李 健

（四川省屏山縣老君山國家級自然保護區(qū)保護中心，四川 屏山 645350）

鳥類的親緣關系不能只根據(jù)鳥類的外形和行為來判斷，比如鮮艷的蜂鳥和褐色的歐夜鶯這兩種迥然不同的鳥類就有親緣關系。有些鳥類差異過大，從未被聯(lián)想在一起，但科學證明它們的確是近親，例如常見的鸚鵡和不常見的鳴鳥。而那些行為習慣較為相似的鳥類，比如獵隼和其他食肉猛禽，在基因上可能沒有關聯(lián)性。為闡述分子生物科學在鳥類親緣關系領域的應用，本文簡要介紹了幾種生物分子技術。

1 同工酶和蛋白電泳技術

隨著蛋白質電泳技術的發(fā)展，人們對蛋白質的多態(tài)性進行了深入的研究。該方法利用特定的電泳載體，將同工酶和非酶體蛋白的電荷性進行區(qū)別，分離出不同的基因座，或相同位點的不同等位基因，以實現(xiàn)對基因型的識別。傳統(tǒng)的同工酶檢測技術是通過橫向切片的淀粉凝膠電泳法或高分辨率的縱向板狀聚丙烯酰胺凝膠電泳法來實現(xiàn)的（見圖1）。試驗必須在低溫環(huán)境中進行，需確保樣品的新鮮度或利用低溫冷凍組織，再進行萃??；電泳時要確保環(huán)境溫度適宜，在低溫操作過程中維持酶和蛋白的活性。蛋白質電泳技術僅能探測到編碼蛋白的基因位點，不能測出某些潛在的變異性，可能會低估遺傳變異程度，這對研究近親群體的遺傳差異有不利影響；而且，可分析的同工酶種類也很少。雖然有以上缺點，但其成本低、設備簡單、操作快捷，在基因多樣性的研究中仍有廣闊的應用前景。

圖1 水平式（A）和垂直式（B）平板凝膠電泳圖解

2 隨機擴增多態(tài)DNA 分析

隨機擴增多態(tài)DNA 技術是一種新的DNA 分子結構分析方法。該方法基于PCR 技術，以10 bp的短寡核糖核酸單鏈作為引子，且這種核糖核酸單鏈是按照堿基順序隨意排序的，通過這種方法可使基因組DNA 擴增，便于利用PCR 技術對擴增物進行試驗和觀察。然后用聚丙烯酰胺凝膠或瓊脂糖凝膠電泳法分離擴增物，用溴化乙錠染色，對其DNA片段進行多態(tài)性分析。RAPD 技術能快速檢測DNA的多態(tài)性，無需對該品種進行任何分子生物學的研究，且檢測效率高，樣品用量少，靈敏度高，操作簡單快捷，成本低，所以能在近親樣品中擴大不同的帶型。這項技術自威廉姆斯和威爾士兩個研究小組于1990 年共同開發(fā)以來，已經(jīng)在遺傳多樣性、分類和進化等領域得到了廣泛的應用。但是，RAPD 技術的，應用也有不足之處，該技術對環(huán)境要求較高，反應易受外界因素影響，重復性和可比性較差，經(jīng)濟效益一般。

3 DNA 序列分析

DNA 一級序列是基因遺傳多樣性的根本體現(xiàn)，是一種最直接的遺傳反映。PCR 技術的問世降低了科學研究人員的工作量，使PCR 產(chǎn)物的直接測序過程不再復雜繁瑣；還使DNA 序列分析結果更適合于揭示群體的差異。在DNA 序列分析法中，需要對動物線粒體DNA（mtDNA）進行分析，它是一種共價閉環(huán)的雙鏈DNA，它是一種以母系遺傳為主的獨立復制體系，進化速度是單拷貝核DNA 的5～10倍，已經(jīng)成為近緣物種與種內群體遺傳關系研究的重要標志，因此，經(jīng)常利用mtDNA 序列來分析鳥類的親緣關系。

路基尼和蘭迪利用mtDNA 調控區(qū)進行序列分析，對70 只來自不同區(qū)域的歐洲石雞進行了研究。索倫森等人也從一種已絕跡的鳥類的骨頭中提取mtDNA，用PCR 技術對其進行了擴增，并對其序列進行了序列分析。再比如，內蒙古大學生命科學院對12 種雀形目鳥類進行了四種堿基比例電泳檢測，獲得12 對SrRNA 序列，通過實驗過程中的保守位點、轉換位點、顛換位點的計算，得到A、T、G、C四個堿基的變異具情況（見表1）。最后再利用MEGA 軟件進行比對，測算出這12 種雀形目鳥類的遺傳距離。

表1 12SrRNA 序列三位點變異

最后得到的結果較為準確，比如長尾山雀到山雀科鳥類的距離是0.1114～0.1198；白腰朱頂雀與白翅交嘴雀的遺傳距離為0.0028；獵隼到長尾山雀的遺傳距離是0.5599......

4 DNA 指紋分析

DNA 指紋的研究建立在 DNA 序列中的高變區(qū)上，而這種高變區(qū)又叫做“小衛(wèi)星DNA”。杰弗里斯等人的研究表明，在不同的DNA 片段中，小衛(wèi)星DNA 的復制單元具有不同的長度和順序，但其核心的片段是同一的。不同的群體間存在著明顯的差異，DNA 探針與含有核心序列的小衛(wèi)星DNA 雜交，形成含多條圈帶的雜交圖譜，因為不同個體之間的雜交圖譜不同，表現(xiàn)出個體特異性，而且像人類的指紋一樣獨一無二，因人而異，所以我們稱之為DNA 指紋，其構建過程（見圖2）。

圖2 DNA 指紋的構建過程

相對于小型衛(wèi)星，基因組具有更多的隨機分布的微衛(wèi)星，因而可以提供更多的隨機分布的分子遺傳標記。DNA 指紋圖譜的特征是：多位點性、高變異性、基因結構簡單、遺傳穩(wěn)定性好，而多位點DNA指紋圖譜包含許多不同的圖帶，技術檢測與數(shù)據(jù)分析方面都比較復雜。要想簡化數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析，可以利用DNA 指紋分析，一些小、微型衛(wèi)星探針分別與各自的等位基因進行雜交，就會得到一個包含1～2 條圖帶的圖譜，即DNA 指紋圖樣，這時若一次僅對個別小、微衛(wèi)星位點進行分析，統(tǒng)計起來就會比較省力、簡便。

PCR 是DNA 聚合酶鏈反應，可以在細胞外大規(guī)模進行DNA 的增殖的新型技術手段。當難以得到傳統(tǒng)Southern 雜交所需的DNA 數(shù)量時，可以通過PCR 技術進行DNA 的擴增（見圖3）來滿足試驗需求。在對微衛(wèi)星、小衛(wèi)星進行測序后，利用PCR技術對其進行特異性擴增，從而確定其變異程度。采用PCR 技術和局部酶切技術，可以對多個重復單位進行多次變異分析。DNA 指紋分析技術不僅能夠有效研究鳥類親緣關系，在人類親子鑒別中也具有很大的實用意義，排除基因突變，后代DNA 指紋圖上的每一條帶都可以在父親或是母親的遺傳圖譜上找到，而在后代中往往會有少數(shù)由遺傳變異所形成的新帶。

圖3 PCR 技術進行DNA 擴增的過程示意圖

5 結 語

所述幾種鳥類親緣關系生物學驗證方法各有利弊，要結合實際情況和實驗目的，選用最合適的方法。在不改變試驗參數(shù)和標準的前提下，為保證試驗的可靠性可以采用多種不同的組合方法。雖然上述方法可以幫助我們對鳥類的親緣關系、生殖特性等進行準確的研究，但從分子生物學的角度來看，結論往往存在不完善之處，所以必須將其應用于實際的宏觀生物學研究中。隨著分子生物學技術的不斷發(fā)展，其在鳥類科學領域的應用將會越來越廣泛。