吳偉峰,李鈺鈴,唐小文,鄧煜然,孔令佳,盛釗君,林忠澤,2,3*

1.五邑大學(xué),江門 529000;2. 特一藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司,江門 529200;3.廣東江門中醫(yī)藥職業(yè)學(xué)院,江門 529000

止咳寶片是由紫菀、橘紅、桔梗、枳殼、百部、五味子、陳皮、干姜、荊芥、罌粟殼浸膏、甘草、氯化銨、前胡、薄荷素油制備而成,具有宣肺祛痰、止咳平喘的功效,可用于外感風(fēng)寒所致的咳嗽、痰多清稀、咳甚而喘[1-2]。止咳寶片現(xiàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)為2015年版《中華人民共和國藥典》一部,其中僅有薄層色譜分析定性五味子與紫菀2味藥材、嗎啡含量測定[3],而相關(guān)研究也多為對單味藥材進(jìn)行分析、測定,缺乏整體反映止咳寶片內(nèi)在質(zhì)量的分析方法。指紋圖譜技術(shù)[4-5]是一種綜合性的鑒定方法,其指對經(jīng)過一定適當(dāng)處理的中藥或其他成分使用一定的分析手段,得到可以反映其特征性和指紋性的圖譜[6-9],該圖譜可整體反映中藥所含的化學(xué)成分種類和數(shù)量[10-12],可對藥品的質(zhì)量進(jìn)行全面地評價。本研究在相關(guān)研究[13-25]的基礎(chǔ)上,用高效液相色譜法(high performance liquid chromatography,HPLC)建立止咳寶片的指紋圖譜,為評價止咳寶片的整體質(zhì)量提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

UltiMate 3000型高效液相色譜儀(UV-VIS檢測器)、Chromeleon 7色譜數(shù)據(jù)工作站、Evolution 201紫外可見光分光光度計,均購自美國Thermo公司;KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);ML204T電子天平(萬分之一,瑞士Mettler Toledo公司)。

1.2 試藥

對照品:甘草苷(批號11610-201106)、柚皮苷(批號110722-201714)、橙皮苷(批號110721-201818)、白花前胡甲素(批號111711-200602)、白花前胡乙素(批號111904-201203)、五味子醇甲(批號110857-201714)、五味子乙素(批號110765-200205)、嗎啡(批號171201-201825),均購自中國食品藥品檢定研究院;乙腈、磷酸為色譜純,均購自上海泰坦科技股份有限公司;超純水(用Milli-Q超純水系統(tǒng)制得,法國Merck公司);甲醇等試劑均為分析純。

對照藥材:紫菀(批號120956-201807)、桔梗(批號121028-201612)、枳殼(批號120981-201605)、百部(批號121221-201604)、五味子(批號120922-201610)、陳皮(批號120969-201510)、干姜(批號120942-201606)、荊芥(批號120911-201512)、甘草(批號120904-201620)、前胡(批號120951-201706),均購自中國食品藥品檢定研究院;橘紅進(jìn)廠編碼為190711005,購自安徽省亳州市藥材總公司醫(yī)藥公司。

止咳寶片規(guī)格為0.35 g·片-1,共有20批,編號為S1～S20,其批號分別為11180611、11180612、11180621、11180622、1180623、11180624、11180625、11180626、11180627、1180628、32190601、32190602、32190603、32190604、32190605、32190606、32190607、32190608、32190609、32190610,均由特一藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Agilent ZORBAX SB-Phenyl色譜柱(150 mm×4.6 mm,5 μm);流速為0.5 mL·min-1;檢測波長為210 nm;柱溫為30 ℃。流動相為乙腈(A)-4 mL·L-1磷酸水(B),梯度洗脫,洗脫程序?yàn)?～8 min,5% A;8～25 min,5%～18% A;25～35 min,18% A;35～65 min,18%～27% A;65～110 min,27%～80% A;110～120 min,80%～90% A;120～130 min,90% A。

2.2 溶液制備

2.2.1供試品溶液 精密稱取止咳寶片樣品0.25 g,置于具塞錐形瓶,量取25 mL體積分?jǐn)?shù)為50%的甲醇,置于具塞錐形瓶后密閉,稱定質(zhì)量,在超聲功率500 W、超聲頻率40 kHz條件下超聲20 min,放置至室溫,再次稱定質(zhì)量,滴加體積分?jǐn)?shù)為50%的甲醇補(bǔ)足質(zhì)量,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,即得。

2.2.2對照品溶液 精密稱取柚皮苷、橙皮苷、白花前胡甲素、白花前胡乙素、五味子醇甲、五味子乙素、嗎啡對照品適量,加一定量的甲醇,分別制成80 μg·mL-1柚皮苷、60 μg·mL-1橙皮苷、50 μg·mL-1白花前胡甲素、50 μg·mL-1白花前胡乙素、0.3 mg·mL-1五味子醇甲、1 mg·mL-1五味子乙素、10 μg·mL-1嗎啡的對照品溶液;另取甘草苷對照品適量,精密稱定,加入體積分?jǐn)?shù)為70%的甲醇制成質(zhì)量濃度為20 μg·mL-1的對照品溶液,濾過后接取續(xù)濾液,即得。

2.2.3對照藥材溶液 分別將11味對照藥材紫菀、橘紅、桔梗、枳殼、百部、五味子、陳皮、干姜、荊芥、甘草、前胡粉碎,過40目篩。精密稱取粉碎過篩的對照藥材各0.25 g,分別置于具塞錐形瓶中,量取25 mL 體積分?jǐn)?shù)為50%的甲醇加入后密閉,稱定質(zhì)量,在超聲功率500 W、超聲頻率40 kHz條件下超聲20 min,放置至室溫,再次稱定質(zhì)量,滴加體積分?jǐn)?shù)為50%的甲醇補(bǔ)足質(zhì)量,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,即得。

2.3 精密度實(shí)驗(yàn)

取同一份供試品(批號32190604),按照2.2.1項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按照2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6次,進(jìn)行HPLC分析,在指紋圖譜中以10號峰為參照峰,計算得各共有峰相對保留時間的RSD值為0.01%～0.15%,相對峰面積的RSD值為0.30%～2.79%,表明儀器的精密度良好。

2.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取同一份供試品(批號32190604),按照2.2.1項(xiàng)下的方法平行制備供試品溶液6份,按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行HPLC分析,在指紋圖譜中以10號峰為參照峰,計算得各共有峰相對保留時間的RSD值為0.01%～0.10%,相對峰面積的RSD值為0.55%～2.78%,表明儀器的重復(fù)性良好。

2.5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取同一份供試品(批號32190604),按照2.2.1項(xiàng)下的方法制備供試品溶液,分別在制備后0、2.5、5、7.5、10、12.5、15、17.5、20、24、48 h按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行HPLC分析。在指紋圖譜中以10號峰為參照峰,計算得各共有峰相對保留時間的RSD值為0.01%～0.16%,相對峰面積的RSD值為0.19%～2.49%,表明儀器的穩(wěn)定性良好。

2.6 指紋圖譜的建立與相似度分析

表1 相似度評價結(jié)果

表2 20批樣品的相對保留時間和相對峰面積結(jié)果

注:S1～S20分別為不同批號(11180611、11180612、11180621、11180622、1180623、11180624、11180625、11180626、11180627、1180628、32190601、32190602、32190603、32190604、32190605、32190606、32190607、32190608、32190609、32190610)的止咳寶片。

注:1～21.指紋圖譜特征峰。

2.7 指紋峰歸屬與定性分析

精密吸取供試品溶液、對照藥材溶液、對照品溶液、空白溶液(體積分?jǐn)?shù)為50%的甲醇),按照2.1項(xiàng)下色譜條件測定,進(jìn)樣體積為10 μL。通過與對照藥材對比分析,指認(rèn)了部分峰的藥材歸屬,3、6、7、13、14、15號峰歸屬甘草,5、19、20號峰歸屬前胡,9號峰歸屬枳殼,12號峰歸屬荊芥,16、21號峰歸屬五味子。另通過與對照品溶液對比分析,定性了1號峰為嗎啡、7號峰為甘草苷、9號峰為柚皮苷、10號峰為橙皮苷、16號峰為五味子醇甲、19號峰為白花前胡甲素、20號峰為白花前胡乙素、21號峰為五味子乙素。見圖3、圖4。

注:S14為批號32190604的止咳寶片;a.空白;b.五味子乙素;c.白花前胡乙素;d.白花前胡甲素;e.五味子醇甲;f.橙皮苷;g.柚皮苷;h.甘草苷;i.嗎啡;1.嗎啡;7.甘草苷;9.柚皮苷;10.橙皮苷;16.五味子醇甲;19.白花前胡甲素;20.白花前胡乙素;21.五味子乙素。

注:S14為批號32190604的止咳寶片;a.空白;j.荊芥;k.干姜;l.桔梗;m.百部;n.紫菀;o.前胡;p.五味子;q.陳皮;r.橘紅;s.枳殼;t.甘草;3、6、7、13、14、15號峰歸屬甘草;5、19、20號峰歸屬前胡;9號峰歸屬枳殼;12號峰歸屬荊芥;16、21號峰歸屬五味子。

2.8 共有指紋峰相對保留時間規(guī)定值

根據(jù)20批止咳寶片指紋圖譜中21個指紋峰的相對保留時間(以10號峰橙皮苷為參照峰),并結(jié)合方法學(xué)考察因子對指紋峰相對保留時間的影響,確定其規(guī)定值波動范圍在±3%以內(nèi),分別為0.234(1號峰)、0.463(2號峰)、0.472(3號峰)、0.582(4號峰)、0.625(5號峰)、0.648(6號峰)、0.832(7號峰)、0.903(8號峰)、0.973(9號峰)、1.000(10號峰)、1.066(11號峰)、1.088(12號峰)、1.155(13號峰)、1.376(14號峰)、1.688(15號峰)、1.770(16號峰)、1.823(17號峰)、1.836(18號峰)、1.980(19號峰)、2.105(20號峰)、2.123(21號峰)。

2.9 共有指紋峰相對峰面積規(guī)定值

在20批止咳寶片指紋圖譜的21個指紋峰中,單峰面積占共有峰總面積20%的共有峰有10號峰,峰面積占比小于20%但大于10%的共有峰有1號峰、7號峰,其余共有峰峰面積占比均小于10%,其中2、3號峰未達(dá)到基線分離,故將該組峰的總峰面積作為峰面積,該組合峰峰面積占比為4.80%,RSD值為8.19%。因此確定共有指紋峰相對峰面積比值為0.827(1號峰)、0.234(2、3號峰)、0.045(4號峰)、0.045(5號峰)、0.052(6號峰)、0.515(7號峰)、0.272(8號峰)、0.293(9號峰)、1.000(10號峰)、0.165(11號峰)、0.222(12號峰)、0.140(13號峰)、0.126(14號峰)、0.085(15號峰)、0.039(16號峰)、0.065(17號峰)、0.060(18號峰)、0.399(19號峰)、0.105(20號峰)、0.127(21號峰)。

3 討論

3.1 HPLC條件選擇

止咳寶片是由多味藥材復(fù)方制成的,其成分眾多且各自溶解度不同,在對比C18色譜柱的分離效果后,發(fā)現(xiàn)使用苯基色譜柱時各峰的峰形和分離度均較好。另通過對止咳寶片供試品溶液進(jìn)行190～400 nm全波長掃描,考察了其最佳吸收波長,發(fā)現(xiàn)在210 nm處其色譜峰數(shù)較多,分離度和峰形均較好,最終確定210 nm為檢測波長。因甲醇在210 nm波長處存在基線不穩(wěn)的現(xiàn)象,故選用乙腈作為流動相的有機(jī)相,同時考察了乙腈-水、乙腈-1 mL·L-1磷酸、乙腈-1 mL·L-1冰醋酸、乙腈-4 mL·L-1磷酸等流動相系統(tǒng),發(fā)現(xiàn)乙腈-4 mL·L-1磷酸在梯度洗脫時峰形更好,故選用該條件作為色譜條件。

3.2 止咳寶片供試品溶液制備方法選擇

在考察止咳寶片的提取方法時,分別考察了加熱回流提取和超聲提取2種方法,并對不同提取時間(加熱回流30、60、90 min,超聲提取10、20、30 min)和提取溶劑(水、體積分?jǐn)?shù)為50%的甲醇、甲醇)進(jìn)行考察。結(jié)果表明,用體積分?jǐn)?shù)為50%的甲醇作為提取溶劑、超聲提取20 min獲得的色譜峰響應(yīng)值較高且峰形較好,故選用該方法進(jìn)行提取。

4 結(jié)論

本研究建立了止咳寶片的HPLC指紋圖譜,標(biāo)定了21個共有指紋峰,指認(rèn)了8種特征成分并對13個峰進(jìn)行了藥材歸屬,用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價軟件(2004A版)”對20批止咳寶片進(jìn)行相似度評價,相似度為0.941～0.999,并確定了共有峰的相對保留時間比值、相對峰面積比值的范圍。

綜上所述,該方法簡便、可靠、穩(wěn)定性好,能較全面地反映止咳寶片的內(nèi)在化學(xué)成分,對現(xiàn)有執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行補(bǔ)充,可有效評價止咳寶片的質(zhì)量。