李振雨,何民友,劉曉霞,曲麗媛,周湘媛,黃彩瑩,陳向東,孫冬梅

1廣東一方制藥有限公司;2廣東省中藥配方顆粒企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,佛山 528244

布渣葉為嶺南特色藥材,主要化學(xué)成分為黃酮、生物堿、萜類、有機(jī)酸等,具有促進(jìn)胃腸蠕動(dòng)和胃液分泌,降血脂,退黃,抗炎、鎮(zhèn)痛、保護(hù)心血管,抗衰老等作用,為藥食兩用中藥,最近幾年對(duì)布渣葉的重視程度增加,研究也越來越多[1]。

傳統(tǒng)中藥以湯劑為主要用藥形式,湯劑為中藥發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ),并經(jīng)過上千年的臨床實(shí)踐,因此,建立中藥標(biāo)準(zhǔn)湯劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),能夠?yàn)橹兴幣浞筋w粒等現(xiàn)代中藥制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供重要參考[2]。目前,關(guān)于布渣葉標(biāo)準(zhǔn)湯劑的研究報(bào)道尚未見到,我司在進(jìn)行布渣葉配方顆粒國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)研究中,按照《中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)制定技術(shù)要求》(以下簡(jiǎn)稱技術(shù)要求),對(duì)標(biāo)準(zhǔn)湯劑的關(guān)鍵質(zhì)量指標(biāo):出膏率、浸出物、指標(biāo)性成分含量及轉(zhuǎn)移率、指紋圖譜進(jìn)行研究,考察布渣葉飲片到標(biāo)準(zhǔn)湯劑的量值傳遞規(guī)律,為布渣葉配方顆粒及其相關(guān)制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供參考。

1 儀器、試劑與試藥

1.1 儀器

Thermo超高效液相色譜儀(Vanquish,賽默飛世爾科技有限公司);Thermo Vanquish Flex超高效液相-Thermo Fisher QE高分辨質(zhì)譜聯(lián)用儀(賽默飛世爾科技有限公司);Agilent ZORBAX SB C18(2.1 mm×150 mm,1.8 μm)色譜柱,Waters Cortecs T3(2.1 mm×100 mm,1.6 μm)色譜柱;百萬分之一天平(XP26,梅特勒-托利多公司)。

1.2 試劑

分析級(jí)甲醇和乙酸乙酯購(gòu)自西隴科學(xué)股份有限公司;色譜級(jí)甲醇購(gòu)自默克股份有限公司;色譜級(jí)甲酸和乙酸購(gòu)自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.3 試藥

牡荊苷(批號(hào):111687-201704,含量:94.9%)、水仙苷(批號(hào):111997-201501,含量:93.1%)、山柰酚-3-O-蕓香糖苷(批號(hào):112007-201602,含量:90.8%)、咖啡酸(批號(hào):110885-201703,含量:99.7%)、阿魏酸(批號(hào):110773-201614,含量:99.0%)和椴樹苷(批號(hào):112000-201802,供鑒別用)對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)食品藥品鑒定研究院;異牡荊苷(批號(hào):ST09650120MG,含量:98.0%,上海詩丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司);對(duì)羥基肉桂酸(批號(hào):JOT-10995,純度:98.0%,四川普菲德生物技術(shù)有限公司);紫云英苷(批號(hào):B21704,純度:98.6%);異鼠李素-3-O-葡萄糖苷(批號(hào):B21556,純度:99.6%)均購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司。15批布渣葉藥材經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院黃海波教授鑒定均為椴樹科植物破布葉MicrocospaniculataL.的干燥葉。取15批布渣葉藥材,去除雜質(zhì),制成布渣葉飲片,按照《技術(shù)要求》制備15批布渣葉標(biāo)準(zhǔn)湯劑,其產(chǎn)地信息見表1所示。

表1 15批布渣葉產(chǎn)地信息表

2 方法與結(jié)果

2.1 布渣葉標(biāo)準(zhǔn)湯劑的制備

取布渣葉飲片100 g,加水煎煮兩次,第一次煎煮加水14倍量,浸泡30 min,武火加熱煮沸后文火保持微沸30 min,趁熱過濾,濾液迅速用冷水冷卻;第二次煎煮加水12倍量,武火加熱煮沸后文火保持微沸25 min,趁熱過濾,濾液迅速用冷水冷卻,合并兩次煎液,減壓濃縮,冷凍干燥,得布渣葉標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉。

2.2 出膏率和浸出物測(cè)定

出膏率以標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉量計(jì),計(jì)算公式為:出膏率=(標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉總量/制備標(biāo)準(zhǔn)湯劑的飲片重量)×100%。浸出物的測(cè)定方法為:取本品2 g,精密稱定,精密加入乙醇100 mL,照醇溶性浸出物(中國(guó)藥典2020年版通則2201)項(xiàng)下的熱浸法測(cè)定,結(jié)果見表2所示。15批布渣葉標(biāo)準(zhǔn)湯劑出膏率范圍在9.32%～14.22%,浸出物范圍在37.61%～62.52%,出膏率和浸出物數(shù)據(jù)均在均值的70%～130%或均值±3倍標(biāo)準(zhǔn)差(SD)范圍內(nèi),符合《技術(shù)要求》的規(guī)定。

表2 15批布渣葉標(biāo)準(zhǔn)湯劑出膏率和浸出物測(cè)定結(jié)果

2.3 指紋圖譜的建立

2.3.1 色譜條件

采用Agilent ZORBAX SB C18(2.1 mm×150 mm,1.8 μm)色譜柱;以甲醇為流動(dòng)相A,0.1%乙酸溶液為流動(dòng)相B,梯度洗脫(0～33 min,9%→17%A;33～37 min,17%→25%A;37～45 min,25%→28%A;45～60 min,28%→80%A);流速為每分鐘0.30 mL;柱溫為30 ℃;檢測(cè)波長(zhǎng)為315 nm;進(jìn)樣量為2 μL。

2.3.2 對(duì)照品溶液的制備

取咖啡酸、對(duì)羥基肉桂酸、阿魏酸、牡荊苷、異牡荊苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、紫云英苷、水仙苷、異鼠李素-3-O-葡萄糖苷和椴樹苷對(duì)照品適量,精密稱定,加甲醇制成每1 mL含咖啡酸、阿魏酸、牡荊苷、異牡荊苷各15 μg、含山柰酚-3-O-蕓香糖苷、水仙苷、椴樹苷各40 μg、含對(duì)羥基肉桂酸、紫云英苷和異鼠李素-3-O-葡萄糖苷各50 μg的混合溶液。

2.3.3 供試品溶液的制備

2.3.3.1 布渣葉飲片供試品溶液的制備

取本品粉末(過三號(hào)篩)約0.5 g,置具塞錐形瓶中,加50%甲醇25 mL,加熱回流30 min,冷卻,離心,取上清液蒸干,殘?jiān)?5mL水使溶解,用乙酸乙酯萃取3次,每次25 mL,合并乙酸乙酯液,蒸干,殘?jiān)?0%甲醇溶解,并定容到10 mL量瓶,濾過,取續(xù)濾液,即得。

2.3.3.2 布渣葉標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶液的制備

取本品適量,研細(xì),取約0.1 g,置具塞錐形瓶中,加甲醇25 mL,超聲處理(功率250 W,頻率40 kHz)45 min,離心,取上清液蒸干,殘?jiān)?5 mL水使溶解,用乙酸乙酯萃取3次,每次25 mL,合并乙酸乙酯液,蒸干,殘?jiān)眉状既芙?定容到10 mL量瓶,過濾,取續(xù)濾液,即得。

2.3.4 指紋圖譜方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.4.1 精密度試驗(yàn)

取布渣葉標(biāo)準(zhǔn)湯劑(編號(hào):TJ2)供試品溶液,按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次,以5號(hào)峰牡荊苷為參照峰S,計(jì)算其余共有峰與S峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD值在0.04%～1.53%范圍內(nèi),相對(duì)峰面積RSD值在0.34%～2.41%范圍內(nèi),表明儀器精密度良好。

2.3.4.2 重復(fù)性試驗(yàn)

取布渣葉標(biāo)準(zhǔn)湯劑(編號(hào):TJ2)約0.1 g,平行6份,精密稱定,按“2.3.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液6份,采用“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析,以5號(hào)峰牡荊苷為參照峰S,計(jì)算其余共有峰與S峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD值在0.05%～0.52% 范圍內(nèi),相對(duì)峰面積RSD值在 1.14%～2.84%范圍內(nèi),表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.3.4.2重復(fù)性試驗(yàn)”項(xiàng)下供試品溶液,采用“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件,分別在0、2、4、6、8、12、24 h進(jìn)樣分析,以5號(hào)峰牡荊苷為參照峰S,計(jì)算其余共有峰與S峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD值在0.03%～0.47% 范圍內(nèi),相對(duì)峰面積RSD值在0.63%～2.94%范圍內(nèi),表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.5 指紋圖譜的建立

采用“2.3”項(xiàng)下指紋圖譜方法,對(duì)15批布渣葉飲片和標(biāo)準(zhǔn)湯劑樣品進(jìn)行指紋圖譜測(cè)定,采用賽默飛Chromleteon 7軟件將各批次樣品指紋圖譜以CDF格式導(dǎo)出,并導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012.130723)》,分別以YP1和TJ1樣品指紋圖譜為參照?qǐng)D譜,對(duì)15批布渣葉飲片和標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜進(jìn)行多點(diǎn)校正和峰匹配,并生成布渣葉飲片和標(biāo)準(zhǔn)湯劑對(duì)照指紋圖譜,結(jié)果見圖1～3所示。結(jié)果顯示,15批布渣葉飲片和標(biāo)準(zhǔn)湯劑均標(biāo)識(shí)出12個(gè)保留時(shí)間相一致的共有指紋峰,表明從布渣葉飲片到標(biāo)準(zhǔn)湯劑,各指紋峰所代表的化學(xué)成分均能進(jìn)行有效的轉(zhuǎn)移。

圖1 15批布渣葉飲片指紋圖譜Fig.1 Fingerprints of 15 batches of Microctis Folium decoction pieces

圖2 15批布渣葉標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜Fig.2 Fingerprints of 15 batches of Microctis Folium standard decoction

圖3 布渣葉飲片和標(biāo)準(zhǔn)湯劑對(duì)照指紋圖譜Fig.3 Reference fingerprints of Microctis Folium decoction pieces and standard decoction注:R1:標(biāo)準(zhǔn)湯劑對(duì)照指紋圖譜,R2:飲片對(duì)照指紋圖譜。Note:R1:Reference fingerprint of standard decoction;R2:Reference fingerprint of decoction pieces.

2.3.6 相似度計(jì)算

分別計(jì)算15批布渣葉飲片和標(biāo)準(zhǔn)湯劑樣品指紋圖譜與其對(duì)照指紋圖譜的相似度,結(jié)果見表3所示,15批布渣葉飲片指紋圖譜的相似度在0.957～0.995,15批布渣葉標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜的相似度在0.960～0.995,飲片和標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜整體相似度較高,表明指紋圖譜可作為共性特征,用于布渣葉飲片和標(biāo)準(zhǔn)湯劑的質(zhì)量控制。

表3 相似度計(jì)算結(jié)果

2.3.7 共有峰的指認(rèn)

取布渣葉標(biāo)準(zhǔn)湯劑(編號(hào):TJ2)供試品溶液,采用液相色譜-高分辨質(zhì)譜對(duì)共有峰進(jìn)行指認(rèn),色譜條件均同“2.3.1”項(xiàng)下;質(zhì)譜采用HESI離子源,離子源參數(shù)為:鞘氣流速35 Arb;輔助氣流速10 arb;噴霧電壓3.2 kV;S-lens電壓50 V;輔助器加熱溫度350 ℃;毛細(xì)管加熱溫度350 ℃。質(zhì)譜掃描參數(shù)為:正、負(fù)離子掃描模式(dd-MS2Discover);掃描范圍為100～1 500m/z;一級(jí)掃描分辨率為70 000 FWHM;二級(jí)掃描分辨率為17 500 FWHM;二級(jí)碰撞能量為40 eV。分別采集供試品溶液在正、負(fù)離子模式下總離子流圖(total ion chromatogram,TIC)及紫外吸收色譜圖(見圖4)。

圖4 布渣葉標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜共有峰的指認(rèn)Fig.4 Identification of common peaks in fingerprint of Microctis Foliumstandard decoction注:A:負(fù)離子模式下TIC;B:正離子模式下TIC;C:UV 315nm下色譜圖。Note:A:TIC in negative ion mode;B:TIC in positive ion mode;C:Chromatogram at UV 315 nm.

通過化合物的精確分子量及二級(jí)質(zhì)譜信息,結(jié)合本地質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫資料及相關(guān)參考文獻(xiàn),推測(cè)峰1為咖啡酸,峰2為對(duì)羥基肉桂酸,峰4為阿魏酸,峰5為牡荊苷,峰6為異牡荊苷,峰7為山柰酚-3-O-蕓香糖苷,峰8為紫云英苷,峰9為水仙苷,峰10為異鼠李素-3-O-葡萄糖苷,峰11為椴樹苷。具體化合物信息見表4 所示。

表4 布渣葉標(biāo)準(zhǔn)湯劑化學(xué)成分質(zhì)譜鑒定結(jié)果

2.3.8 共有峰的對(duì)照品確證

取布渣葉標(biāo)準(zhǔn)湯劑(編號(hào):TJ3)供試品溶液和“2.3.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液,按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定,采用保留時(shí)間比對(duì)結(jié)合紫外-可見光3D光譜分析,進(jìn)一步確證峰1為咖啡酸,峰2為對(duì)羥基肉桂酸,峰4為阿魏酸,峰5為牡荊苷,峰6為異牡荊苷,峰7為山柰酚-3-O-蕓香糖苷,峰8為紫云英苷,峰9為水仙苷,峰10為異鼠李素-3-O-葡萄糖苷,峰11為椴樹苷,結(jié)果見圖5所示。

圖5 共有峰的對(duì)照品確證Fig.5 Identification of reference substances for common peaks注:A:混合對(duì)照品,B:供試品。1:咖啡酸;2:對(duì)羥基肉桂酸;4:阿魏酸;5:牡荊苷;6:異牡荊苷;7:山柰酚-3-O-蕓香糖苷;8:紫云英苷;9:水仙苷;10:異鼠李素-3-O-葡萄糖苷;11:椴樹苷。Note:A:Mixed reference;B:Sample.1:Caffeic acid;2:4-Hydroxycinnamic acid;4:Ferulic acid;5:Vitexin;6:Isovitexin;7:Kaempferol-3-O-rutinoside;8:Astragalin;9:Narcissin;10:Isorhamnetin-3-O-glucoside;11:Tiliroside.

2.3.9 化學(xué)計(jì)量學(xué)分析

以5號(hào)峰牡荊苷為參照峰S,分別計(jì)算峰1～4、峰6～12與S峰的相對(duì)峰面積,并以相對(duì)峰面積為變量采用Simca14.1軟件進(jìn)行正交偏最小二乘法-判別式分析(OPLS-DA),建立OPLS-DA模型,模型經(jīng)過200次置換檢驗(yàn),R2和Q2值右邊均大于左邊(見圖6),證實(shí)模型有效。采用Simca14.1軟件自動(dòng)生成OPLS-DA得分圖(見圖7),15批布渣葉飲片和標(biāo)準(zhǔn)湯劑各自歸為一類,且樣品集中度較高。以VIP>1.0作為變量差異性篩選標(biāo)準(zhǔn),15批布渣葉飲片和標(biāo)準(zhǔn)湯劑共篩選出5個(gè)差異標(biāo)志物(見圖8),以VIP大小排序,分別為峰4>峰6>峰2>峰3>峰1。分別計(jì)算15批布渣葉飲片和標(biāo)準(zhǔn)湯劑中峰1、2、3、4、6與S峰的相對(duì)峰面積,并計(jì)算15批樣品的相對(duì)峰面積均值(見表5)。結(jié)果顯示,從飲片到標(biāo)準(zhǔn)湯劑峰1、2、3、4的相對(duì)峰面積明顯增加,而峰6的相對(duì)峰面積則明顯下降。

圖6 OPLS-DA模型置換檢驗(yàn)Fig.6 OPLS-DA model replacement test

圖7 OPLS-DA得分圖Fig.7 OPLS-DA score plot

圖8 VIP得分圖Fig.8 VIP score plot

表5 峰1、2、3、4、6與S峰的相對(duì)峰面積均值

2.4 牡荊苷、異牡荊苷和水仙苷的含量測(cè)定

2.4.1 色譜條件

采用Waters Cortecs T3(2.1 mm×100 mm,1.6 μm)色譜柱;以甲醇為流動(dòng)相A,0.1%甲酸溶液為流動(dòng)相B;梯度洗脫(0～6 min,20%→25%A;6～24 min,25%→32%A;24～32 min,32%→40%A;32～35 min,40%→44%A);流速為每分鐘0.35 mL;柱溫為30 ℃;檢測(cè)波長(zhǎng)為339 nm,進(jìn)樣量為1 μL。

2.4.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取牡荊苷對(duì)照品2.913 mg、異牡荊苷對(duì)照品5.197 mg、水仙苷對(duì)照品16.773 mg,加70%甲醇制成每1 mL含牡荊苷13.822 μg、異牡荊苷25.465 μg、水仙苷78.078 μg的混合溶液,搖勻,即得。

2.4.3 供試品溶液的制備

2.4.3.1 布渣葉飲片供試品溶液的制備

取本品粉末(過三號(hào)篩)約2.5 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入70%甲醇50 mL,稱定重量,超聲處理(250 W,頻率40 kHz)1 h,取出,放冷,再稱定重量,用70%甲醇補(bǔ)足減失的重量,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,即得。

2.4.3.2 布渣葉標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶液的制備

取布渣葉標(biāo)準(zhǔn)湯劑適量,研細(xì),取約0.1 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入70%甲醇25 mL,稱定重量,超聲處理(功率250 W,頻率40 kHz)30 min,取出,放冷,再稱定重量,用70%甲醇補(bǔ)足減失的重量,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,即得。

2.4.4 方法學(xué)驗(yàn)證

2.4.4.1 精密度考察

精密吸取“2.4.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液,按照“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次,計(jì)算牡荊苷、異牡荊苷和水仙苷的色譜峰面積RSD分別為0.27%、0.57%和0.62%,表明儀器精密度良好。

2.4.4.2 重復(fù)性考察

取布渣葉標(biāo)準(zhǔn)湯劑(編號(hào):TJ2)約0.1 g,平行6份,精密稱定,按“2.4.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液6份,按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定,計(jì)算供試品溶液中牡荊苷、異牡荊苷和水仙苷的含量均值為2.761、3.290和13.920 mg/g,RSD值分別為1.83%、0.97%和0.92%,表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.4.3 線性關(guān)系考察

精密稱取牡荊苷對(duì)照品2.913 mg、異牡荊苷對(duì)照品5.197 mg、水仙苷對(duì)照品16.773 mg,置10 mL量瓶中,加70%甲醇制成每1 mL含牡荊苷276.444 μg、含異牡荊苷509.306 μg、含水仙苷1 561.566 μg的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密量取上述混合對(duì)照品儲(chǔ)備液0.5 mL,置2、5、10、25、50 mL量瓶中,分別加70%甲醇至刻度,搖勻,制成系列濃度對(duì)照品應(yīng)用液,取上述對(duì)照品儲(chǔ)備液和應(yīng)用液,按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件依次進(jìn)樣分析,記錄色譜峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)(Y),對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)(X),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,結(jié)果見表6所示。結(jié)果顯示,3種成分的線性回歸方程相關(guān)系數(shù)r均大于0.999 5,表明各成分在規(guī)定的對(duì)照品濃度范圍內(nèi),峰面積與對(duì)照品濃度線性關(guān)系良好。

2.4.4.4 加樣回收率試驗(yàn)

取牡荊苷對(duì)照品2.794 mg、異牡荊苷對(duì)照品3.627 mg、水仙苷對(duì)照品15.224 mg,置20 mL量瓶中,加甲醇制成1 mL含牡荊苷132.575 μg、異牡荊苷177.723 μg、水仙苷708.677 μg的對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密吸取上述對(duì)照品儲(chǔ)液0.5、1.0、1.5 mL,平行3組,每組3份,分別置9個(gè)錐形瓶中揮干溶劑,精密加入含量已知的布渣葉標(biāo)準(zhǔn)湯劑(編號(hào):TJ2)約0.05 g,按“2.4.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液9份,按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定,計(jì)算牡荊苷、異牡荊苷、水仙苷的加樣回收率和RSD值,結(jié)果見表7所示。各成分的加樣回收率RSD值均小于4.0%,表明該方法準(zhǔn)確度良好。

表7 各成分加樣回收率測(cè)定結(jié)果

2.4.4.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取“2.3.4.2重復(fù)性試驗(yàn)”項(xiàng)下供試品溶液,按照“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件,分別在0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣分析,測(cè)定供試品溶液中牡荊苷、異牡荊苷、水仙苷的峰面積,并計(jì)算峰面積RSD值分別為2.10%、0.46%和0.64%,表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.5 樣品含量測(cè)定及轉(zhuǎn)移率計(jì)算

采用“2.4.3”項(xiàng)下供試品溶液制備方法和“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件,分別對(duì)15批布渣葉飲片和標(biāo)準(zhǔn)湯劑中牡荊苷、異牡荊苷和水仙苷的含量進(jìn)行測(cè)定,并計(jì)算轉(zhuǎn)移率,結(jié)果見表8所示。15批布渣葉標(biāo)準(zhǔn)湯劑牡荊苷的含量范圍為1.63～4.68 mg/g,異牡荊苷的含量范圍為2.16～4.25 mg/g,水仙苷的含量范圍為7.86～14.18 mg/g,3種有效成分的含量均在均值±3倍標(biāo)準(zhǔn)差(SD)范圍內(nèi);牡荊苷的轉(zhuǎn)移率范圍為41.37%～68.13%,異牡荊苷的轉(zhuǎn)移率范圍為31.05%～53.10%,水仙苷的轉(zhuǎn)移率范圍為33.11%～59.20%,3種有效成分的轉(zhuǎn)移率均在均值±3倍標(biāo)準(zhǔn)差(SD)的范圍內(nèi),均符合《技術(shù)要求》的規(guī)定。

表8 15批布渣葉標(biāo)準(zhǔn)湯劑含量及轉(zhuǎn)移率測(cè)定結(jié)果

3 討論與結(jié)論

布渣葉質(zhì)地較輕,但化學(xué)成分復(fù)雜,飲片煎煮過程中大量成分溢出,導(dǎo)致標(biāo)準(zhǔn)湯劑雜質(zhì)較多,影響有效成分的色譜分離與分析,采用甲醇、乙醇等極性較大的溶劑對(duì)標(biāo)準(zhǔn)湯劑進(jìn)行處理時(shí),指紋圖譜基線不平穩(wěn)、色譜峰分離度較差,色譜峰雜亂,小峰較多。因此,在標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品前處理方法中,考察了乙酸乙酯萃取的分離純化富集方式,減少雜質(zhì)的干擾,并與常規(guī)處理方式進(jìn)行對(duì)比,結(jié)果顯示,采用乙酸乙酯為萃取溶劑,能夠顯著改善雜質(zhì)峰的影響,保證主要色譜峰的純度、分離度,解決色譜圖基線不平穩(wěn),部分色譜峰吸收小的問題。在色譜條件的考察中,分別考察不同的流動(dòng)相洗脫系統(tǒng),如乙腈-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.1%乙酸溶液、甲醇-0.1%甲酸溶液、甲醇-0.1%乙酸溶液等,結(jié)果顯示,采用甲醇-0.1%乙酸溶液為洗脫系統(tǒng),色譜峰的個(gè)數(shù)多且整體分離度較好?？紤]到超高效液相色譜指紋圖譜的建立,色譜柱的選擇是關(guān)鍵,因此,本實(shí)驗(yàn)考察了不同粒徑和品牌的色譜柱,最終選擇Agilent ZORBAX SB C18色譜柱(2.1 mm×150 mm,1.8 μm),各共有指紋峰的峰形及分離度最佳。

研究顯示,布渣葉含有眾多黃酮類成分,Xiao等[3]采用UPLC-Q-TOF-MS/MS 技術(shù)成功從布渣葉中鑒定出31種化合物,其中28種為黃酮類,3種為酚酸類成分。藥理學(xué)研究表明,黃酮類成分是布渣葉發(fā)揮消食化滯、清熱利濕的重要物質(zhì)基礎(chǔ)[4-8],其代表性成分如牡荊苷、異牡荊苷和水仙苷等,在布渣葉中含量較高,且在水中具有一定的溶解性,因此,布渣葉標(biāo)準(zhǔn)湯劑以牡荊苷、異牡荊苷和水仙苷為含量測(cè)定指標(biāo),并以湯劑為基礎(chǔ)建立布渣葉飲片的含量測(cè)定方法,從而指導(dǎo)標(biāo)準(zhǔn)湯劑的量值傳遞研究。

布渣葉藥材主要分布在廣東、廣西和海南,屬于廣東產(chǎn)道地藥材。15批布渣葉藥材均采自上述3個(gè)產(chǎn)地,具有充分的代表性。從15批標(biāo)準(zhǔn)湯劑出膏率、浸出物以及15批布渣葉飲片3種黃酮類成分的測(cè)定結(jié)果來看,不同批次的樣品存在一定的差異,最大值和最小值相差2倍左右,這種差異與藥材本身質(zhì)量有關(guān),符合《技術(shù)要求》的規(guī)定,未出現(xiàn)明顯異常值。

從轉(zhuǎn)移率測(cè)定結(jié)果來看,3種黃酮類成分的轉(zhuǎn)移率均值在40%～60%之間,以牡荊苷的轉(zhuǎn)移率最高,其次為水仙苷和異牡荊苷,轉(zhuǎn)移率整體比較穩(wěn)定。指紋圖譜研究結(jié)果顯示,從布渣葉飲片到標(biāo)準(zhǔn)湯劑,共有峰的比例產(chǎn)生一定的變化, OPLS-DA分析共找到5個(gè)差異顯著性色譜峰,分別為峰1、2、3、4、6,除峰3未鑒別,其余色譜峰均已知,其中峰1、2、4為酚酸類成分,因此,峰3推測(cè)也為一種酚酸類。酚酸類成分在植物中是一種特殊的存在,既能作為合成其他化合物的前體[9],也能由多種化合物水解產(chǎn)生[10-13],因此,布渣葉標(biāo)準(zhǔn)湯劑中酚酸類成分相對(duì)峰面積的明顯增加,考慮是在標(biāo)湯煎煮過程中,由其他成分水解產(chǎn)生。峰6異牡荊苷與S峰牡荊苷的結(jié)構(gòu)類似,極性相差不大,但轉(zhuǎn)移率卻有較大差異,考慮標(biāo)準(zhǔn)湯劑在煎煮過程中牡荊苷與異牡荊苷存在一定的相互轉(zhuǎn)化,有待于進(jìn)一步研究。

本次研究以布渣葉標(biāo)準(zhǔn)湯劑的關(guān)鍵質(zhì)量指標(biāo)為基礎(chǔ),對(duì)布渣葉飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑的量值傳遞進(jìn)行深入的研究與分析,為布渣葉配方顆粒及其相關(guān)制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供重要參考。