎn)和通路。邊(edge)的連接代表有效成分與靶點(diǎn)、靶點(diǎn)與通路或靶點(diǎn)與有效成分之間的相互作用關(guān)系。同樣采用Cytoscape的插件Network Analysis對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)湫再|(zhì)分析,根據(jù)度值(degree)進(jìn)行排序?qū)W(wǎng)絡(luò)進(jìn)行編排,以獲得可表征成分、靶點(diǎn)與通路關(guān)系的網(wǎng)絡(luò)圖。

1.3 靶點(diǎn)蛋白與黃芩有效化學(xué)成分分子對(duì)接

根據(jù)Yang所提出的生物大分子三維結(jié)構(gòu)合理選擇六項(xiàng)原則[7],利用RSCB PBD數(shù)據(jù)庫(kù)下載“1.2.6”度值前五所對(duì)應(yīng)的受體蛋白并進(jìn)行均方根偏差(root-mean-square deviation,RMSD)驗(yàn)證。同時(shí)利用Chem3D 20.0軟件將“1.2.6”篩選得到的高于平均度值的有效成分進(jìn)行結(jié)合能最小化處理。再通過(guò)Discovery Studio 2019軟件將受體蛋白與篩選得到的黃芩活性成分進(jìn)行分子對(duì)接研究,采用Dock Ligands(Lib Dock)對(duì)接模塊進(jìn)行分子對(duì)接分析,當(dāng)配體分子與受體蛋白的結(jié)合自由能小于-4.25 kacl/mol則表示具有一定活性,小于-5.0 kacl/mol表示有較好結(jié)合活性,而小于-7.0 kacl/mol則可推測(cè)其具有強(qiáng)烈結(jié)合活性[8]。當(dāng)結(jié)合自由能為正數(shù)時(shí),表明鍵合不能自發(fā)形成[9],將最終對(duì)接結(jié)果可視化輸出。

1.4 黃芩治療酒精性肝病的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

1.4.1 BRL 3A細(xì)胞培養(yǎng)及干預(yù)

使用BRL 3A細(xì)胞專用完全培養(yǎng)基,將細(xì)胞養(yǎng)于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中,觀察細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%左右后,進(jìn)行傳代,并用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。使用CCK-8與乳酸脫氫酶試劑盒檢測(cè)不同時(shí)間下,不同濃度的無(wú)水乙醇對(duì)BRL 3A細(xì)胞的損傷程度,再給予不同濃度的山姜素(20、40、60 μg/mL)進(jìn)行干預(yù),同時(shí)分別使用生理鹽水和多烯磷脂酰膽堿(polyene phosphatidyl choline,PPC)建立空白對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組。收集干預(yù)后的細(xì)胞與上清液用于試劑盒測(cè)定。

1.4.2 相關(guān)試劑盒檢測(cè)山姜素對(duì)BRL 3A細(xì)胞增殖的影響

收集干預(yù)后的細(xì)胞與上清液后,根據(jù)谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST/GOT)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT/GPT)、總超氧化物歧化酶(SOD)、細(xì)胞丙二醛(MDA)、蛋白定量(TP)等試劑盒的說(shuō)明書進(jìn)行操作測(cè)定。

1.5 數(shù)據(jù)分析與制圖

數(shù)據(jù)結(jié)果采用SPSS 23.0軟件(IBM公司,NY,USA)單因素方差分析。圖表采用WPS office(北京金山辦公軟件股份有限公司)繪制,圖中不同的字母表示不同方式處理下的顯著性(P<0.05,n=3)。

2 結(jié)果

2.1 黃芩治療酒精性肝病網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究結(jié)果

2.1.1 黃芩有效成分收集、篩選及化合物作用靶點(diǎn)分析

利用TCMSP收集到黃芩的有效成分化合物共143個(gè),以按照OB≥ 30%、DL≥ 0.18作為條件篩選后,得到活性較高的化合物36個(gè)。將獲得的化合物再次導(dǎo)入SwissADME數(shù)據(jù)庫(kù)篩選,共獲得黃芩高活性化合物27個(gè),結(jié)果見表1。

表1 黃芩高活性的27種化合物

將黃芩有效成分2D Structure的SDF圖導(dǎo)入Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索出相對(duì)應(yīng)的作用靶點(diǎn),將收集到的靶點(diǎn)信息按Probability值從大到小排序,選取前100個(gè)且同時(shí)滿足Probability>0.1。黃芩化合物作用靶點(diǎn)信息經(jīng)過(guò)整理、去重后,結(jié)果共獲得289個(gè)有效靶點(diǎn)信息。其中黃芩有效成分HQ9(ent-Epicatechin)在Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(kù)中無(wú)法預(yù)測(cè)到相應(yīng)靶點(diǎn)。

2.1.2 酒精性肝病相關(guān)疾病靶點(diǎn)收集結(jié)果

通過(guò)以“alcoholic liver disease”為關(guān)鍵詞,在五個(gè)人類基因綜合數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索相關(guān)疾病基因靶點(diǎn)。并將收集到的基因靶點(diǎn)信息進(jìn)行篩選、去重,其結(jié)果為GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)收集到8 020條有效信息、OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)收集到200條有效信息、DisGeNET數(shù)據(jù)庫(kù)收集到195條有效信息、Therapeutic Target Database(TTD)數(shù)據(jù)庫(kù)收集到7條有效信息、PharmGKB數(shù)據(jù)庫(kù)收集到2條有效信息。將五個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)的結(jié)果匯總后去重,共獲得8 131條有效信息。

2.1.3 黃芩藥物靶點(diǎn)與酒精性肝病疾病靶點(diǎn)映射結(jié)果

將黃芩有效化合物作用靶點(diǎn)信息與ALD疾病靶點(diǎn)信息輸入在線Venny 2.1.0平臺(tái)取交集后,共獲得257個(gè)交集靶點(diǎn)(見圖1)。

圖1 黃芩有效化合物與酒精性肝病基因映射Venn圖Fig.1 Venn diagram of effective compounds of Scutellaria Radix and ALD

2.1.4 構(gòu)建靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)結(jié)果

將黃芩治療ALD的257個(gè)交集靶點(diǎn)重新繪制PPI網(wǎng)絡(luò)圖,在刪除掉八個(gè)游離蛋白節(jié)點(diǎn)后,其結(jié)果見圖2。由圖2可知,該網(wǎng)絡(luò)包含了190個(gè)節(jié)點(diǎn)、1370條邊。其中黃芩治療ALD的關(guān)鍵核心靶點(diǎn)有SRC、AKT1、PIK3R1、STAT3、PIK3CA、MAPK3等。

2.1.5 靶點(diǎn)生物學(xué)功能分析結(jié)果

在進(jìn)行KEGG信號(hào)通路富集分析后,共獲得190條相關(guān)通路。將通路按P值從小到大排序并選取前20條作可視化輸出,其結(jié)果見圖3。由圖可知,黃芩治療ALD的主要信號(hào)通路包括癌癥的途徑(pathways in cancer)、PI3K-Akt信號(hào)通路(PI3K-Akt signaling pathway)、脂質(zhì)與動(dòng)脈粥樣硬化(lipid and atherosclerosis)、化學(xué)致癌-活性氧物種(chemical carcinogenesis-reactive oxygen species)、前列腺癌(prostate cancer)等。ALD的臨床病理變化主要是:由前期的肝損傷、肝炎逐步演化為中后期的肝硬化、肝癌[10]。而通過(guò)KEGG的富集分析可以推斷黃芩治療ALD可能主要是通過(guò)減輕肝炎癥和抑制肝癌變。

圖3 黃芩治療酒精性肝病的KEGG信號(hào)通路富集分析Fig.3 Enrichment analysis of KEGG signal pathway of Scutellaria Radix in the treatment ofALD

在進(jìn)行基因本位(GO)生物過(guò)程富集分析后,BP共獲得1 884條結(jié)果、CC共獲得117條結(jié)果和MF共獲得209條結(jié)果。將各自結(jié)果按P值從小到大排序并選取前10條作可視化輸出,其結(jié)果見圖4。由圖可知,在BP中可能主要與蛋白質(zhì)磷酸化(protein phosphorylation)、細(xì)胞對(duì)氮化合物的反應(yīng)(cellular response to nitrogen compound)、轉(zhuǎn)移酶活性的正調(diào)節(jié)(positive regulation of transferase activity)有關(guān);在CC中可能主要與轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物、轉(zhuǎn)移含磷基團(tuán)(transferase complex,transferring phosphorus-containing groups)、蛋白激酶復(fù)合物(protein kinase complex)、膜筏(membrane raft)有關(guān);在MF中可能主要與磷酸轉(zhuǎn)移酶活性、乙醇組作為受體(phosphotransferase activity,alcohol group as acceptor)、蛋白激酶活性(protein kinase activity)、蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶活性(protein serine/threonine/tyrosine kinase activity)有關(guān)。

圖4 黃芩治療酒精性肝病的GO富集分析Fig.4 GO enrichment analysis of Scutellaria Radix in the treatment ofALD

2.1.6 “有效成分-靶點(diǎn)-通路”互相作用網(wǎng)絡(luò)分析

選取KEGG所富集獲得的前20條信號(hào)通路,利用Cytoscape 3.8.0軟件構(gòu)建“有效成分-靶點(diǎn)-通路”相互作用網(wǎng)絡(luò),其結(jié)果見圖5。由圖可知,本網(wǎng)絡(luò)圖中共有165個(gè)節(jié)點(diǎn)、1 117條邊,其中黃芩有效成分27個(gè)節(jié)點(diǎn)、靶點(diǎn)118個(gè)節(jié)點(diǎn)、通路20個(gè)節(jié)點(diǎn)。通過(guò)對(duì)度值排序后發(fā)現(xiàn),黃芩有效成分的平均度值為22.81,有13個(gè)有效成分的度值高于平均度值,其中黃芩治療ALD度值前5的有效成分分別為山姜素(HQ7)、降穿心蓮黃酮(HQ2)、5,7,2,5-四羥基-8,6-二甲氧基黃酮(HQ23)、黃芩素(HQ24)、去甲漢黃芩素(HQ16);靶點(diǎn)的平均度值為9.47,有49個(gè)靶點(diǎn)的度值高于平均度值,其中靶點(diǎn)度值前5的有CDK1、EGFR、PIK3R1、CYP1B1、ESR2;通路的平均度值為25.05,有5個(gè)通路的度值高于平均度值,度值前5的通路即為圖3中基因占比靠前的五條。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果再次驗(yàn)證了黃芩治療ALD呈現(xiàn)出中藥治療所特有的多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的特點(diǎn)。

圖5 黃芩治療酒精性肝病的“有效成分-靶點(diǎn)-通路”互作網(wǎng)絡(luò)圖Fig.5 "Effective component-target-pathway" interaction network diagram of Scutellaria Radix in the treatment of ALD注:黃色圓形為通路,橙色正六邊形為有效成分,綠色菱形為靶點(diǎn)。Note:The yellow circle is the pathway;The orange regular hexagon is the active ingredient;The green diamond is the target.

2.2 靶點(diǎn)蛋白與黃芩有效化學(xué)成分分子對(duì)接結(jié)果

為了更加全面探究黃芩有效成分是如何對(duì)ALD前20條通路關(guān)鍵靶點(diǎn)起到影響的,將篩選過(guò)后的13個(gè)高于有效成分平均度值的有效成分與度值前5的靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接。5個(gè)靶蛋白原始晶體結(jié)構(gòu)的配體構(gòu)象與對(duì)接后的配體構(gòu)象出現(xiàn)疊合,且對(duì)接后5個(gè)復(fù)合物的最小RMSD值分別為:0.050 4、0.090 9、0.078 7、0.129 9、0.028 0 nm,說(shuō)明對(duì)接方法和參數(shù)設(shè)置合理可行。本次對(duì)接中,結(jié)合自由能小于-4.25 kacl/mol有26個(gè),小于-5.0 kacl/mol有24個(gè),小于-7.0 kacl/mol有21個(gè),其具體結(jié)果見圖6。

圖6 黃芩治療酒精性肝病分子對(duì)接結(jié)合自由能熱圖Fig.6 Molecular docking binding free energy thermogram of Scutellaria Radix in the treatment of ALD注:圖中水平方向代表靶點(diǎn),垂直方向代表成分編號(hào)(具體成分信息見表1),兩者交匯處顏色越深代表結(jié)合能越小。Note:The horizontal direction in the figure represents the target point,and the vertical direction represents the composition number (specific ingredient information is shown in Table 1).The darker the color of the intersection of the two,the smaller the binding energy.

通過(guò)進(jìn)一步對(duì)比熱圖結(jié)果可以發(fā)現(xiàn),HQ7與PIK3R1對(duì)接最強(qiáng),其結(jié)合自由能為-23.769 5 kacl/mol,主要依賴π-烷基作用與π-陽(yáng)離子作用進(jìn)行結(jié)合;HQ2與EGFR對(duì)接次之,其結(jié)合自由能為-21.287 4 kacl/mol,主要依賴氫鍵互相作用與π-π共軛作用進(jìn)行結(jié)合;HQ7與EGFR對(duì)接排第三,其結(jié)合自由能為-21.233 1 kacl/mol,其主要依賴氫鍵互相作用與π-孤對(duì)作用進(jìn)行結(jié)合,各對(duì)接結(jié)果見圖7。

圖7 黃芩治療酒精性肝病分子對(duì)接2D圖Fig.7 2Ddiagram of molecular docking of Scutellaria Radix in treating ALD注:A:HQ7-PIK3R1;B:HQ2-EGFR;C:HQ7-EGFR。

2.3 山姜素治療酒精性肝病的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果

通過(guò)對(duì)酒精性肝損傷的大鼠肝細(xì)胞給予不同濃度的山姜素治療后,再利用CCK-8溶液與乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒測(cè)定其存活率與乳酸脫氫酶釋放量。由圖8A、8B可知,低、中、高濃度的山姜素均可以對(duì)肝損傷細(xì)胞起到治療效果,其細(xì)胞存活率較模型組分別提高15.71%、19.72%、22.59%,同時(shí)隨著山姜素給藥濃度的提高乳酸脫氫酶釋放量出現(xiàn)顯著降低(P<0.05)。

圖8 山姜素治療酒精性肝病的細(xì)胞生化指標(biāo)結(jié)果(ˉx ± s,n = 3)Fig.8 Results of cell biochemical indexes ofalpinetin in the treatment of ALD(ˉx ± s,n = 3)注:Con:空白對(duì)照組;Mod:模型組;PPC:多烯磷脂酰膽堿組(陽(yáng)性對(duì)照);HQ7-L:山姜素低劑量組(20 μg/mL);HQ7-M:山姜素中劑量組(40 μg/mL);HQ7-H:山姜素高劑量組(60 μg/mL)。不同的字母表示不同方式處理下的差異有顯著性(P<0.05)。Note:Con:Control group;Mod:Model group;PPC:Polyene phosphatidyl choline group (positive control);HQ7-L:Low dose group of alpinetin (20 μg/mL);HQ7-M:Medium dose group of alpinetin (40 μg/mL);HQ7-H:high dose group of alpinetin (60 μg/mL).Different letters indicate significance under different treatment methods (P<0.05).

由圖8C、8D可知,在給予山姜素后,肝損傷細(xì)胞的ALT、AST指標(biāo)均呈現(xiàn)改善趨勢(shì),且可以恢復(fù)到與正常細(xì)胞狀態(tài)一致(P>0.05)。山姜素所起到的治療效果受給藥劑量的影響不大,對(duì)比低、中、高劑量組其治療效果顯著性不高(P>0.05),提示低劑量的山姜素亦可以帶來(lái)較好的治療效果。

由圖8E、8F可知,山姜素可以有效提高已損傷細(xì)胞的SOD酶活力(P<0.05),從而積極改善細(xì)胞的過(guò)氧化狀態(tài),抑制肝炎癥的發(fā)生。對(duì)比MDA的結(jié)果可以發(fā)現(xiàn),山姜素可以隨著給藥劑量的增加而逐步降低MDA的含量(P<0.05)?？傮w而言,陽(yáng)性藥物對(duì)細(xì)胞MAD的改善作用優(yōu)于山姜素。

3 討論與結(jié)論

在我國(guó)乙型肝炎、丙型肝炎的防治持續(xù)取得良好效果的基礎(chǔ)上,再加之經(jīng)濟(jì)蒸騰發(fā)展以及酒文化的廣泛普及,由ALD所導(dǎo)致的肝硬化、肝細(xì)胞癌甚至患者死亡的病例占比將持續(xù)升高[11]。祖國(guó)醫(yī)學(xué)體系中并無(wú)“酒精性肝病”的術(shù)語(yǔ)概念,但根據(jù)該病的臨床表現(xiàn)、病因病機(jī)等進(jìn)行劃分,可與“酒病”“傷酒”“酒癖”“酒疸”等相對(duì)應(yīng)。其治法主要囊括了:健脾益胃法、疏肝利膽法、清熱利濕祛濁法等[12]。而中藥黃芩正是隸屬于清熱燥濕類藥物,目前黃芩主要是被應(yīng)用在ALD的前、中期[13],但黃芩防治ALD的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)、作用途徑及機(jī)制尚未明確,故存在著一定的研究?jī)r(jià)值。

通過(guò)對(duì)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)的應(yīng)用,可以得知在蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵核心靶點(diǎn)有SRC、AKT1、PIK3R1,這三種蛋白酶在幾乎所有類型的癌癥中都可能通過(guò)上游信號(hào)分子的激活或通路組件的突變而被結(jié)構(gòu)性地激活[14-16]。而其中SRC作為首個(gè)被發(fā)現(xiàn)的具有致癌性的基因,參與著眾多信號(hào)通路下游靶蛋白的磷酸化[17]。對(duì)細(xì)胞生存、粘附、增殖、運(yùn)動(dòng)和血管生成均具有不同途徑的調(diào)節(jié)。此外,SRC的構(gòu)成性活動(dòng)也可促進(jìn)和維持炎癥、細(xì)胞代謝的重新編程,從而與腫瘤微環(huán)境的發(fā)展同步,積極維持腫瘤的生長(zhǎng)[18]。AKT1作為PI3K/ AKT信號(hào)通路的中心成員,可被PIK3R1編碼磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)調(diào)節(jié)亞基α(p85-ALPHA)激活[19],結(jié)合本研究中的蛋白互作PPI圖可以再次證實(shí)兩者存在著密切的上、下游關(guān)系。

在KEGG富集獲得的前20條信號(hào)通路中,多數(shù)也歸屬于“癌變通路”,提示黃芩治療ALD主要是通過(guò)預(yù)防或抑制肝細(xì)胞癌變。EGFR作為ErbB家族的一種典型的酪氨酸激酶受體,在肝臟中高度表達(dá)。在飲入酒精后,EGFR可在血管緊張素II與其受體AT1R結(jié)合的條件下激活,同時(shí)EGFR可作為Ras-Raf-1-MAP2K/MEK-MAPK/ERK細(xì)胞信號(hào)通路的樞紐,刺激PIK3R1蛋白的表達(dá)異常,進(jìn)而影響PI3K/AKT信號(hào)通路[20,21]。PI3K/AKT信號(hào)通路與眾多炎癥疾病密切相關(guān),被認(rèn)為是腫瘤的關(guān)鍵信號(hào)通路之一。已有研究證實(shí),黃芩可以通過(guò)上調(diào)IRS1、PI3K、Akt2和Glut2的mRNA表達(dá),促進(jìn)p-PI3K、p-Akt和Glut2的磷酸化,從而克服PI3K/Akt胰島素信號(hào)通路的損傷,積極改善肝炎癥[22]。對(duì)比ALD的致病因素可以發(fā)現(xiàn),其與心血管疾病(cardiovascular disease,CVD)同樣都包括:炎癥、脂肪因子、腸道菌群失調(diào)、氧化應(yīng)激及心理應(yīng)激等[23]。亦有研究表明ALD與CVD之間存在著直接的聯(lián)系,提出了肝-心軸相關(guān)概念,再結(jié)合本研究篩選獲得的脂質(zhì)與動(dòng)脈粥樣硬化信號(hào)通路,提示對(duì)于ALD的治療除關(guān)注肝臟自身病變外,同時(shí)還需考慮心血管對(duì)其的影響[24]。

對(duì)比分子對(duì)接中的結(jié)合能大小可以發(fā)現(xiàn),山姜素可作為黃芩治療ALD的關(guān)鍵有效成分之一。山姜素廣泛存在于姜科植物中,相關(guān)藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)其具有抗癌、抗氧化、抗炎、修復(fù)血管內(nèi)皮等作用[25-27]。人體主要是依賴微粒體CYP2E1進(jìn)行酒精代謝的,在代謝過(guò)程中會(huì)大量產(chǎn)生如乙醛、活性氧(reactive oxygen species,ROS)等中間產(chǎn)物。一方面,乙醛可與蛋白及DNA形成加合物,直接發(fā)揮致癌毒性。另一方面,由于ROS的積聚也會(huì)引起DNA結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變,導(dǎo)致細(xì)胞周期紊亂,影響基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯等功能,從而啟動(dòng)或促進(jìn)細(xì)胞癌變[28]。而研究表明山姜素可以作為信號(hào)分子,激活相關(guān)通路,在清除ROS的同時(shí)有效抑制細(xì)胞癌變[29]。結(jié)合體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)可以發(fā)現(xiàn),在給予不同濃度的山姜素后,可以有效減輕肝細(xì)胞的酒精性損傷,相關(guān)的生化學(xué)指標(biāo)ALT、AST也得到顯著改善。再結(jié)合MAD、SOD的結(jié)果,提示山姜素可能可以通過(guò)提高SOD酶的酶活性來(lái)抑制肝臟的氧化應(yīng)激反應(yīng)而發(fā)揮作用的,但其抗氧化效果或許遠(yuǎn)不如其抑癌效果,還需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。

綜上所述,本實(shí)驗(yàn)通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)初步預(yù)測(cè)出黃芩的27個(gè)有效成分,表明單味中藥亦可以視作一種小型復(fù)方。同時(shí)黃芩27個(gè)有效成分可以通過(guò)257個(gè)基因靶點(diǎn)對(duì)ALD起到治療作用,其中關(guān)鍵核心靶點(diǎn)有SRC、AKT1、PIK3R1等。KEGG信號(hào)通路富集分析結(jié)果提示,黃芩可以通過(guò)影響癌癥的途徑、PI3K-Akt信號(hào)通路、脂質(zhì)與動(dòng)脈粥樣硬化等信號(hào)通路對(duì)ALD起到作用。通過(guò)分子對(duì)接技術(shù),在驗(yàn)證網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果的同時(shí),篩選出黃芩治療ALD的最佳有效成分為山姜素。通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn),可以發(fā)現(xiàn)山姜素的確能夠顯著改善大鼠肝細(xì)胞BRL 3A的酒精性損傷狀態(tài)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以為黃芩治療ALD提供部分理論基礎(chǔ),但想要進(jìn)一步挖掘黃芩治療ALD的具體作用原理仍需要進(jìn)行大量的藥理機(jī)制實(shí)驗(yàn)。