王海波

（梁山縣畜牧獸醫(yī)事業(yè)發(fā)展中心，山東 濟寧 272600）

牛卵母細胞體外受精是指在脫離母體的情況下，人為創(chuàng)造母牛體內繁殖條件，在牛體外完成精卵結合，培育出受精卵并在體外培養(yǎng)至桑椹胚或是囊胚階段，將胚胎移植到母牛體內孕育胎兒。體外受精是繁育犢牛的重要技術，在牛繁殖領域應用普遍，涉及到的技術有牛卵母細胞的采集、成熟培養(yǎng)與判斷，牛精子的篩選、獲能，以及具體的受精操作等。針對技術應用關鍵節(jié)點及技術參數(shù)、操作細節(jié)的分析研究，最終達到獲取高質量胚胎的目的，助力于養(yǎng)牛業(yè)的高質量發(fā)展。

1 牛卵母細胞體外采集與培養(yǎng)技術

1.1 牛卵母細胞體外采集技術

1.1.1 采集方式 常用的動物卵母細胞采集方式如下：（1）直接采集成熟的卵母細胞，采用超排技術從動物的輸卵管采集，但不適用于牛這種大型動物；（2）活體采卵，選擇繁殖性能優(yōu)秀的母牛，借助腹腔鏡直接采集，對采集母牛的繁殖性能影響較??；（3）從屠宰場獲取，宰殺母牛后直接采集牛卵巢。該采集方式簡單、直接、成本低，可大批量采集。

1.1.2 采集技術 在從屠宰場獲取牛卵巢后，將其放入保溫瓶中，瓶中事先裝入用生理鹽水稀釋的硫酸慶大霉素，溫度大約是30 ℃，用于保持牛卵巢的新鮮度。在1 h 內完成卵泡的收集，在實驗室環(huán)境下，使用生理鹽水清洗干凈牛卵巢，然后使用注射器直接吸取卵泡，獲取卵泡液，準備進行體外成熟培養(yǎng)。

1.2 體外成熟培養(yǎng) 使用體視顯微鏡篩選質量好的卵母細胞用于體外成熟培養(yǎng)，將篩選出的卵母細胞放入培養(yǎng)液中，培養(yǎng)液中含有17-E2 的中央記憶型T 細胞1.5 μg/mL；胎牛血清10%，促黃體生成素20%；卵泡刺激素20 μg/mL。將培養(yǎng)液放入經(jīng)過溫度校正后的培養(yǎng)箱中，溫度調整至38～39 ℃，氣象條件為5%的CO2，培養(yǎng)時間22～24 h，需根據(jù)牛卵母細胞采集時的成熟情況，適當延長1～2 h，但不可超過26 h，一旦超過牛卵母細胞將進入老化期。

1.3 體外成熟判定 在培養(yǎng)24 h 后進行牛卵母細胞的成熟檢查，當其進入第二次減數(shù)分裂中期則判定為成熟。由于牛卵母細胞成熟需經(jīng)歷第一次與第二次減數(shù)分裂期，整個成熟過程復雜，成熟判定難度較大。因此一般情況下以生發(fā)泡破裂或是卵丘細胞擴展為判斷標準，以顯微鏡檢查卵丘細胞擴展為例，1 級成熟卵，卵丘細胞擴展程度超過裸卵直徑的3 倍，2 級則是2 倍，3 級為輕度擴展，大于3 級的情況下則可判定牛卵細胞成熟，具備進行體外受精的條件。

2 牛精子體外獲能技術

牛精子體外獲能是提高受精率的重要方式，只有其在母牛的生殖道內停留一段時間，在適宜的溫度、pH 值、滲透壓等條件下，牛精子發(fā)生一系列的變化后獲取受精能力。如果直接將精子與牛卵母細胞結合，牛精子在未獲能的情況下，受精率非常低。所以在牛卵母細胞體外受精過程中，精子體外獲能技術的應用是其中的關鍵環(huán)節(jié)，在體外環(huán)境下誘導牛精子獲能，進一步的培養(yǎng)其受精能力。

2.1 影響獲能因素 精子體外獲能技術是創(chuàng)造與精子體內獲能相似的條件，促進牛精子正常的生理與生行反應。通過牛精子體內獲能過程的分析，確定了如下影響牛精子獲能因素：（1）精子來源，牛精子獲能時間大約為1 h，牛采精部位的不同會直接影響到牛精子獲能，在精子體外獲能操作過程中，需重點關注該影響因素。

（2）溫度，牛精子所處獲能環(huán)境細微的溫差變化對精子獲能有著一定的影響，經(jīng)過大量的實踐發(fā)現(xiàn)，牛精子體外獲能最佳溫度是38.5～39 ℃，大部分哺乳動物是37～38 ℃。

（3）pH 值，最佳pH7.4～8.0，偏高會減少體外獲能時間，過高則會殺死精子，偏低則增加獲能時間。

（4）滲透壓，滲透壓在295～315 mOsm/L 的條件下，牛精子體外獲能效果最好。

（5）鈣離子載體，其對牛精子頂體反應有著積極作用，有助于糖酵解，為精子運動提供充足的能量。鈣離子載體與鈣離子形成復合物，進入精子促進其頂體反應。但如果鈣離子載體濃度過高，作用過于強烈，作用時間過長會引起精子死亡。

（6）氨基多糖，氨基多糖有利于鈣吸收，促進牛精子發(fā)生頂體反應。但氨基多糖的類型不同，影響著牛精子的獲能水平。比如在牛精子液體中添加肝素10～50 μg/mL，處理10～50 min，誘導牛精子體外獲能效果良好。

（7） 高離子強度液，使用滲透壓為380 mOsm/L 的高離子強度液氯化鈉處理牛精子，置換精子表面的抗原物質，刺激牛精子的頂體反應。

（8）咖啡因，具有抑制環(huán)腺苷酸二酯酶的作用，提升精子活力，與鈣離子載體、肝素等聯(lián)合運用，可增加牛精子獲能的水平。

（9）血清白蛋白，其為大分子物質，在處理牛精子過程中，與精子膜中的膽固醇結合，減少了精子脂肪，釋放精子活力，提高牛精子的受精率。

2.2 精子篩選方法 未經(jīng)處理的牛精液中含有一些有害物質，采用精子預處理方法去除其中的精清、死精子、弱精子等，篩選出適合體外受精的精子，以改善精子獲能。比較常用的處理方法有精子上浮法、Percoll 密度梯度分離法、離心洗滌法等。精子上浮法預處理較為簡單，解凍精子后放入TALP培養(yǎng)液中，靜置大約1 h，提取上浮的精子。Percoll密度梯度分離法，借助Percoll 大分子硅膠顆粒離心處理，平衡分離精子，使不同密度的精子分布在不同密度的梯度中。離心洗滌法適用于冷凍精液，主要是去除冷凍保護劑與精漿蛋白，但在洗滌過程中容易損傷精子。

2.3 獲能操作方法 牛精子體外獲能選用BO 液，在其中添加25 μg/mL 肝素鈉，6 μg/mL 牛血清白蛋白，培養(yǎng)液pH 值調整至7.6。采用精子上浮法篩選出優(yōu)質精子70 μL，制作成精子懸浮液。在培養(yǎng)皿上制作3 個100 μL 的受精液微滴，每個微滴上滴入3 μL 的精子懸浮液，然后放入CO2濃度為5%，38℃的培養(yǎng)箱中，牛精子持續(xù)獲能60 min。

2.4 檢測精子質量 在牛精子獲能操作過程中，使用顯微鏡檢測牛精子獲能情況。一方面是精子獲能時檢測，在顯微鏡下可觀察到精子非?；钴S，尾部活動明顯；另一方面是精子獲能后檢測，精子在獲能后，頭部曲線運動，尾部鞭打有力，幅度加大，表現(xiàn)為超激活運動。

3 牛卵母細胞體外受精技術

3.1 體外受精原理 體外受精是成熟牛卵母細胞與獲能牛精子的結合過程，促使牛精子順利進入牛卵母細胞，最終形成胚胎。受精的基本原理是人為創(chuàng)造牛體內受精條件，經(jīng)過對精子的離心洗滌、上浮處理后，獲取高質量精子，獲能后與成熟卵母細胞共同放入受精液中，促進精卵相遇，完成原核發(fā)育。

3.2 精卵比例把控 牛卵母細胞體外受精采用微滴（包含10～15 個卵母細胞），微滴大小在50～200μL，精子濃度為0.64～1.0×106個/mL。在牛正常體內受精的情況下，精卵的比例一般是1～15:1，在體外授精的情況下，通過精卵比例的換算，確定精卵比例在10000～20000:1，所以采用了上述的卵母細胞個數(shù)與精子濃度。如果精子濃度過低，直接降低受精率，過高則會提升多精受精的概率，降低囊胚發(fā)育的質量。

3.3 精卵作用時間控制 體外受精選用的受精液不同，精卵作用的時間會有較大的差異，比如在BO液中大約是7 h 左右，在TALP 液中大約是19 h，少于16 h 會降低受精的質量。在體外受精研究中，有的人使用TALP 作為受精液，精卵作用5 h 后，提取出卵母細胞，然后放入早期培養(yǎng)液中，以此避免水解酶對受精卵的損傷，并且精卵共同孵育時間過長，會增加多精子受精量。所以在使用TALP 受精液時，孵育時間不可少于18 h，但不可超過24h。

3.4 體外受精操作方法 首先取出培養(yǎng)成熟的牛卵母細胞，放入受精液中洗滌4 次；其次平衡處理獲能牛精子，制作成懸浮液微滴，精子濃度為0.8×106個/mL，接著在每個微滴上添加100 μL 卵母細胞液，保證每個精子微滴上有10～15 個卵母細胞；再次，將放有精卵微滴的培養(yǎng)皿放入培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)箱中CO2濃度為5%，濕度為100%，溫度為38℃，如果是BO 受精液培養(yǎng)時間6～8 h，TALP 受精液培養(yǎng)時間20～24 h。培養(yǎng)過程中使用顯微鏡觀察受精卵的卵裂情況。在體外授精中需注意把握好精卵相遇的時間，最好是精子發(fā)生頂體反應時與卵子相遇，以確保精子順利進入牛卵母細胞。牛卵母細胞體外受精還可直接采用顯微鏡進行操作，在顯微鏡下將精子注入牛卵母細胞中，直接完成受精，在精子數(shù)量有限的情況下適合采用該方法。

3.5 受精檢測與判斷 卵裂是判斷牛卵母細胞體外受精是否成功的依據(jù)，牛卵母細胞在沒有受精的情況下，卵母細胞的周隙很小，在受精后周隙增加，但有的老化卵也會出現(xiàn)該現(xiàn)象，需要繼續(xù)培養(yǎng)，觀察囊胚的發(fā)育情況。牛卵母細胞體外受精受到人為操作、培養(yǎng)環(huán)境與條件的影響，出現(xiàn)異常受精現(xiàn)象，常見的有多精受精、胚胎染色體異常等，應在受精階段做好受精檢測與判斷，及時發(fā)現(xiàn)受精異常問題，以提高受精成功的概率。

3.6 體外受精注意事項

3.6.1 注意解決多精受精問題 在牛卵母細胞成熟判定中，主要的依據(jù)是原核發(fā)育情況，但原核成熟不是牛卵母細胞成熟判定的唯一標準，還需判斷細胞質、透明帶等的成熟情況，以此方可保證精卵之間的正常作用和變化，形成對多精的防御，避免多個精子在牛卵母細胞中生理變化。在體外受精過程中，可適當增加牛卵母細胞的培養(yǎng)時間，確保完全成熟，或嚴格控制受精時精子的密度，以及進行受精液中影響精子活力物質的調整，以降低多精受精的發(fā)生概率。

3.6.2 避免胚胎發(fā)育阻滯的發(fā)生 胚胎發(fā)育阻滯是體外受精面臨的難點，一般好發(fā)生在胚胎發(fā)育早期，主要的原因是胚型基因激活滯后，導致胚型基因激活失敗。為了避免發(fā)育阻滯的出現(xiàn)，在完成牛卵母細胞受精后，利用中間受體（兔或綿羊的輸卵管）培養(yǎng)受精卵至囊胚階段，然后再進行移植操作，也可采用“TCM199+血清”與體細胞（輸卵管上皮細胞）培養(yǎng)受精卵，以及時有效的激活胚型基因。

4 結 語

牛卵母細胞體外受精是胚胎移植的前提，技術的應用關系到胚胎移植后的成長發(fā)育情況。所以通過對牛卵母細胞體外受精技術的深入分析研究，確定影響牛卵母細胞體外成熟培養(yǎng)的因素，進行牛卵母細胞采集、培養(yǎng)、受精等操作過程的優(yōu)化調整，逐步完善牛卵母細胞體外受精技術體系，以避免牛卵母細胞、精子在體外受精操作過程中遭到損壞，提高受精率，以為牛繁殖領域輸送更多基因優(yōu)秀的胚胎。