劉 聰，董文飛，蔣克明，周武平，張 濤，黎海文*

(1.中國科學(xué)院 蘇州生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)研究所，江蘇 蘇州 215163；2.中國科學(xué)院大學(xué),北京 100039)

1 引 言

微滴數(shù)字PCR是近年來發(fā)展十分迅速的新一代定量PCR技術(shù)[1]。目前微滴數(shù)字PCR中常見的信號(hào)檢測方法為流式檢測法。流式檢測法利用流式細(xì)胞儀的原理，將一個(gè)個(gè)液滴依次經(jīng)過光學(xué)或電子探測器，通過檢測標(biāo)記的熒光信號(hào)逐個(gè)分析液滴，具有背景熒光強(qiáng)度低，識(shí)別算法簡單等優(yōu)點(diǎn)。但是，該方法光路復(fù)雜、成本高昂，而且難以與儀器前端的微滴生成模塊、PCR擴(kuò)增模塊集成，在數(shù)字PCR集成化和低成本化的趨勢(shì)下顯得后繼乏力[2]。近年來，數(shù)字影像技術(shù)的發(fā)展讓人們能獲取高質(zhì)量的熒光圖像，這使得基于數(shù)字熒光圖像進(jìn)行微滴識(shí)別的平面探測法越來越受到人們的歡迎。

目前，基于平面探測法的微滴識(shí)別存在以下難點(diǎn)。首先，由于激發(fā)熒光的強(qiáng)度較弱，通常需要較長的曝光時(shí)間才能獲得可用于識(shí)別的圖像，即便如此，微滴熒光圖像的亮度和對(duì)比度與明場圖像相比明顯偏低。其次，圖像中微滴可以分為含有目標(biāo)核酸分子的陽性微滴和不含目標(biāo)核酸分子的陰性微滴兩類。陽性微滴的熒光強(qiáng)度較強(qiáng)，可以輕易地與背景分開，但陽性微滴會(huì)對(duì)周圍背景區(qū)域和陰性微滴產(chǎn)生干擾，例如多個(gè)陽性微滴包圍一個(gè)陰性微滴，則有可能造成該陰性微滴熒光強(qiáng)度的被動(dòng)提高；陰性微滴的熒光強(qiáng)度較弱，微滴內(nèi)部的熒光強(qiáng)度僅略高于背景，具有低亮度、低信噪比的特點(diǎn)。這些特點(diǎn)對(duì)識(shí)別微滴提出了挑戰(zhàn)，因此，有必要對(duì)熒光圖像中的微滴識(shí)別方法進(jìn)行研究。

現(xiàn)有的針對(duì)圓形物體的圖像識(shí)別方法通常分為以下3步：(1)通過預(yù)處理盡可能地去除圖像中存在的偽跡或噪聲；(2)將圖像分割為背景和前景；(3)將重疊或黏連的顆粒區(qū)分開。文獻(xiàn)[3-6]報(bào)道了一些基于顯微圖像的顆粒計(jì)數(shù)方法，但均為對(duì)可見光源下的圓形顆粒圖像進(jìn)行識(shí)別，無法直接應(yīng)用到含有大量陰性微滴、圖像信噪比低的熒光圖像中，因此有必要對(duì)熒光圖像中的微滴識(shí)別方法進(jìn)行研究。本文提出一種基于自適應(yīng)閾值分割和改進(jìn)分水嶺分割的熒光微滴自動(dòng)識(shí)別方法，針對(duì)圖像中含有的大量陽性和陰性熒光微滴進(jìn)行準(zhǔn)確、快速、高通量的識(shí)別，從而提高檢測精度。

2 基于距離變換的改進(jìn)分水嶺分割方法

2.1 圖像增強(qiáng)

為了改善圖像的視覺效果，通常需要對(duì)圖像進(jìn)行一系列調(diào)整以增強(qiáng)圖像的整體或局部特性，增大圖像中不同信息之間的差別，滿足后續(xù)分析的需要。圖1為微滴熒光圖像示例，分辨率為320×240。從圖中可見，整張圖像的亮度明顯偏暗。雖然陽性微滴可以比較清楚地看到，但陰性微滴僅比背景值略高，整體灰度值較低，這使得常見的閾值分割方法難以奏效。因此，圖像增強(qiáng)的目的主要在于提高暗部的對(duì)比度。

圖1 微滴熒光圖像示例 Fig.1 A droplets fluorescence image

本文利用直方圖均衡化對(duì)圖像進(jìn)行非線性拉伸，擴(kuò)大暗部的灰度差別，增強(qiáng)陰性微滴與背景的對(duì)比度，達(dá)到對(duì)比度增強(qiáng)的效果。直方圖均衡化無需確定變換函數(shù)系數(shù)，計(jì)算量小，結(jié)果簡單可靠，缺點(diǎn)是可能會(huì)出現(xiàn)因灰度級(jí)合并造成圖像部分細(xì)節(jié)信息丟失的情況，導(dǎo)致背景噪聲強(qiáng)度增加，有用信號(hào)的對(duì)比度降低，此時(shí)，需要使用平滑濾波器對(duì)圖像進(jìn)行平滑[7]。

目前使用較多的空間域平滑濾波器可以分為線性濾波器和非線性濾波器兩類，前者包括高斯濾波、均值濾波等濾波器，后者以中值濾波器為代表。微滴熒光圖像具有兩個(gè)特點(diǎn)：(1)圖像中的背景噪聲主要為高斯噪聲；(2)微滴間的填充部分受到微滴熒光強(qiáng)度的直接影響。中值濾波是應(yīng)用廣泛的非線性濾波器，但其效果依賴于濾波窗口的大小，其本質(zhì)上犧牲了圖像分辨率。近年來出現(xiàn)了一些基于中值濾波的改進(jìn)算法，如但唐仁等人[8]的極值中值濾波器。這些濾波器較傳統(tǒng)中值濾波器有所改進(jìn)，但在實(shí)際應(yīng)用中仍有各自的局限性。受熒光的影響，中值濾波還可能擴(kuò)大陽性微滴周圍背景噪聲的范圍，導(dǎo)致微滴黏連，這就決定了中值濾波并不適合處理微滴熒光圖像。高斯濾波是一種根據(jù)高斯函數(shù)的形狀來選擇權(quán)值的線性平滑濾波器，掩模中心的權(quán)重比其他任何像素的權(quán)重都大，而距離掩模中心較遠(yuǎn)的像素就顯得不太重要。相比較于均值濾波，高斯濾波在較好地處理高斯噪聲的同時(shí)，減小了平滑對(duì)邊緣的模糊效應(yīng)，更適用于對(duì)熒光微滴圖像平滑處理。圖2是圖像經(jīng)高斯濾波后的結(jié)果。

圖2 預(yù)處理后的示例圖像(a)及其灰度分布(b) Fig.2 Preprocessed sample image(a) and its gray distribution(b)

2.2 圖像分割

基于微滴熒光圖像進(jìn)行微滴識(shí)別時(shí)，圖像分割是需要解決的重要問題，其目的是將微滴從圖像背景中分離出來。目前，常用的圖像分割方法主要有基于閾值的分割方法、基于區(qū)域的分割方法、聚類分割法和基于模型的分割方法[9]等。其中基于閾值的圖像分割法具有簡單、易實(shí)現(xiàn)、性能穩(wěn)定的特點(diǎn)，是目前應(yīng)用最廣泛的分割方法[10]。

從預(yù)處理后的示例圖像的灰度直方圖中可以看到，預(yù)處理后圖像的灰度分布為三峰分布，分別對(duì)應(yīng)于陽性微滴、陰性微滴和背景。如果直接使用傳統(tǒng)的二分法分割閾值，由于陽性微滴和陰性微滴的比例無法確定，將有較大幾率導(dǎo)致算法將陰性微滴和背景噪聲一起忽略。為此，通過二次分割法將微滴從背景中識(shí)別出來。首先，盡可能地去除背景噪聲。統(tǒng)計(jì)經(jīng)過預(yù)處理后的圖像Iprep的灰度分布曲線，平滑處理后查找其波谷中灰度值最低的TH1。使用TH1作為熒光背景與陰性微滴的分界，將所有低于TH1的像素置零，得到一次分割后的圖像Ith1。經(jīng)過一次分割后，絕大部分背景噪聲被去除。然后，使用局部自適應(yīng)閾值法將Ith1再次分割，得到二值化的圖像Ith2。局部自適應(yīng)閾值法僅對(duì)指定像素周圍鄰域內(nèi)的灰度值進(jìn)行比較，減少了鄰域外光照不均勻等圖像退化的干擾，對(duì)密集液滴的區(qū)分效果較基于全局灰度分布分割的Otsu法更好。

圖3是經(jīng)過二次閾值分割后得到的微滴二值化圖像，其中(a)為本文方法結(jié)果,(b)為Otsu法，可見Otsu法雖然能夠較好地去除背景噪聲，但是微滴之間存在大量黏連，這給下一步的識(shí)別造成了困難；本文方法能夠排除絕大部分噪聲，但微滴之間仍存在一些黏連，在下面的識(shí)別過程中將進(jìn)一步將黏連的微滴區(qū)分開。

圖3 本文方法分割后的示例圖像(a)和Otsu法分割的示例圖像(b) Fig.3 Segmented sample images obtained by proposed method(a) and Otsu method(b)

2.3 改進(jìn)的分水嶺分割算法

經(jīng)過閾值分割后微滴基本上與背景噪聲分離開，但由于熒光間的相互影響，二值化圖像中仍大量存在微滴黏連現(xiàn)象，對(duì)黏連微滴的分割也是熒光微滴圖像分割中最棘手的問題。目前，已有多種有效的黏連顆粒分割方法，包括邊緣檢測分割法、分水嶺分割法、主動(dòng)輪廓模型法及形態(tài)學(xué)分割法等[11]。邊緣檢測法分割圖像時(shí)，通常利用梯度信息顯示目標(biāo)邊緣的線條，但在圖像質(zhì)量退化嚴(yán)重的情況下這些線條往往不能準(zhǔn)確地描繪目標(biāo)的輪廓。基于形態(tài)學(xué)的黏連分割，通常釆用腐燭、膨脹等操作，這對(duì)于黏連比較嚴(yán)重的目標(biāo)分割效果并不是特別理想?；跀?shù)學(xué)形態(tài)學(xué)的分水嶺分割算法[12]具有單像素寬、輪廓位置準(zhǔn)確、連通封閉、計(jì)算量小的優(yōu)點(diǎn)，是目前使用最為廣泛的一類分割方法。

傳統(tǒng)分水嶺分割算法直接使用梯度圖像或者距離變換后的二值圖像中的區(qū)域極小值作為標(biāo)記點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)分割。由于二值化后的形狀不規(guī)則或細(xì)胞黏連等原因，標(biāo)記點(diǎn)可能無法與每個(gè)微滴一一對(duì)應(yīng)，導(dǎo)致過分割或欠分割現(xiàn)象。為了降低錯(cuò)誤分割的幾率，本文對(duì)傳統(tǒng)的基于距離變換的分水嶺分割方法做了如下改進(jìn)：首先，基于熒光微滴形狀類圓、尺寸較均勻這一先驗(yàn)假設(shè)，定義一個(gè)表征圖像黏連程度的函數(shù)如下：

(1)

其中，連通域的區(qū)域面積為Ai，周長為Pi連通域所占的長度和寬度分別為hi、wi，α,β為系數(shù)，r0為預(yù)設(shè)的有效微滴半徑。黏連度函數(shù)fi根據(jù)hi、wi的不同將黏連的可能性表示為[0,1]間的實(shí)數(shù)值，fi越接近1，表示連通域越可能為黏連微滴；越接近0表示越不可能為黏連微滴。若hi、wi均小于βr0，則連通域小于單個(gè)有效微滴尺寸，因此可以肯定并非黏連微滴；如果fi、wi均大于αr0，則連通域顯著超出了單個(gè)有效微滴尺寸，可能為黏連微滴或尺寸過大的無效微滴，根據(jù)連通域面積與外接圓面積之比確定fi；如果hi、wi的取值在二者之間，那么說明連通域所占據(jù)的空間小于兩微滴直接相連，可能為黏連嚴(yán)重的多個(gè)微滴或有效微滴。由于黏連嚴(yán)重的多個(gè)微滴矩形度更高，使用連通域面積與外周長的平方之比作為fi的參數(shù)值。根據(jù)隸屬度函數(shù)值區(qū)分連通域是否為黏連的微滴，若為黏連微滴，則對(duì)連通域采用距離變換。利用先驗(yàn)知識(shí)事先區(qū)分連通域，可以減少由于噪聲導(dǎo)致二值化后非黏連微滴在分水嶺算法作用下的誤分割。

其次，對(duì)距離變換后的地形圖Idist進(jìn)行H-minima變換。H-minima變換是一種利用先驗(yàn)知識(shí)抑制噪聲的有效方法，通過抑制地形圖中小于參數(shù)h的局部極小值點(diǎn)去除局部極小值中較低點(diǎn)引入的偽標(biāo)記[13]。H-minima方法中h值的選擇非常關(guān)鍵，如果h過小，虛假標(biāo)記點(diǎn)無法得到有效抑制，將產(chǎn)生過分割現(xiàn)象；h過大，某些真實(shí)標(biāo)記點(diǎn)也被抑制掉，從而產(chǎn)生欠分割現(xiàn)象。本文中根據(jù)Idist中局部極小值的統(tǒng)計(jì)特性，選取Idist中最大值的20%作為H-minima變換中的h值。

通過上述兩種方式的改進(jìn)，可以增加對(duì)偽標(biāo)記的抑制?；谏鲜鲇懻?，改進(jìn)的分水嶺分割算法流程如下：

①統(tǒng)計(jì)待分割圖像中的連通域集合S={Si|i=1,2,…,n}，n為連通域總數(shù)；

②取第i個(gè)連通域，將同時(shí)滿足下述條件的連通域Si認(rèn)為是包含多個(gè)黏連微滴的區(qū)域：

(2)

fi>0.5 ,

(3)

③重復(fù)步驟(2)直到不含任何多微滴連通域；

④計(jì)算所有黏連微滴的歐式距離地形圖Idist；

⑤對(duì)Idist進(jìn)行H-minima變換，利用距離地形圖的局部極小值作為前景標(biāo)記；

⑥使用分水嶺算法分割Si；

⑦將滿足以下條件的區(qū)域識(shí)別為有效微滴，其他所有區(qū)域被認(rèn)為是無效的微滴碎片而去除：

hi∈[Rmin,Rmax] ,

(4)

wi∈[Rmin,Rmax] ,

(5)

fi<0.4 .

(6)

2.4 熒光微滴自動(dòng)識(shí)別算法

綜上所述，如圖4所示，熒光微滴自動(dòng)識(shí)別算法的整體流程可分為如下幾步：

圖4 熒光微滴自動(dòng)識(shí)別算法流程圖 Fig.4 Workflow of fluorescent droplet automatic recognition algorithm

①預(yù)處理，對(duì)圖像進(jìn)行增強(qiáng)和平滑，以提高圖像對(duì)比度，降低圖像噪聲。

②閾值分割，將微滴從圖像背景中分離。

③黏連微滴分割，將圖像中重疊的微滴區(qū)分開來。

④微滴識(shí)別，基于文獻(xiàn)[14]中的方法將微滴分類為陽性和陰性兩類。

圖5為示例圖像的最終識(shí)別結(jié)果。

圖5 最終識(shí)別結(jié)果 Fig.5 Final recognition result

3 實(shí)驗(yàn)和討論

為了驗(yàn)證算法對(duì)熒光微滴的識(shí)別效果，本文在Python3.5中基于python-opencv3.4.0實(shí)現(xiàn)上述算法，硬件配置為Intel i5-6500 3.2GHz CPU,4GB RAM；操作系統(tǒng)為Windows 7 Professional。作為比較，本文將使用人工分割的熒光微滴圖像結(jié)果作為基準(zhǔn)，與經(jīng)典的基于距離變換的分水嶺分割算法[15]進(jìn)行對(duì)照。

為減少PCR擴(kuò)增反應(yīng)引入的退化誤差，在自制的微滴生成芯片上分別生成陽性微滴和陰性微滴。其中陽性微滴使用濃度為30μg/mL的EvaGreen熒光染料與PCR預(yù)混液混合后經(jīng)十字聚焦結(jié)構(gòu)的微滴生成芯片生成，陰性微滴為直接使用PCR預(yù)混液經(jīng)十字聚焦結(jié)構(gòu)的微滴生成芯片生成。二者按照3:2的比例混合后使用熒光顯微鏡(Leica Axio Observer A1，物鏡5X)觀察并獲取熒光微滴圖像，平均微滴直徑為100.4 μm。圖6為分別對(duì)陰性液滴和陽性液滴集中區(qū)域進(jìn)行識(shí)別的結(jié)果。圖6(a)為原始圖像，圖6(b)為直方圖均衡化后的結(jié)果，圖6(c)為本文算法識(shí)別出的液滴，圖6(d)為對(duì)照算法識(shí)別出的液滴。

圖6 熒光微滴的圖像識(shí)別結(jié)果 Fig.6 Image recognition results of fluorescent droplets

從圖6中可見，兩種方法對(duì)陽性微滴的識(shí)別效果都較好，但當(dāng)陰性微滴周圍存在陽性微滴時(shí)會(huì)受其發(fā)射熒光的影響，對(duì)照方法更容易忽略受影響的陰性微滴。此外，經(jīng)過距離變換后使用H-minima變換可較好地抑制偽標(biāo)記點(diǎn)，因此本文方法和對(duì)照方法對(duì)于圖像中的過分割現(xiàn)象處理得都比較好。

對(duì)10幅微滴熒光圖像進(jìn)行同樣的圖像增強(qiáng)和兩步閾值分割，分別考察兩種分割算法對(duì)10幅圖像的陽性微滴和陰性微滴的平均欠分割率、過分割率及識(shí)別正確率，結(jié)果如表1所示。

表1 微滴分割算法性能對(duì)照Tab.1 Performance comparison of different droplet segmentation methods

從表1中可以看到，兩種方法對(duì)陽性微滴的識(shí)別效果都較好，欠分割率和過分割率小于1%。陰性微滴在第一步的圖像分割中部分形變較嚴(yán)重，距離變換后對(duì)應(yīng)連通域的極小值小于h值，導(dǎo)致對(duì)應(yīng)標(biāo)記點(diǎn)被去除，降低了對(duì)照方法的欠分割率，而本文方法在分水嶺分割前將無需分割的大量獨(dú)立微滴分離，大大降低了欠分割的可能性。本文算法識(shí)別陰性微滴的欠分割率為5.32%，遠(yuǎn)低于對(duì)照方法的21.59%。

總體而言，本文方法的平均正確率為97.34%，高于傳統(tǒng)的基于距離變換的分水嶺分割法的85.9%，顯示出本文算法對(duì)熒光微滴具有良好的識(shí)別效果。

4 結(jié) 論

微滴熒光圖像具有低亮度、低對(duì)比度等特點(diǎn)，而傳統(tǒng)的圖像分割方法的識(shí)別正確率較低。因此，本文提出一種改進(jìn)的熒光微滴分水嶺識(shí)別算法。該方法利用局部自適應(yīng)閾值分割提取目標(biāo)，以降低對(duì)圖像灰度信息的依賴，并結(jié)合微滴形狀類圓、尺寸較均勻的特點(diǎn)，定義了黏連度函數(shù)從而降低分水嶺分割中的錯(cuò)誤分割，最后通過一系列實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了本文算法的有效性，并與傳統(tǒng)的距離變換分水嶺分割法進(jìn)行了性能比較。結(jié)果表明，本文算法在保證陽性微滴分割準(zhǔn)確性的基礎(chǔ)上，大大降低了陰性微滴的欠分割率，本文方法的平均正確率為97.34%，高于傳統(tǒng)的基于距離變換的分水嶺分割的85.9%，顯示出本文算法對(duì)熒光微滴良好的識(shí)別效果。

本文算法中各參數(shù)較多，在保證識(shí)別準(zhǔn)確度的前提下盡可能設(shè)計(jì)參數(shù)自適應(yīng)的識(shí)別方法，降低陰性微滴的欠分割率，提高算法對(duì)多種異常微滴圖像的適應(yīng)性，同時(shí)利用其他先驗(yàn)信息進(jìn)一步提高識(shí)別準(zhǔn)確度將是今后工作的研究重點(diǎn)。