江 程,方 曬,李遠文,吳偉東,陳瑞云,顧 瓊

1深圳技師學(xué)院,深圳 518116;2中山大學(xué)藥學(xué)院藥物分子設(shè)計研究中心,廣州 510006

蕓香草為蕓香科植物臭草RutagraveolensL.的全草,多年生草本植物,有強烈氣味,又名臭艾(《廣西中藥志》)、小香草(《廣西植物名錄》)、荊芥七(《廣西中草藥》)。盛夏采摘,陰干,全草可入藥,枝葉可以煮食(《本草剛草部》)。性寒,味苦、辛,有祛風(fēng),退熱,利尿,活血,解毒,消腫等作用。用于感冒發(fā)熱、風(fēng)濕骨痛、小兒驚風(fēng)、小便不利、泄瀉、疝氣、跌打損傷、熱毒瘡瘍、濕疹等[1]。研究發(fā)現(xiàn)臭草中富含香豆素、生物堿、黃酮、木質(zhì)素以及多酚類等成分[2],已有的活性研究表明臭草具有解痙攣、抗腫瘤、抗菌以及抗生育等活性[3]。基于對清熱解毒植物的抗病毒作用調(diào)研,發(fā)現(xiàn)臭草的95%乙醇提取物具有明顯的體外抑制EB病毒DNA裂解復(fù)制的活性,因此,為了尋找抗EB病毒活性成分,我們利用活性導(dǎo)向分離方法,發(fā)現(xiàn)活性成分存在于二氯甲烷萃取部位,并對這一組分進行了系統(tǒng)的化學(xué)成分研究。以期闡明臭草抗EBV的藥效物質(zhì)基礎(chǔ),為進一步開發(fā)利用其藥用價值提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

AM-400型核磁共振儀(Brucker公司);Agilent 1200型HPLC;Zorbax SB-C-18色譜柱(分析柱4.6 mm × 250 mm,5 μm;半制備柱9.4 mm × 250 mm,5 μm);柱色譜硅膠(200～300目);薄層色譜硅膠G;硅膠GF254(青島海洋化工廠);反相填充材料C-18、Rp-18(Merck公司);Sephadex LH-20凝膠(Pharmacia公司);顯色劑為5%硫酸-乙醇溶液。

P3HR1細胞(來自中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院人類病毒學(xué)實驗室)。

RPIM1640(批號:E500026-0500,BR,生工生物股份有限公司);胎牛血清(批號:E510008-0100,BR,生工生物);青霉素-鏈霉素溶液(批號:B540732-0010,青霉素10 kU/mL,鏈霉素10 mg/mL,無菌,生工生物股份有限公司);右旋蕓香苦素(批號:WKQ-0005734,HPLC純度:98%,四川省維克奇生物科技有限公司);Tetradecanoyl phorbol acetate(TPA,批號:16561-29-8,AR,生工生物股份有限公司);丁酸鈉(批號:A510838-0025,AR,生工生物股份有限公司);DMSO(批號:A503039-0250,AR,生工生物股份有限公司);LightCyclerFastStart DNA MasterPlus SYBR green試劑盒(批號:D601045-0001,生工生物股份有限公司)。

本研究所用臭草新鮮枝葉2019年采自廣東省中山市,并由中國科學(xué)院昆明植物研究所韓春艷博士鑒定為RutagraveolensL.的全草,標(biāo)本存放于中山大學(xué)藥學(xué)院藥物設(shè)計實驗室,標(biāo)本編號20190423012。

1.2 提取與分離

將新鮮的臭草枝葉(10 kg)風(fēng)干,切碎后用95%乙醇室溫下浸提三次(3 × 20 L),每次24 h。浸提液合并后減壓濃縮至浸膏狀。將得到的浸膏(0.85 kg)用適量水(1 L)混懸后,依次用二氯甲烷(3 × 4 L)和正丁醇(3 × 4 L)萃取,然后分別濃縮得到二氯甲烷部分浸膏(275 g)和正丁醇部分浸膏(220 g),把這兩個部位用于抗EBV活性平臺測試,二氯甲烷部分顯示了較好的活性,接著對二氯甲烷部位進行了系統(tǒng)的分離。二氯甲烷部分用1.5倍硅膠拌樣裝柱后,以石油醚-乙酸乙酯(1∶0、100∶1、20∶1、9∶1、3∶1、1∶1、1∶3、0∶1)梯度洗脫得到6個部分(A～F)。將B部分過MCI CHP20P色譜柱,以甲醇-水(30%→100%)梯度洗脫分別得到3個小組分(B1～B3)。3個小組分經(jīng)過多次正向硅膠柱層析(以石油醚-氯仿體系沖洗)后得到6個化合物17(800 mg)、18(3.2 g)、19(286 mg)、20(160 mg)、27(320 mg)、28(432 mg)。C部分采用反相柱(C-18)分離,并以甲醇-水(30%→90%)梯度洗脫得到4個組分(C1～C4),經(jīng)過硅膠柱進一步分離,最后利用凝膠、制備薄層板純化,最終得到化合物1(420 mg)、2(16 mg)、3(28 mg)、4(220 mg)、10(32 mg)、11(12 mg)、12(55 mg)、13(26 mg)、21(134 mg)和22(44 mg)。D部分先利用硅膠柱以二氯甲醇20∶1進行細化段以及除去部分色素,各細分段再先后經(jīng)過正相硅膠柱層析、凝膠的分子篩作用,以及析晶,最終得到化合物5(18 mg)、9(14 mg)、14(3 g)、15(116 mg)、16(224 mg)、24(30 mg)和25(23 mg)。E部分先過中壓反相柱(RP-18),以(30%→100%)甲醇-水為洗脫劑梯度洗脫,再經(jīng)過凝膠柱(甲醇沖洗),最后利用高效液相(甲醇-水30∶70)得到化合物6(500 mg)、7(360 mg)、8(886 mg)、26(4.8 mg)。F部分同樣顯示利用反相柱細分段,再結(jié)合硅膠柱富集目標(biāo)點,最后利用凝膠以及制備薄層層析色譜純化,得化合物23(13.5 mg)、29(12 mg)和30(7.3 mg)。

1.3 抗EBV活性篩選

體外培養(yǎng)P3HR-1細胞(原發(fā)性滲出性淋巴瘤細胞系,含有潛伏感染期的EBV)。使用含有10%血清、鏈霉素(100 μg/mL)-青霉素(100 U/mL)溶液的RPMI1640培養(yǎng)基,在37 ℃,5%二氧化碳濃度條件下進行常規(guī)維持培養(yǎng)和傳代。調(diào)整對數(shù)生長期P3HR-1細胞密度為3×105個/mL,使用20 ng/mL的12-O-十四烷酰佛波醇-13-乙酯(TPA)和丁酸鈉(0.3 mmol/L)誘導(dǎo)P3HR-1細胞進入裂解復(fù)制期。使用DMSO將待測粗提物分別配置不同濃度藥物溶液。P3HR-1細胞經(jīng)TPA處理3 h后,對細胞進行不同濃度的化合物處理,每個濃度設(shè)3個平行復(fù)孔,并設(shè)不進行TPA誘導(dǎo)和不經(jīng)化合物處理的對照組進行比較。P3HR1細胞經(jīng)TPA誘導(dǎo)2 d后收集細胞,提取細胞的總DNA,應(yīng)用實時定量PCR技術(shù),用Light Cycler Fast Start DNA Master Plus SYBR green試劑盒、EBNA1引物(正向:5′-CATTGAGTCGTCTCCCCTTTGGAAT-3′;反向:5′-TCATAACAAGGTCCTTAATCGCA TC-3′)和GAPDH引物分別檢測上述細胞總DNA中EBNA1和GADPH的拷貝數(shù),并計算EBNA1/GADPH相對比值?；衔餃y試結(jié)果用IC50值表示,細胞毒性(CC50)在給細胞加化合物2 d后測試,右旋蕓香苦素為陽性對照組。

按公式(1)計算各化合物在不同濃度下的EBV裂解復(fù)制相對抑制數(shù),以EBV相對抑制數(shù)為縱坐標(biāo),藥物濃度為橫坐標(biāo)繪制各化合物對EBV裂解復(fù)制的抑制曲線圖,并計算各藥物的復(fù)制半數(shù)抑制劑量(IC50)以評價各化合物對EBV裂解復(fù)制的抑制活性。按公式(2)計算各化合物不同濃度下的相對毒性和半數(shù)致死劑量(CC50),用于評價各化合物的細胞毒性。按照公式(3)計算各化合物的選擇性常數(shù)(selective index,SI),以評價各化合物的用藥安全性。

EBV裂解復(fù)制相對抑制數(shù) = [(TPA誘導(dǎo)且加

化合物組EBNA1/GAPDH)-(僅加化合物組

EBNA1/GAPDH)]/[(TPA誘導(dǎo)但不加化合物組

EBNA1/GAPDH)-(不誘導(dǎo)且不加化合物組EBNA1/

GAPDH)]

(1)

相對毒性 =

[1-(加化合物組OD)/(不加化合物組OD)]×100%

(2)

SI = CC50/IC50

(3)

2 實驗結(jié)果

2.1 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1黃色粉末;ESI-MS:m/z286 [M+H]+,分子式為C16H15NO4;1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ:15.0(1H,br s,1-OH),8.43(1H,d,J= 8.0 Hz,H-8),7.86(1H,dd,J= 8.8,7.4 Hz,H-6),7.59(1H,d,J= 8.8 Hz,H-5),7.39(1H,dd,J=8.0,7.4 Hz,H-7),6.27(1H,s,H-4),4.19(3H,s,2-OCH3),4.15(3H,s,3-OCH3),3.88(3H,s,N-CH3);13C NMR(100 MHz,CDCl3)δ:155.7(s,C-1),129.9(s,C-2),159.1(s,C-3),86.7(d,C-4),114.5(d,C-5),133.7(d,C-6),121.2(d,C-7),126.0(d,C-8),180.4(s,C-9),140.1(s,C-11),105.3(s,C-12),120.3(s,C-13),141.6(s,C-14),60.6(q,2-OCH3),55.8(q,3-OCH3),33.8(q,N-CH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻[4]報道基本一致,故鑒定化合物1為山小橘堿。

化合物2黃色粉末;ESI-MS:m/z344 [M+H]+,分子式為C19H21NO5;1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ:8.24(1H,dd,J= 8.1,2.0 Hz,H-8),7.54(1H,td,J= 8.5,8.1 Hz,H-6),7.23(1H,dd,J= 8.5,2.0 Hz,H-5),7.16(1H,td,J= 8.5,8.1 Hz,H-7),4.47(1H,q,J= 6.8 Hz,H-15),3.88(6H,s,1,4-OCH3),3.49(3H,s,N-CH3),1.35(6H,d,J= 6.8 Hz,16,17-CH3);13C NMR(100 MHz,CDCl3)δ:148.6(s,C-1),135.4(s,C-2),146.8(s,C-3),132.6(s,C-4),115.8(d,C-5),133.2(d,C-6),122.2(d,C-7),126.3(d,C-8),176.4(s,C-9),113.7(s,C-11),135.0(s,C-12),123.4(s,C-13),144.5(s,C-14),76.0(d,C-15),22.1(q,C-16,17),60.5(q,1-OCH3),60.8(q,4-OCH3),41.6(q,N-CH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻[5]報道基本一致,故鑒定化合物2為2-羥基-3-異丙氧基-1,4-甲氧基-10-甲基吖啶酮。

化合物3黃色粉末;ESI-MS:m/z308 [M+H]+,分子式為C19H17NO3;1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ:15.20(1H,s,1-OH),8.21(1H,dd,J= 8.0,1.2 Hz,H-8),7.58(1H,m,H-6),7.23(1H,br d,J= 8.4 Hz,H-5),7.13(1H,m,H-7),6.09(1H,s,H-2),5.11(1H,m,H-2),5.10(1H,m,H-4),4.95(1H,m,H-4),3.80(3H,s,N-CH3),3.59(2H,m,H-1),1.78(3H,s,19-CH3);13C NMR(100 MHz,CDCl3)δ:165.3(s,C-1),91.6(d,C-2),166.8(s,C-3),100.7(s,C-4),115.8(d,C-5),134.3(d,C-6),121.6(d,C-7),125.3(d,C-8),180.0(s,C-9),143.3(s,C-11),105.1(s,C-12),120.0(s,C-13),142.3(s,C-14),37.6(t,C-15),85.8(d,C-16),143.4(s,C-17),112.4(t,C-18),16.9(q,C-19),35.9(d,N-CH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻[6]報道基本一致,故鑒定化合物3為蕓香日酮。

化合物4黃色粉末;ESI-MS:m/z256 [M+H]+,分子式為C15H13NO3;1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ:14.72(1H,s,1-OH),8.33(1H,dd,J= 7.8,1.5 Hz,H-5),7.67(1H,m,H-6),7.36(1H,dd,J= 7.8,1.2 Hz,H-8),7.18(1H,m,H-7),6.17(2H,d,J= 1.6 Hz,H-2,4),3.80(3H,s,N-CH3),3.67(3H,s,3-OCH3);13C NMR(100 MHz,CDCl3)δ:165.0(s,C-1),93.1(d,C-2),165.3(s,C-3),88.9(d,C-4),113.5(d,C-5),133.0(d,C-6),120.4(d,C-7),125.7(d,C-8),180.0(s,C-9),141.0(s,C-11),103.9(s,C-12),120.0(s,C-13),143.7(s,C-14),54.5(q,3-OCH3),33.0(q,N-CH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻[7]報道基本一致,故鑒定化合物4為1-羥基-3-甲氧基-N-甲基吖啶酮。

化合物5黃色粉末;ESI-MS:m/z340 [M+H]+,分子式為C19H17NO5;1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ:8.64(1H,dd,J= 8.0,1.5 Hz,H-8),7.66(1H,ddd,J= 8.6,7.1,1.6 Hz,H-7),7.38(1H,d,J= 8.6 Hz,H-5),7.28(1H,t,J= 7.3 Hz,H-6),6.57(1H,s,H-2),5.47(1H,t,J= 9.0 Hz,H-16),4.52～4.41(2H,m,H-17),4.36(2H,d,J= 11.1 Hz,H-21),4.29～4.17(2H,m,H-22),3.77(3H,s,N-CH3);13C NMR(100 MHz,C5D5N)δ:166.0(s,C-1),92.9(d,C-2),168.1(s,C-3),101.7(s,C-4),115.7(d,C-5),134.1(d,C-6),121.8(d,C-7),126.5(d,C-8),181.5(s,C-9),106.8(s,C-11),144.0(s,C-12),121.6(s,C-13),143.2(s,C-14),85.7(d,C-15),32.8(t,C-16),76.0(s,C-17),47.6(t,C-19),62.9(t,C-20),38.0(q,N-CH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻[8]報道基本一致,故鑒定化合物5為羥甲基吖啶酮環(huán)氧化物。

化合物7黃色粉末;ESI-MS:m/z276 [M+H]+,分子式為C15H17NO4;1H NMR(400 MHz,CD3OD)δ:8.08(1H,d,J= 9.0 Hz,H-9),7.94(1H,dd,J= 9.1,2.8 Hz,H-8),7.86(1H,d,J= 2.7 Hz,H-6),4.48(1H,t,J= 4.9 Hz,H-3),4.18(3H,s,N-CH3),3.38(2H,d,J= 4.8 Hz,H-4),1.83(3H,s,2-CH3),1.66(3H,s,2-CH3);13C NMR(100 MHz,CD3OD)δ:81.7(s,C-2),67.2(d,C-3),25.7(t,C-4),174.5(s,C-5),116.8(d,C-6),152.7(s,C-7),108.4(d,C-8),120.6(s,C-9),132.1(s,C-10),124.4(s,C-11),153.9(s,C-12),95.3(s,C-13),24.9(q,2-CH3),20.1(q,2-CH3),30.1(q,N-CH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻[10]報道基本一致,故鑒定化合物7為(-)-日把里尼定。

化合物10黃色粉末;ESI-MS:m/z230 [M+H]+,分子式為C13H11NO3;1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ:7.80(1H,dd,J= 9.0,2.5 Hz,H-5),7.52(1H,d,J= 2.8 Hz,H-2),7.34(1H,dd,J= 9.0,9.0 Hz,H-6),7.01(1H,dd,J= 9.0,2.5 Hz,H-7),6.97(1H,d,J= 2.8 Hz,H-3),4.35(3H,s,4-OCH3),4.05(3H,s,8-OCH3);13C NMR(100 MHz,CDCl3)δ:143.3(s,C-2),104.1(d,C-3),156.3(s,C-4),113.8(s,C-5),123.1(s,C-6),107.2(d,C-7),154.1(s,C-8),137.1(s,C-9),119.1(s,C-10),162.7(s,C-11),58.5(q,4-OCH3),55.5(q,8-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻[12]報道基本一致,故鑒定化合物10為γ-fagarine。

化合物11黃色粉末;ESI-MS:m/z260 [M+H]+,分子式為C14H13NO4;1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ:7.42(1H,s,H-5),7.33(1H,s,H-8),7.55(1H,d,J= 2.8 Hz,H-2),6.99(1H,d,J= 2.8 Hz,H-3),4.46(3H,s,4-OCH3),4.05(3H,s,6-OCH3),4.02(3H,s,7-OCH3);13C NMR(100 MHz,CDCl3)δ:142.4(s,C-2),104.5(d,C-3),155.7(s,C-4),100.4(d,C-5),152.6(s,C-6),147.9(s,C-7),106.7(d,C-8),142.7(s,C-9),102.3(s,C-10),163.1(s,C-11),113.1(d,C-12),58.8(q,4-OCH3),56.0(q,6,7-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻[13]報道基本一致,故鑒定化合物11為香草木寧堿。

化合物12黃色粉末;ESI-MS:m/z246 [M+H]+,分子式為C13H11NO4;1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ:8.07(1H,d,J= 9.0 Hz,H-5),7.58(1H,d,J= 2.5 Hz,H-2),7.21(1H,d,J= 9.0 Hz,H-6),7.03(1H,d,J= 2.5 Hz,H-3),4.46(3H,s,8-OCH3),4.03(3H,s,4-OCH3);13C NMR(100 MHz,CDCl3)δ:142.5(s,C-2),104.7(d,C-3),157.3(s,C-4),118.8(d,C-5),114.2(d,C-6),138.6(s,C-7),140.7(s,C-8),149.0(d,C-9),101.7(s,C-10),164.1(s,C-11),114.5(s,C-12),58.7(q,4-OCH3),62.0(q,8-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻[14]報道基本一致,故鑒定化合物12為合帕洛平。

化合物13黃色粉末;ESI-MS:m/z260 [M+H]+,分子式為C14H13NO4;1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ:8.03(1H,d,J= 9.0 Hz,H-5),7.58(1H,d,J= 2.5 Hz,H-2),7.23(1H,d,J= 9.0 Hz,H-6),7.05(1H,d,J= 2.5 Hz,H-3),4.46(3H,s,8-OCH3),4.16(3H,s,4-OCH3),4.07(3H,s,7-OCH3);13C NMR(100MHz,CDCl3)δ:142.8(d,C-2),104.6(d,C-3),157.1(s,C-4),118.1(d,C-5),111.8(d,C-6),142.0(s,C-7),141.1(s,C-8),152.1(s,C-9),101.8(s,C-10),164.3(s,C-11),114.8 (s,C-12),58.8(q,4-OCH3),56.7(q,7-OCH3),61.6(q,8-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻[15]報道基本一致,故鑒定化合物13為茵芋堿。

化合物15白色粉末;ESI-MS:m/z255 [M+H]+,分子式為C16H14O3;1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ:7.68(1H,s,H-4),7.67(1H,d,J= 2.1 Hz,H-11),7.65(1H,s,H-5),7.43(1H,s,H-8),6.82(1H,d,J= 2.1 Hz,H-12),6.21(1H,dd,J= 17.7,10.3 Hz,H-14),5.15(1H,d,J= 5.8 Hz,H-15),5.08(1H,d,J= 5.8 Hz,H-15),1.52(6H,s,13-CH3);13C NMR(100 MHz,CDCl3)δ:159.9(s,C-2),133.1(s,C-3),138.3(d,C-4),119.5(d,C-5),124.6(s,C-6),155.8(s,C-7),98.9(d,C-8),151.3(s,C-9),115.9(s,C-10),146.6(s,C-11),106.4(d,C-12),40.5(s,C-13),145.5(d,C-14),112.3(t,C-15),26.2(q,13-CH3),26.2(q,13-CH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻[17]報道基本一致,故鑒定化合物15為chalepensin。

化合物17白色粉末;ESI-MS:m/z217 [M+H]+,分子式為C12H8O4;1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ:7.79(1H,d,J= 9.6 Hz,H-4),7.69(1H,d,J= 2.1 Hz,H-11),6.95(1H,s,H-5),6.82(1H,d,J= 2.1 Hz,H-12),6.37(1H,d,J= 9.6 Hz,H-3);13C NMR(CDCl3,100 MHz)δ:160.7(s,C-2),115.0(d,C-3),144.6(s,C-4),113.1(d,C-5),126.4(s,C-6),148.0(s,C-7),133.0(s,C-8),143.2(s,C-9),116.7(s,C-10),146.9(s,C-11),107.0(d,C-12),61.6(q,8-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻[19]報道基本一致,故鑒定化合物17為花椒毒素。

化合物18白色粉末;ESI-MS:m/z187 [M+H]+,分子式為C11H6O3;1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ:7.81(1H,d,J= 9.6 Hz,H-4),7.70(1H,d,J= 2.4 Hz,H-11),7.69(1H,s,H-5),7.48(1H,s,H-8),6.76(1H,d,J= 2.4 Hz,H-12),6.38(1H,d,J= 9.6 Hz,H-3);13C NMR(CDCl3,100 MHz)δ:160.1(s,C-2),114.7(d,C-3),144.0(d,C-4),119.8(d,C-5),124.9(s,C-6),156.4(s,C-7),99.9(d,C-8),152.1(s,C-9),115.4(s,C-10),146.9(s,C-11),106.4(d,C-12)。以上數(shù)據(jù)與文獻[20]報道基本一致,故鑒定化合物18為補骨酯素。

化合物19白色粉末;ESI-MS:m/z217 [M+H]+,分子式為C12H8O4;1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ:8.15(1H,d,J= 9.8 Hz,H-4),7.59(1H,d,J= 2.4 Hz,H-9),7.13(1H,s,H-8),7.01(1H,d,J= 2.4 Hz,H-2),6.27(1H,d,J= 9.8 Hz,H-3);13C NMR(CDCl3,100 MHz)δ:160.2(s,C-2),112.6(d,C-3),139.2(d,C-4),149.5(s,C-5),112.7(s,C-6),158.3(s,C-7),93.9(d,C-8),152.7(s,C-9),106.4(s,C-10),144.7(s,C-11),105.0(d,C-12),60.1(q,5-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻[13]報道基本一致,故鑒定化合物19為佛手柑內(nèi)酯。

化合物20白色粉末;ESI-MS:m/z231 [M+H]+,分子式為C14H14O3;1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ:7.64(1H,d,J= 9.5 Hz,H-4),7.36(1H,d,J= 8.6 Hz,H-5),6.85(1H,dd,J= 8.6,2.3 Hz,H-6),6.82(1H,d,J= 2.3 Hz,H-8),6.25(1H,d,J= 9.5 Hz,H-3),5.48(1H,m,H-2′),4.58(2H,d,J= 6.9 Hz,H-1′),1.81(3H,br s,H-4′),1.77(3H,br s,H-5′);13C NMR(CDCl3,100 MHz)δ:161.3(s,C-2),112.9(d,C-3),143.5(d,C-4),128.7(d,C-5),113.2(d,C-6),162.1(s,C-7),101.5(d,C-8),155.8(s,C-9),112.4(s,C-10),65.4(t,C-1′),118.6(d,C-2′),139.3(s,C-3′),25.8(q,4-OCH3),18.3(q,5-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻[21]報道基本一致,故鑒定化合物20為7-preniloxicumarin。

化合物21白色粉末;ESI-MS:m/z193 [M+H]+,分子式為C10H8O4;1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ:7.83(1H,d,J= 9.4 Hz,H-4),7.06(1H,s,H-5),6.96(1H,s,H-8),6.28(1H,d,J= 9.4 Hz,H-3),3.96(3H,s,7-OCH3);13C NMR(CDCl3,100 MHz)δ:161.7(s,C-2),114.6(d,C-3),143.9(d,C-4),111.5(d,C-5),146.6(d,C-6),150.3(s,C-7),99.6(d,C-8),149.4(s,C-9),112.8(s,C-10),56.5(q,7-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻[22]報道基本一致,故鑒定化合物21為異東莨菪素。

化合物22白色粉末;ESI-MS:m/z163 [M+H]+,分子式為C9H6O3;1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ:7.70(1H,d,J= 9.6 Hz,H-4),6.35(1H,d,J= 9.6 Hz,H-3),7.26(1H,dd,J= 7.5,1.2 Hz,H-8),6.98(1H,dd,J= 7.5,1.5 Hz,H-7),6.86(1H,d,J= 1.5 Hz,H-5);13C NMR(CDCl3,100 MHz)δ:160.9(s,C-2),116.97(d,C-3),143.6(d,C-4),112.6(s,C-5),154.3(s,C-6),119.6(s,C-7),117.14(s,C-8),146.6(s,C-9),120.08(s,C-10)。以上數(shù)據(jù)與文獻[23]報道基本一致,故鑒定化合物22為6-羥基香豆素。

化合物23白色粉末,ESI-MS:m/z355 [M+H]+,分子式為C16H18O9;1H NMR(400 MHz,CD3OD)δ:7.57(1H,d,J= 9.6 Hz,H-4),7.23(1H,s,H-8),6.91(1H,s,H-5),6.16(1H,d,J= 9.6 Hz,H-3),5.46(1H,d,J= 7.6 Hz,H-1′),4.23～3.86(6H,m,H-2′,3′,4′,5′,6′),3.61(3H,s,6-OCH3);13C NMR(100 MHz,CD3OD)δ:161.1(s,C-2),113.7(d,C-3),143.7(d,C-4),109.6(s,C-5),146.8(s,C-6),149.7(s,C-7),103.9(d,C-8),150.8(s,C-9),112.8(s,C-10),101.3(d,C-1′),74.2(d,C-2′),77.8(d,C-3′),70.7(d,C-4′),78.5(d,C-5′),61.8(t,C-6′),56.0(q,6-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻[24]報道基本一致,故鑒定化合物23為東莨菪苷。

化合物24黃色粉末;ESI-MS:m/z280 [M+H]+,分子式為C17H13NO3;1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ:8.49(1H,dd,J= 8.0,1.5 Hz,H-5),7.71(1H,dd,J= 8.7,1.7 Hz,H-8),7.54(1H,d,J= 8.6 Hz,H-13),7.46～7.35(1H,m,H-6),7.27(1H,s,H-3),6.96～6.83(2H,m,H-7,12),6.28(1H,s,H-16),6.07(2H,s,H-17),3.63(3H,s,N-CH3);13C NMR(100 MHz,CDCl3)δ:154.3(s,C-2),112.7(d,C-3),177.6(s,C-4),123.6(s,C-5),126.7(d,C-6),129.5(d,C-7),126.9(d,C-8),115.9(s,C-9),148.7(s,C-10),132.3(s,C-11),122.7(s,C-12),108.6(d,C-13),141.9(s,C-14),147.9(s,C-15),109.0(d,C-16),101.7(t,C-17),37.2(q,N-CH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻[25]報道基本一致,故鑒定化合物24為蕓香靈。

化合物25黃色粉末;ESI-MS:m/z280 [M+H]+,分子式為C17H13NO3;1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ:8.14(1H,dd,J= 8.3,1.0 Hz,H-5),8.04(1H,d,J= 8.1 Hz,H-8),7.71～7.64(2H,m,H-7,12),7.59(1H,dd,J= 8.1,1.8 Hz,H-16),7.44(1H,ddd,J= 8.1,6.9,1.5 Hz,H-6),7.07(1H,s,H-3),6.92(1H,d,J= 8.1 Hz,H-15),6.01(2H,s,H-17),4.08(3H,s,4-OCH3);13C NMR(100 MHz,CDCl3)δ:162.9(s,C-2),97.6(d,C-3),158.2(s,C-4),121.8(d,C-5),125.3(d,C-6),130.1(d,C-7),129.2(d,C-8),120.4(s,C-9),149.2(s,C-10),134.9(s,C-11),121.7(d,C-12),108.2(d,C-13),148.4(s,C-14),148.9(s,C-15),108.5(d,C-16),101.5(t,C-17),55.7(q,4-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻[26]報道基本一致,故鑒定化合物25為蕓香寧。

化合物26白色粉末;ESI-MS:m/z225 [M+H]+,分子式為C12H16O4;1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ:7.03(2H,s,H-2,6),6.59(1H,d,J= 15.1 Hz,H-7),6.26(1H,dt,J= 15.2,6.2 Hz,H-8),4.20(1H,dd,J= 16.8,6.0 Hz,H-9β),3.90(6H,s,3,5-OCH3),3.84(3H,s,4-OCH3),3.68(1H,m,H-9α);13C NMR(100 MHz,CDCl3)δ:132.7(d,C-1),104.1(d,C-2,6),153.6(s,C-3,5),140.8(s,C-4),130.0(d,C-7),129.2(d,C-8),63.0(t,C-9),56.1(q,3,5-OCH3),60.6(q,4-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻[27]報道基本一致,故鑒定化合物26為3-(3,4,5-三甲氧基苯基)-2-丙烯-1-醇。

化合物27淡黃色粉末;ESI-MS:m/z249 [M+H]+,分子式為C15H20O3;1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ:6.79(1H,d,J= 7.3 Hz,H-5),6.26(1H,dd,J= 7.2,1.2 Hz,H-6),6.55(1H,d,J= 1.6 Hz,H-2),5.95(1H,s,H-1′′),2.62(2H,td,J= 5.2,2.6 Hz,H-1′),2.43(2H,m,H-6′),1.99(3H,s,7′-CH3),1.55～1.63(4H,m,H-2′,5′),1.32～1.38(4H,m,H-3′,4′);13C NMR(100 MHz,CDCl3)δ:136.6(s,C-1),108.9(d,C-2),147.4(s,C-3),145.5(s,C-4),108.1(d,C-5),121.0(d,C-6),35.4(d,C-1′),31.4(d,C-2′),29.0(d,C-3′,4′),23.9(d,C-5′),43.7(d,C-6′),208.8(s,C-7′),29.7(q,C-8′),100.7(t,C-1′′)。以上數(shù)據(jù)與相關(guān)文獻[28]報道基本一致,故鑒定化合物27為moskachan D。

化合物28淡黃色粉末;ESI-MS:m/z193 [M+H]+,分子式為C11H12O3;1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ:6.79(1H,d,J= 7.3 Hz,H-5),6.26(1H,dd,J= 7.2,1.2 Hz,H-6),6.55(1H,d,J= 1.6 Hz,H-2),5.95(1H,s,H-1′′),2.78(2H,t,J= 5.2 Hz,H-1′),2.53(2H,m,H-2′),2.03(3H,s,3′-CH3);13C NMR(100 MHz,CDCl3)δ:135.6(s,C-1),108.9(d,C-2),147.4(s,C-3),145.5(s,C-4),108.1(d,C-5),121.0(d,C-6),46.2(d,C-1′),30.7(d,C-2′),210.8(s,C-3′),30.2(q,C-4′),100.7(t,C-1′′)。以上數(shù)據(jù)與文獻[29]報道基本一致,故鑒定化合物28為胡椒基丙酮。

化合物29黃色粉末;ESI-MS:m/z611 [M+H]+,分子式為C27H30O16;1H NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ:7.60(1H,d,J= 1.9 Hz,H-2′),7.55(1H,dd,J= 8.6,1.9 Hz,H-6′),7.18(1H,d,J= 8.6 Hz,H-5′),6.40(1H,d,J= 1.9 Hz,H-8),6.19(1H,d,J= 1.9 Hz,H-6),5.11(1H,d,J= 7.6 Hz,H-1′′),4.37(1H,br s,H-1′′′),0.99(3H,d,J= 6.1 Hz,5′′′-CH3);13C NMR(100 MHz,DMSO-d6)δ:156.8(s,C-2),133.8(s,C-3),177.8(s,C-4),161.6(s,C-5),99.2(d,C-6),164.5(s,C-7),94.1(d,C-8),157.1(s,C-9),104.5(s,C-10),121.7(s,C-1′),115.7(d,C-2′),145.3(s,C-3′),148.9(s,C-4′),116.7(d,C-5′),122.1(d,C-6′),101.6(d,C-1′′),74.5(d,C-2′′),76.8(d,C-3′′),71.0(d,C-4′′),76.4(d,C-5′′),67.4(t,C-6′′),101.3(d,C-1′′′),70.9(d,C-2′′′),70.5(d,C-3′′′),72.3(d,C-4′′′),68.8(d,C-5′′′),18.2(q,C-6′′′)。以上數(shù)據(jù)與相關(guān)文獻[30]報道基本一致,故鑒定化合物29為蘆丁。

化合物30淡黃色稠狀固體;ESI-MS:m/z755 [M+H]+,分子式為C34H42O19;1H NMR(400 MHz,CD3OD)δ:7.71(1H,d,J= 16.0 Hz,H-3′′′),7.66(1H,d,J= 16.0 Hz,H-3′′),6.92(2H,s,H-5′′′,9′′′),6.91(2H,s,H-5′′,9′′),6.54(1H,d,J= 16.0 Hz,H-2′′′),6.44(1H,d,J= 16.0 Hz,H-2′′),5.75(1H,d,J= 8.8 Hz,H-1),5.22(1H,dd,J= 9.2,8.8 Hz,H-3),4.36(1H,d,J= 8.0 Hz,H-1′),4.21(1H,br d,J= 10.4 Hz,Ha-6),3.88(12H,s,6′′,6′′′,8′′,8′′′-OCH3),3.86(1H,dd,J= 4.0,10.4 Hz,Hb-6),3.85(1H,d,J= 12.0 Hz,Ha-6′),3.80(1H,dd,J= 9.0,8.7Hz,H-4),3.78(1H,m,H-5),3.74(1H,dd,J= 9.1,8.8 Hz,H-2),3.64(1H,dd,J= 12.0,4.0 Hz,Hb-6′),3.35(1H,t,J= 9.2 Hz,H-3′),3.26(2H,m,H-4′,H-5′),3.23(1H,dd,J= 9.2,8.0 Hz,H-2′);13C NMR(100 MHz,CD3OD)δ:95.7(d,C-1),72.4(d,C-2),78.6(d,C-3),69.2(d,C-4),77.6(d,C-5),69.3(t,C-6),104.6(d,C-1′),75.1(d,C-2′),78.0(d,C-3′,C-5′),71.6(d,C-4′),62.7(t,C-6′),167.0(s,C-1′′),115.0(d,C-2′′),147.0(d,C-3′′),126.1(s,C-4′′),106.9(d,C-5′′,9′′),149.2(s,C-6′′,6′′′,8′′,8′′′),139.4(s,C-7′′),168.3(s,C-1′′′),116.3(d,C-2′′′),148.5(d,C-3′′′),126.5(s,C-4′′′),107.2(d,C-5′′′,9′′′),139.8(s,C-7′′′),57.0(q,C-6′′,6′′′,8′′,8′′′-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻[31]報道基本一致,故鑒定化合物30為1,3-disinapoylgentiobiose。

化合物1～30結(jié)構(gòu)見圖1。

圖1 化合物1～30的結(jié)構(gòu)Fig.1 Structures of compounds 1-30

2.2 抗EBV活性篩選結(jié)果

將30個化合物均進行體外抗EBV活性評價,結(jié)果顯示在30 μmol/L的濃度下,共有6個化合物抑制EB病毒裂解復(fù)制達到50%以上。隨后繼續(xù)測試這6個化合物的IC50,CC50以及SI(見表1),測試結(jié)果表明化合物5、24與陽性對照組右旋蕓香苦素對比,顯示更高抗EB病毒活性及選擇性。

表1 臭草中化合物的抑制EBV裂解復(fù)制活性及細胞毒性

3 討論與結(jié)論

臭草為藥用的多年生草本植物,具有特殊的香味,原產(chǎn)于地中海沿岸,在我國南北均有種植,多以盆栽。本實驗采用現(xiàn)代色譜技術(shù)對臭草95%提取物的二氯甲烷部位進行了化學(xué)成分研究,從中分離得到30個化合物,化合物1～13為吖啶酮類生物堿類化合物,化合物24、25為喹啉酮類生物堿類化合物,化合物14～23為香豆素類化合物,其他化合物為芳香醇、酮、黃酮苷以及二聚苯丙素糖苷等化合物,其中化合物2、7、9、12、20、22、23、26、27、28、30為首次從該植物中分離得到。對所得的化合物進行抑制EBV裂解復(fù)制活性及細胞毒性活性篩選,從結(jié)果來看,所得化合物中5、14、20、24、25、27等6個化合物對抑制EBV裂解復(fù)制活性較明顯,其中化合物5和24抑制EBV活性高于陽性對照右旋蕓香苦素抑制活性。目前對于臭草的抗病毒活性成分的報道較少,主要集中在流感病毒、皰疹病毒[3],為進一步研究抗病毒的物質(zhì)基礎(chǔ),我們還將繼續(xù)研究其化學(xué)成分,并重點關(guān)注生物堿,以期獲得具有較好抑制EBV裂解復(fù)制活性的化合物。本研究內(nèi)容豐富了臭草的化學(xué)成分信息,為臭草進一步藥用價值開發(fā)提供了物質(zhì)基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù),化合物5、24兩類具有抑制EBV活性的化合物為鼻咽癌藥物的開發(fā)提供了活性骨架。