張黎

【摘要】? 目的? ? 分析熒光定量聚合酶鏈式反應法（FQ-PCR）應用在乙型肝炎病毒（HBV）檢測中的準確性。方法? ? 選擇2020年1月—2021年6月接診的100例HBV攜帶者，均行FQ-PCR、酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測，對比二者檢測結果。結果? ? 100例HBV攜帶者中“大三陽（模式1）”共24例，HBV-DNA含量平均為（8.24±1.12）copy/mL，陽性率為95.83%（23/24），均顯著高于其他6種模式（P<0.05）；100例HBV攜帶者中“小三陽（模式2）”共31例，HBV-DNA陽性率為83.87%（26/31），均顯著高于3，4，5，6，7模式（P<0.05）；而其他模式在HBV-DNA陽性率及含量方面均無明顯差異（P>0.05）。結論? ? 與ELISA相比較，F(xiàn)Q-PCR更能定量反映HBV復制、感染狀況，有助于早期確診乙型病毒性肝炎，以及判斷傳染性質與監(jiān)測病情，值得推廣。

【關鍵詞】? 熒光定量PCR法；乙型肝炎病毒；準確性

中圖分類號：R446.1? ? ? ? 文獻標識碼：A

文章編號：1672-1721（2023）11-0098-03

DOI：10.19435/j.1672-1721.2023.11.033

乙型病毒性肝炎是臨床常見傳染性疾病，兼具感染率高、傳播途徑復雜、流行面廣等特點[1]。主要因乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）所致，若長期攜帶HBV，容易導致肝臟炎性損傷，甚至誘發(fā)肝硬化、肝衰竭、肝細胞癌等疾病。相關報道指出[2]，目前我國乙肝患者數(shù)量居全世界首位，極大地威脅著國民健康，故需重視乙肝臨床診療工作。近年來，隨著分子生物技術、免疫學的飛速發(fā)展，可以通過聚合酶鏈式反應法（polymerase chain reaction，PCR）、酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）等檢測HBV標志物。且有報道指出[3]，ELISA通過測驗HBV表達蛋白的抗體、抗原，能夠診斷乙肝；但是容易受到HBV翻譯、轉錄功能減弱等的干擾，出現(xiàn)假陰性，導致漏診，影響后續(xù)治療及預后。而PCR作為新型檢驗技術，通過熒光標記處理HBV-DNA，亦能檢驗HBV- DNA的翻譯及轉錄情況，有助于提高檢驗準確性。本文就熒光定量聚合酶鏈式反應法（fluorescence quantitative polymerase chain reaction，F(xiàn)Q-PCR）在HBV檢測中的準確性展開分析，報道如下。

1? ? 資料與方法

1.1? ? 一般資料? ? 選擇2020年1月—2021年6月接診的100例HBV攜帶者，其中男68例，女32例，年齡23～58歲，平均年齡（41.5±10.8）歲，體重49～77 kg，平均（62.5±4.5）kg。納入標準：（1）在就診中發(fā)現(xiàn)HBV；（2）檢查依從性好；（3）知情同意，自愿參加。排除標準：（1）惡性腫瘤疾病者；（2）嚴重內(nèi)科疾病者；（3）凝血功能障礙者；（4）資料不完善者；（5）溝通、認知、精神障礙者；（6）免疫系統(tǒng)疾病者。

1.2? ? 方法? ? 全部入組者均行FQ-PCR、ELISA檢測。（1）FQ-PCR：取晨起3 mL肘靜脈血，采集血液樣本前均空腹8～10 h，將其置入真空惰性分離膠促凝管，離心處理（時間10 min，轉速3 500 r/min），制備血漿標本，之后通過熒光定量分析儀（儀器廠家：杭州安譽科技有限公司；儀器型號：AGS4800型）+熒光定量PCR診斷試劑盒（購自中山大學達安基因股份有限公司）檢測HBV-DNA。（2）ELISA：取晨起3 mL肘靜脈血，采集血液樣本前均空腹8～10 h，之后將血液樣本放置在4 ℃冰箱，時間2 h，再離心處理（時間10 min，轉速3 500 r/min，離心半徑10 cm），將上層血清置入無菌試管備測，檢測乙肝標志物時采用全自動酶免儀（儀器廠家：深圳市愛康生物科技有限公司；儀器型號：Uranus AE150型）+ELISA試劑盒（北京萬泰生物藥業(yè)股份有限公司），包括乙肝表面抗體（HBsAb）、乙肝表面抗原（HBsAg）、乙肝e抗原（HBeAg）、乙肝e抗體（HBeAb）、乙肝核心抗體（HBcAb），于450 nm位置讀取酶標儀吸光度值，得到診斷結果。

1.3? ? 觀察指標? ? 記錄乙肝血清學標志物（HBsAb、HBsAg、HBeAg、HBeAb、HBcAb）結果，再將其陽性結果劃分成7種模式，其中模式1為“大三陽”（HBsAg、HBeAg、HBcAb），模式2為“小三陽”（HBsAg、HBeAb、HBcAb），其他模式分別是：模式3（HBsAg、 HBeAg）、模式4（HBsAb、HBeAb、HBcAb）、模式5（HBsAb、HBeAb）、模式6（HBsAb、HBcAb）、模式7（HBeAb、HBcAb）。FQ-PCR檢測陽性標準為HBV-DNA>1.0×102 IU/mL，ELISA檢測陽性標準為吸光度值>1[4]。

1.4? ? 統(tǒng)計學方法? ? 采用SPSS 23.0統(tǒng)計學軟件分析數(shù)據(jù)，正態(tài)分布的計量資料以x±s表示，采用t檢驗和方差分析，計數(shù)資料以百分比表示，采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2? ? 結果

100例HBV攜帶者中“大三陽（模式1）”共24例，HBV-DNA含量平均為（8.24±1.12）copy/mL，陽性率為95.83%（23/24），均顯著高于其他6項模式（P<0.05）；100例HBV攜帶者中“小三陽（模式2）”共31例，HBV-DNA陽性率為83.87%（26/31），均顯著高于3，4，5，6，7模式（P<0.05）；而其他模式在HBV-DNA陽性率及含量方面均無明顯差異（P>0.05），見表1。

3? ? 討論

乙肝是傳染率高、起病緩慢、傳播途徑廣的病毒性肝炎疾病。相關報道指出[5]，當前我國HBV攜帶者高達9 300萬人，且HBV感染呈現(xiàn)世界性流行。人類因含HBV血液、體液經(jīng)破損黏膜、皮膚進入機體而感染，且傳播途徑包括血制品傳播、母嬰傳播[6-7]。我國母嬰傳播概率較高，約40%～50%的HBV感染人群因母嬰傳播而罹患乙肝。90年代初我國將兒童普種乙肝疫苗作為控制乙肝流行的重要策略[8]，通過幾十年的努力，當前屬于乙肝中度流行國家。盡管如此，由于我國是人口大國，所以當前HBsAg攜帶者仍較多，使得乙肝成為重要的公共衛(wèi)生問題之一。臨床強調對乙肝進行早診早治，以阻止病情惡化，降低病死率。但是由于臨床廣泛應用抗病毒藥物，使得HBV變異株數(shù)量顯著增加，明顯提高了傳統(tǒng)HBV血清學檢測難度[9]，導致檢測可重復性、準確性等均出現(xiàn)一定缺陷，尚需完善檢測方法。

當前臨床可以通過下列方法診斷HBV感染。（1）HBV基因產(chǎn)物：除通過免疫學方法測定HBsAg、HBeAg等，還可依據(jù)免疫組織化學技術（兼具敏感性高、功能與形態(tài)相結合、特異性好、定位準確等優(yōu)勢）、肝臟組織形態(tài)學變化等測定HBV基因產(chǎn)物，進而明確病毒性肝炎是否由HBV感染所致。（2）影像學：如核磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）、計算機X線斷層掃描（computed tomography，CT）以及超聲等檢查脾臟、膽囊以及肝臟等，從而評估有無肝硬化病變、慢性乙肝發(fā)生及進展、占位性病變性質等。（3）病理學：通過肝臟穿刺活檢能夠更為準確、早期觀察肝組織細微病變，評估HBV患者肝臟狀況，從而判斷預后情況、藥物療效等。（4）HBV共價閉合環(huán)狀DNA（covalently closed circular DNA，cccDNA）：HBV cccDNA被徹底清除后意味著慢性乙肝患者被治愈。當前HBV cccDNA技術進展迅猛，且以選擇性FQ-PCR發(fā)展較快，其能用于評估肝細胞內(nèi)HBV cccDNA水平，從而反映免疫功能對HBV的控制情況，從而指導停藥時機。不過若想檢測HBV cccDNA，尚需肝組織活檢，具有一定的創(chuàng)傷性，患者接受度不高，且需進一步明確檢測標準，故推廣難度較大。

本次研究表明，F(xiàn)Q-PCR檢測HBV有較好效果。ELISA是檢測HBV的常用方法，通過檢測血清中特異性抗原與抗體，能夠評估有無HBV感染，加之靈敏度高、價格低廉、操作簡單，所以得到臨床推廣。然而實踐中發(fā)現(xiàn)該方法僅能反映HBV感染免疫應答狀態(tài)，無法定量分析HBV感染程度以及含量等[10]，所以存在一定的局限性；同時檢測結果也易受到標本保存、洗板情況、加樣時有無濺出、血清分離、孵育方式等因素的影響；另外，ELISA需要使用特殊設備，加之難以評估病毒量及感染程度間關系、反應時間長，不適用于急診初篩、門診與無償獻血。

陳春妍[11]、謝玉娜[12]的研究均指出，F(xiàn)Q-PCR能夠有效檢測HBV。本次研究亦發(fā)現(xiàn)FQ-PCR檢測準確率較高。FQ-PCR兼具DNA探針雜交、PCR技術的優(yōu)勢，通過實施閉管、熒光技術檢測，能夠直接探測PCR過程中熒光信號，進而定量、定性評估HBV感染程度，反映其傳染性與復制狀況，有助于醫(yī)師準確評估病情。另外，HBsAg是區(qū)分急性乙肝與健康攜帶者的重要指標，而HBeAg是評估血清有無傳染性的重要指標，若是受檢者表現(xiàn)為大三陽，提示HBV-DNA復制率高且傳染性強。本研究亦顯示，相比大三陽（模式1），小三陽（模式2）的陽性率較低。主要是小三陽患者HBV復制弱、傳染性低，不過仍有HBV-DNA復制，故僅憑血清學難以評定結果，尚需檢測HBV-DNA，從而監(jiān)測病情，以便及時對癥處理。值得注意的是，F(xiàn)Q-PCR也有局限性，例如無法對病原體入侵后機體抗體如何應答作出反映，也無法測定病原體數(shù)量，所以暫時不能取代血清學標志物；不過其檢測結果敏感度高、可靠性強，便于醫(yī)師評估HBV感染狀態(tài)以及病毒DNA復制情況，能夠在早期診斷、評估乙肝傳染性，監(jiān)測治療情況等方面提供參考依據(jù)，所以臨床應用價值仍較高。

綜上所述，與ELISA相比較，F(xiàn)Q-PCR更能定量反映HBV復制、感染狀況，有助于早期確診乙型病毒性肝炎，以及判斷傳染性質與監(jiān)測病情，值得推廣。

參考文獻

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[11]? ? 陳春妍.熒光定量PCR法與酶聯(lián)免疫吸附法在乙型肝炎病毒檢測及療效評價中的應用價值探究[J].中國現(xiàn)代藥物應用，2019，13（14）：31-33.

[12]? ? 謝玉娜.熒光定量聚合酶鏈式反應法與酶聯(lián)免疫吸附試驗法在乙型肝炎病毒檢測中的應用價值[J].醫(yī)療裝備，2019，32（10）：47-48.

（收稿日期：2023-01-22）