徐 盾

（海城市種畜禽監(jiān)督管理站，遼寧 海城 114200）

沙門氏菌是桿狀的革蘭氏陰性兼性厭氧菌，屬于腸桿菌科，是一種非常重要的人畜共患疾病。目前，國內(nèi)外已有大量關于人源、雞源、豬源、食源、沙門氏菌耐藥性的研究，寵物犬源沙門氏菌耐藥情況國內(nèi)鮮有報道。目前，我國寵物數(shù)量不斷增加，人與寵物之間的依賴關系也日益凸顯。寵物行業(yè)的快速發(fā)展，愈來愈多的獸用甚至是人用抗生素被用于寵物疾病的預防和治療。然而，隨著抗生素的廣泛應用，沙門氏菌的耐藥性也愈來愈嚴重，這不僅影響臨床治療效果，而且由于人與寵物的密切接觸，增加了耐藥細菌傳給人類的風險。本研究采用PCR 技術對海城市寵物犬肛門棉拭子進行分離鑒定，并確定分離株的血清型；Kirby-Bauer 紙片擴散法(K-B)測定寵物犬源沙門氏菌分離株對臨床常用藥物的敏感性，并測定blaOXA、sul2、gyrA、gyrB、floR、tetA和tetC 基因，了解錦州地區(qū)寵物犬攜帶沙門氏菌的情況，并從基因水平結合表現(xiàn)耐藥進行藥物敏感性分析，為錦州地區(qū)寵物犬臨床用藥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌株來源犬源沙門氏菌，采自遼寧省海城市寵物門診寵物犬肛門棉拭子。

1.1.2 主要培養(yǎng)基和試劑 緩沖蛋白胨水（BPW）、普通瓊脂培養(yǎng)基均購自青島海博生物技術有限公司。DNA 提取試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司。藥敏紙片購于上?；茖嶒炂鞑挠邢薰?。引物序列由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 方 法

1.2.1 樣本的采集2018 年5～12 月，于海城市6 家寵物醫(yī)院隨機共采集健康犬82 份和患病犬209份，總291 份犬肛棉拭子樣品。

1.2.2 細菌分離、鑒定 無菌操作把肛門棉拭子放入到5 L BPW 增菌液中37 ℃，培養(yǎng)18 h。輕輕搖動培養(yǎng)過的樣品混合物使其均勻，移取1 mL，轉(zhuǎn)種于10 mL TTB 內(nèi)，于42 ℃±1 ℃培養(yǎng)18～24 h。取過夜培養(yǎng)的菌液，按照DNA 提取試劑盒說明提取細菌組總DNA 作為模版。參照文獻[1]合成沙門氏菌引物，invA（5’→3’）：F: GTGAAATTATCGCC ACGTTCGGGC AA，R: TCATCGCACCGTCAAAGGAACC，片段長度為285pb。

PCR 反應體系為25μL：Buffer Mix 12.5 μL，d NTPs 5 μL，上下游引物各1 μL，dd H2O調(diào)整總體積25μL。PCR 反應條件為：95℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR 擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳觀察。

1.2.3 血清型鑒定 依文獻合成我國報道的主要沙門氏菌血清型（O 抗原中B、C1、D 和E1 及鞭毛H抗原H1 相和H2 相）引物，O 抗原（5’-3’）：B 群：F:GCGATTAGAGCATGTATATGGR:CAGTTCCAACT TGATACTCAGT，片段大小為216 pb；C1 群：F：GACATGACTTTGAAATCGGGTA；R:ATTCCTACAC GCACTAATACTG，片段大小為760 pb；D 群：F:GGTAAACTTATCGTCTCCATCA；R:CTTAGCAAGGA AGAGGAACAAT，片段長度為385 pb; E 群:F:CTTT GCTGAGCTAGGTATAAGTA，R:GCTATTCAAAGAC GCTGTATATC，片段長度為1323 pb。H 抗原(5’-3’)：H1 相：F:TGACCCAGAATAACCTGAAC，R:TA ACGCAGTAAAGAGAGGAC，片段長度為1450 pb；H2 相：F:ATGGCACAAGTAATCAACAC，R:TAGTCG GAATCTTCGATACG，片段大小1409 pb。

PCR 反應體系為25 μL，各組分如下Buffer Mix 12.5 μL，d NTPs 5 μL，上下游引物各1 μL，ddH2O 5.5 μL。PCR 反應條件：擴增循環(huán)參數(shù)為：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴增結果經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，紫外凝膠成像系統(tǒng)觀察結果。

1.2.4 藥敏試驗 采用K-B 瓊脂法檢測分離菌對常用16 種抗菌藥物進行藥物敏感性試驗。

1.2.5 耐藥基因檢測 參照文獻合成檢測沙門氏菌5 大類抗生素7 種耐藥基因PCR 引物序列（5’-3’）。B- 內(nèi)酰胺類（blaOXA）：F：ACACAATACCATATCCAACTTCGC，R:AGTGTGTTTAGAATGGTGATC，產(chǎn)物大小876 bp。四環(huán)素類（TetA）：F:TACGGGAGTTTGTTGGA，R: GTATGGAGGATGTGGTTTC，產(chǎn)物大小525 bp；tetC：F: ACTTGGAGCCACTATCGAC，R: CTACAATCCATGCCAACCC，產(chǎn)物大小427 bp?？Z酮類（GyrA）：F: TGCCAGATGTCCGAGAT，R: GTATAACGCATTGCCGC，2 產(chǎn)物大小69bp；gyrB：F:CGCCTCCCAGACCAAAGACA，R: TCACGACCGATACCACAGCC，產(chǎn)物大小448bp?；前奉悾╯ul2）：F: CGGCATCGTCAACATAACC，R:GTGTGCGATGAAGTCAG，產(chǎn)物大小722bp。氯霉素類（floR）：F:TATCTCCCTGTCGTT CCAG，R:AGAACTCCGCCGATCA ATG，產(chǎn)物大小399 bp。

PCR 反應體系為25 μL:Buffer Mix 12.5 μL，d NTPs 1 μL，上下游引物各1 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR 反應條件：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，60℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴增結果經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，于紫外凝膠成像系統(tǒng)觀察結果。

2 結 果

2.1 沙門氏菌分離株的PCR 鑒定及菌株背景

通過PCR 檢測出9 個樣本在285 pb 左右出現(xiàn)明亮的條帶，與預計目的條帶相符，說明成功的分離到9 株沙門氏菌，海城市寵物犬沙門氏菌的攜帶率為3.09%，PCR 電泳圖（見圖1）；9 株沙門氏菌中有7 株來源于1 歲以內(nèi)的犬，占77.8%，且集中在10～11 月份，說明寵物犬攜帶沙門氏菌與年齡和季節(jié)有一定的相關性，9 株沙門氏菌背景見表1。

圖1 9 株沙門氏菌PCR 電泳擴增圖

2.2 沙門氏菌血清型鑒定 PCR 檢測顯示9 株沙門氏菌種有7 株在216 pb 左右出現(xiàn)條帶，有2 株在385 pb 左右出現(xiàn)條帶，對其針對H 抗原進行PCR 檢驗，對其PCR 產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序，并通過基因blast 比對，確定7 株沙門氏菌為鼠傷寒沙門氏菌，2 株為腸炎沙門氏菌。

2.3 表觀耐藥性檢測 藥敏試驗結果顯示9 株對氨基糖苷類（GEN、STR、TOB、AMK、NEO）、大環(huán)內(nèi)脂類（ERY、MID）、磺胺類（SXT）、氯霉素類（CHL）、β- 內(nèi)酰胺類（AML、PEN）、喹諾酮類（NOR、CIP）耐藥率100%，四環(huán)素類（DOC）耐藥率89%，喹諾酮類（LEV）耐藥率11%，β- 內(nèi)酰胺類（CTX）敏感率100%。

2.4 耐藥基因檢測結果 在9 株沙門氏菌分離株的7 種耐藥基因檢測中，共檢出5 種常見耐藥基因，分別是β- 內(nèi)酰胺類blaOXA 基因，磺胺類sul2基因，氯霉素floR 基因，奎諾酮類gyra 和gyrb 基因。檢出率為71.4%（5/7）每株菌對5 種耐藥基因檢出率100%。沒有檢測到四環(huán)素類耐藥基因。

3 討 論

已有許多寵物犬攜帶沙門氏菌報道，王元蘭等對合肥市寵物犬采集的746 份樣本中沙門氏菌進行了調(diào)查，分離率為2.55%，主要以腸炎沙門氏菌為主，其次是德爾卑沙門氏菌。Leahy A M 等對在2013 年5 月至2014 年12 月間對7 個德克薩斯州動物收容所554 只犬糞便樣本進行沙門氏菌的分離鑒定，檢測出27 個陽性樣本，其攜帶率為4.90%；且與腹瀉存在相關性（p=0.09），沙門氏菌的流行率與年齡、性別沒有顯著差異，常見的血清型是Newport 沙門氏菌(22%) 和Javiana 沙門氏菌 (15%)。Willen J.Botha 等對74 只自然感染細小病毒寵物犬和42 只健康犬的糞便樣本進行沙門菌的分離、藥敏試驗和血清分型，共分離到32 株沙門氏菌，感染犬和健康犬的糞便沙門氏菌的攜帶率分別為22%和31%，無統(tǒng)計學差異；且與年齡、體重住院時間之間無顯著的相關性，只有9 株沙門氏菌鑒定出4個血清型，其中4 株Heidelberg 沙門氏菌、2 株Cotia 沙門氏菌、2 株Chile 沙門氏菌、1 株Braenderup沙門氏菌。 本研究表明在海城市寵物犬291 份樣本中，沙門氏菌檢出率為3.09%（9/291），發(fā)病樣本的攜帶率為3.35%，健康樣本攜帶率為2.44%；12 月齡以內(nèi)陽性犬占78%，12 月齡以上的陽性犬占22%，雄性占66.7%，雌性占33.3%；陽性犬檢出沙門氏菌的時間集中分布在9～11 月份。說明錦州寵物犬源沙門氏菌攜帶情況可能與寵物犬年齡和感染季節(jié)有一定的相關性，與性別及健康狀況無關，這一結果也與Willen J.Botha 報道基本一致，但血清型上述文獻報道有一定的差異性。說明寵物犬沙門氏感染不同地區(qū)分離到的血清型存在一定區(qū)域性。寵物犬沙門氏感染年齡在12 個月齡以內(nèi)幼齡犬的原因可能是與缺乏成熟的腸道微生物群有關；同時，幼齡犬免疫系統(tǒng)不夠完善，免疫力低下所致，而隨著年齡的增長，免疫力提高及寵物主人提供良好的環(huán)境和管理條件，致使發(fā)病率下降。

近年來，由于寵物抗生素的不合理使用，導致沙門氏菌耐藥現(xiàn)象越來越嚴重，已成為危害人類健康的一大難題。軒慧勇等從新疆烏魯木齊市77 份寵物糞便中分離到沙門氏菌36 株，除了頭孢噻呋、安普霉素、阿米卡星、硫酸慶大霉素和多黏菌素外，寵物犬源沙門氏菌對其他被檢抗菌藥藥物的耐藥性高達97.0%以上，tetB、blaTEM、blaOXA，qurS、oqxA、oqxB、aac(6’)-Ib-cr、ant(3’)-Ia 和floR 的基因檢出率在97.0%以上，而aadA2 基因的檢出率也在72.0%以上。Victor A 等在2016 年8～10 月西印度群島格林納達144 只非腹瀉犬的糞便樣本中分離到35 株沙門氏菌進行藥敏試驗顯示，對環(huán)丙沙星和頭孢噻呋等人類沙門氏菌病患者目前使用的藥物沒有耐藥性。一個分離株（2.9%）對新霉素有耐藥性，兩個分離株（5.7%）對新霉素有中度敏感性，另一個分離株（2.9%）對四環(huán)素有中度敏感性。Tadesse等對埃塞俄比亞中部地區(qū)人和動物沙門氏菌β-內(nèi)酰胺類和奎諾酮類抗生素耐藥基因檢測是發(fā)現(xiàn)blaOXA 檢出率79.1%，sul2 檢出率30.3%。本研究在對9 株沙門氏菌分離株進行藥敏實驗時發(fā)現(xiàn)，所有菌株對頭孢噻呋均敏感，而對復方新諾明、青霉素、慶大霉素、妥布霉素、亞胺培南和氯霉素耐藥性最強。這可能與臨床用藥和檢測地區(qū)有關，同時，不同國家、地區(qū)在寵物犬治療或藥物預防過程中使用藥物的差異、劑量及不合理應用的因素也不同。對9株沙門氏菌進行7 種耐藥基因檢測，blaOXA、sul2、gyrA、gyrB、floR 檢出率均為100%，表明表型耐藥率高的同時也攜帶著耐藥基因，而本研究中雖未檢測tetA 和tetC 基因，但表型耐藥嚴重。耐藥表型與耐藥基因的存在有密切的關系，因為細菌的耐藥機制相當復雜，耐藥基因的位置（是在質(zhì)粒上抑或是染色體上）、其遺傳結構如何、耐藥基因的表達情況、不同耐藥基因之間的相互作用、細菌生物膜的形成等都會影響細菌對抗生素的耐藥性，細菌對一種藥物的耐藥可能是幾種耐藥基因和耐藥機制共同作用的結果。