宋坭潔,費(fèi)靜,廖娜,莊璐,楊婷鈺,李雷激

(西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 耳鼻咽喉頭頸外科,四川 瀘州 646000)

Perrault綜合征是一種罕見(jiàn)的常染色體隱性遺傳性疾病,其表征受性別影響,通常表現(xiàn)為雙耳輕度-極重度感音神經(jīng)性聽(tīng)力損失,女性常伴有卵巢功能障礙、性腺發(fā)育不全、原發(fā)性閉經(jīng)、不孕癥等,男性常表現(xiàn)出正常的青春發(fā)育和生育能力[1]。HARS2基因位于常染色體5q31.3,編碼高度保守的含506個(gè)氨基酸的線粒體組氨酰tRNA合成酶,該酶在線粒體基質(zhì)中催化組氨酸活化并與同源tRNA結(jié)合,促進(jìn)線粒體蛋白質(zhì)合成[2]。目前為止,已發(fā)現(xiàn)HARS2基因16種變異位點(diǎn)與Perrault綜合征相關(guān),其中只有2個(gè)突變位點(diǎn)進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,其余僅限于臨床發(fā)現(xiàn)[2-8]。先前的研究首次在一個(gè)以耳聾為表現(xiàn)的中國(guó)漢族男性Perrault綜合征家系中發(fā)現(xiàn)HARS2基因c.349G>A和c.908T>C復(fù)合雜合突變,分別導(dǎo)致p.Asp117Asn和p.Leu303Pro[9]。由于Perrault綜合征低發(fā)病率和高臨床異質(zhì)性,HARS2基因突變致病機(jī)制和途徑尚不明確。本實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)研究HARS2基因新突變對(duì)細(xì)胞線粒體功能的影響,探究其導(dǎo)致Perrault綜合征的致病途徑,為臨床診斷提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞、主要試劑與儀器

HEK 293T細(xì)胞由西南醫(yī)科大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室提供,重組表達(dá)載體由上海和元生物技術(shù)有限公司構(gòu)建提供,無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒(DP117,北京天根),DH5α感受態(tài)細(xì)胞(北京天根),AxyPrep 質(zhì)粒 DNA 小量試劑盒(美國(guó)Axygen公司),慢病毒包裝轉(zhuǎn)染試劑(上海和元生物技術(shù)有限公司),MTCO2兔多克隆抗體(55070-1-AP,美國(guó)Proteintech),GAPDH兔多克隆抗體(AP0063,美國(guó)Bioworld),細(xì)胞線粒體分離試劑(C3602,上海碧云天),增強(qiáng)型JC-1線粒體膜電位檢測(cè)試劑(C2003S,上海碧云天),增強(qiáng)型ATP檢測(cè)試劑(S0027,上海碧云天),微量法ATP含量檢測(cè)試劑(BC0305,北京索萊寶),ROS檢測(cè)試劑(E004-1-1,南京建成),CCK8試劑(CK04,北京同仁化學(xué)研究所),熒光倒置顯微鏡(日本Olympus),熒光分光光度計(jì)(Thermo Fisher),多功能酶標(biāo)儀(德國(guó)BMG),穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀、微型垂直電泳槽、轉(zhuǎn)移電泳槽、全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)(天能)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞構(gòu)建與培養(yǎng) 委托上海和元生物技術(shù)有限公司構(gòu)建真核表達(dá)載體,以pSLenti-SFH-EGFP-P2A-Puro-CMV-HARS2-3xFLAG-WPRE為載體,構(gòu)建野生型、c.349G>A突變型、c.908T>C突變型HARS2基因重組載體,同時(shí)構(gòu)建空病毒載體,載體攜帶EGFP、Flag標(biāo)簽,重組載體經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證。

將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞,接種于LB(A+)固體培養(yǎng)基上,挑選單克隆菌落,根據(jù)AxyPrep質(zhì)粒DNA小量試劑盒說(shuō)明書提取質(zhì)粒行測(cè)序驗(yàn)證,測(cè)序由上海和元生物技術(shù)有限公司完成,對(duì)測(cè)序鑒定成功的菌液進(jìn)行培養(yǎng),根據(jù)無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行質(zhì)粒大提取,-20 ℃保存。取出HEK 293T細(xì)胞,37 ℃水浴轉(zhuǎn)移至離心管中,離心后棄上清,完全培養(yǎng)基重懸后加入到培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)。待細(xì)胞融合度達(dá)80%時(shí),吸除舊培養(yǎng)基,加入Opti-MEM,將表達(dá)質(zhì)粒(突變型HARS2重組質(zhì)粒、野生型HARS2重組質(zhì)粒、空載質(zhì)粒)與慢病毒包裝質(zhì)?；旌?轉(zhuǎn)染HEK 293T細(xì)胞48～72 h,收集病毒上清液。將HEK 293T細(xì)胞接種到96孔板中,按梯度加入病毒上清液觀察轉(zhuǎn)染效率測(cè)定慢病毒滴度。將HEK 293T細(xì)胞接種到6孔板中,加入慢病毒和polybrene轉(zhuǎn)染細(xì)胞12～20 h,加入DEME培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞72 h,用含終濃度為1 μg/mL 嘌呤霉素的DEME培養(yǎng)基篩選EGFP陽(yáng)性表達(dá)的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株,熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率。

1.2.2 細(xì)胞活力檢測(cè) 采用CCK8定量比色法測(cè)定細(xì)胞活力。調(diào)整細(xì)胞密度為2 000個(gè)/mL,接種于96孔板,設(shè)置空白對(duì)照組,實(shí)驗(yàn)組和空白組均設(shè)3個(gè)復(fù)孔,置于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。分別于24、48、72 h加入10 μL CCK8試劑,置于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育2 h,酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處的吸光度。

1.2.3 Western印跡法檢測(cè)線粒體呼吸鏈復(fù)合物亞基MTCO2蛋白 將4組生長(zhǎng)良好的細(xì)胞取出,PBS(磷酸鹽緩沖液)洗滌2次,加入細(xì)胞裂解液,提取總蛋白,蛋白質(zhì)定量試劑盒(BCA法)測(cè)蛋白濃度。制膠,上樣進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜,封閉,一抗孵育,二抗孵育,TBST洗3次,每次10 min,滴加ECL發(fā)光液,成像儀中拍照并分析灰度值。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次,再進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.2.4 細(xì)胞ATP檢測(cè) PBS清洗細(xì)胞3次,加入ATP檢測(cè)裂解液,冰上裂解細(xì)胞,用細(xì)胞刮子刮下細(xì)胞至離心管中,離心,吸取上清,加入不透光的白色96孔板中,每組3個(gè)復(fù)孔,按照增強(qiáng)型ATP檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書操作測(cè)定細(xì)胞ATP含量,BCA法測(cè)樣品蛋白濃度,根據(jù)以下公式計(jì)算細(xì)胞ATP含量:ATP含量=(樣本吸光度值-空白吸光度值)÷(標(biāo)準(zhǔn)品吸光度值-空白吸光度值)×標(biāo)準(zhǔn)品濃度×樣本稀釋倍數(shù)÷樣本蛋白濃度。

1.2.5 線粒體ATP檢測(cè) 使用碧云天細(xì)胞線粒體分離試劑盒分離提取線粒體,線粒體儲(chǔ)存液重懸獲得線粒體懸液,取部分線粒體懸液加入裂解液裂解線粒體,離心,取上清, BCA法測(cè)定線粒體蛋白濃度,調(diào)節(jié)線粒體蛋白濃度為5 mg/mL,將樣本加入96孔UV板中,每組3個(gè)復(fù)孔,按照微量法ATP檢測(cè)試劑盒說(shuō)明測(cè)定線粒體ATP含量。

1.2.6 線粒體活性氧自由基(ROS)檢測(cè) 取步驟1.2.5中提取的線粒體,調(diào)節(jié)線粒體蛋白濃度為5 mg/mL,每組3瓶標(biāo)本,加入HEPES 緩沖液重懸,加入5 μmol/L 二氯熒光素二酯(DCFH-DA),37 ℃作用10 min對(duì)ROS進(jìn)行標(biāo)記,熒光分光光度計(jì)檢測(cè)熒光強(qiáng)度。

1.2.7 MMP水平檢測(cè) JC-1單染法檢測(cè)MMP水平,消化、收集并重懸細(xì)胞,均勻接種于12孔板,每組3個(gè)復(fù)孔,孵箱孵育24 h,加入JC-1染色工作液,37 ℃下孵育20 min,JC-1染色緩沖液洗滌3次,棄上清,加入完全培養(yǎng)基,熒光顯微鏡下拍照,Image J分析JC-1聚合物平均熒光值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)粒構(gòu)建和細(xì)胞轉(zhuǎn)染結(jié)果

DNA測(cè)序結(jié)果表明,HARS2基因預(yù)期位點(diǎn)發(fā)生了突變,第349位堿基發(fā)生G→A突變,第908位堿基發(fā)生T→C突變,見(jiàn)圖1。慢病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞經(jīng)嘌呤霉素篩選2周后,在熒光顯微鏡明視野下見(jiàn)HEK 293T細(xì)胞呈片狀貼壁生長(zhǎng),細(xì)胞融合率達(dá)80%以上,細(xì)胞純度高,生長(zhǎng)良好,熒光視野下EGFP綠色熒光穩(wěn)定表達(dá),見(jiàn)圖2。

圖1 DNA測(cè)序結(jié)果 注:WT(野生型序列);MU(定點(diǎn)突變型序列);箭頭(突變位點(diǎn))。

圖2 嘌呤霉素篩選2周,轉(zhuǎn)染細(xì)胞EGFP蛋白綠色熒光表達(dá)情況 (×100)

2.2 CCK8檢測(cè)結(jié)果

HARS2基因c.349G>A和c.908T>C突變細(xì)胞組增殖較野生組和對(duì)照組慢,與野生組相比,c.349G>A和c.908T>C突變組細(xì)胞在72 h的吸光度降低(P=0.013,P=0.012)。結(jié)果表明HARS2基因新突變導(dǎo)致細(xì)胞增殖變緩,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)圖3。

圖3 HEK 293T細(xì)胞生長(zhǎng)曲線 注:*與野生組細(xì)胞相比。

2.3 MTCO2蛋白表達(dá)結(jié)果

MTCO2是線粒體DNA編碼的呼吸鏈復(fù)合物IV亞基,Western印跡法檢測(cè)野生組、突變組和對(duì)照組的MTCO2蛋白表達(dá),結(jié)果顯示c.349G>A突變組MTCO2蛋白表達(dá)量較野生組降低31.07%(P=0.015),較對(duì)照組降低29%(P=0.020),c.908T>C突變組MTCO2蛋白表達(dá)量較野生組和對(duì)照組有所下降,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果表明HARS2基因c.349G>A突變降低線粒體蛋白MTCO2的合成,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)圖4。

圖4 各組線粒體蛋白MTCO2表達(dá)量 注:與野生組相比,*P<0.05;與對(duì)照組相比,#P<0.05。

2.4 各組ATP檢測(cè)結(jié)果

為探究突變對(duì)細(xì)胞線粒體產(chǎn)能能力的影響,采用螢火蟲螢光素酶/螢光素法檢測(cè)細(xì)胞ATP含量,微量法檢測(cè)線粒體ATP含量,計(jì)算結(jié)果以對(duì)照組平均值為參照做標(biāo)準(zhǔn)化處理。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示各細(xì)胞系A(chǔ)TP合成量無(wú)明顯差異,與對(duì)照組相比,c.349G>A和c.908T>C突變組線粒體ATP相對(duì)細(xì)胞總ATP的產(chǎn)率分別降低了22.46%(P=0.031)、28.99%(P=0.01),結(jié)果表明這兩種突變均導(dǎo)致線粒體ATP合成效率下降,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)圖5。

圖5 各組細(xì)胞總ATP測(cè)定(A)與線粒體ATP相對(duì)細(xì)胞總ATP產(chǎn)率(B)的柱狀圖 注:與對(duì)照組相比,#P<0.05。

2.5 各組線粒體ROS含量檢測(cè)結(jié)果

提取線粒體,采用熒光分光光度技術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)染野生型和突變型質(zhì)粒的HEK 293T細(xì)胞進(jìn)行線粒體ROS檢測(cè),以對(duì)照組平均值為參照做標(biāo)準(zhǔn)化處理。結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,c.349G>A突變組線粒體ROS水平增加了77.72%(P=0.039)。結(jié)果表明,HARS2基因c.349G>A突變促進(jìn)線粒體ROS的產(chǎn)生,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)圖6。

圖6 各組線粒體ROS相對(duì)熒光值柱狀圖 注:與對(duì)照組相比,#P<0.05;ROS(活性氧自由基)。

2.6 各組MMP比較

當(dāng)MMP高時(shí),JC-1得以聚集在基質(zhì)中,形成聚合物,產(chǎn)生紅色熒光。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與野生組相比,c.349G>A和c.908T>C突變組線粒體JC-1聚合物熒光值下降(P=0.003,P=0.004)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明HARS2基因新突變均導(dǎo)致MMP下降,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),見(jiàn)圖7。

圖7 各組線粒體JC-1聚合物平均熒光值柱狀圖 注:與野生組相比,**P<0.01。

3 討論

耳蝸毛細(xì)胞的頂端分布有專門的線粒體亞群,血管紋邊緣細(xì)胞負(fù)載大量的線粒體,線粒體產(chǎn)能、Ca2+緩沖、線粒體代謝等對(duì)于耳蝸發(fā)揮正常的聽(tīng)覺(jué)感受和聽(tīng)覺(jué)信號(hào)傳遞具有重要作用[10]。線粒體功能紊亂是導(dǎo)致聽(tīng)覺(jué)障礙的重要病理過(guò)程[11-12]。HARS2基因編碼的線粒體組氨酰tRNA合成酶是線粒體蛋白質(zhì)合成反應(yīng)及質(zhì)量控制的關(guān)鍵酶之一,HARS2突變通過(guò)抑制線粒體翻譯,影響線粒體蛋白質(zhì)合成,導(dǎo)致線粒體功能缺陷[13]。小鼠實(shí)驗(yàn)研究表明HARS2基因于小鼠出生后在小鼠耳蝸,包括內(nèi)毛細(xì)胞和外毛細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá),HARS2對(duì)于毛細(xì)胞的生存和功能至關(guān)重要,敲除HARS2基因的小鼠耳蝸組織中線粒體明顯受損,小鼠表現(xiàn)出類似于Perrault綜合征的快速進(jìn)行性聽(tīng)力損失[14]。為探究HARS2基因新突變對(duì)線粒體功能的影響,用慢病毒包裝攜帶野生型和突變型HARS2基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK 293T細(xì)胞,質(zhì)粒測(cè)序驗(yàn)證質(zhì)粒DNA發(fā)生349G>A、908T>C突變,EGFP標(biāo)簽蛋白熒光表達(dá)表明攜帶野生型、突變型HARS2基因的重組質(zhì)粒及空載質(zhì)粒在HEK 293T細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)。

線粒體氧化磷酸化主要通過(guò)5個(gè)多亞基復(fù)合物完成,復(fù)合物I-V構(gòu)成電子傳遞鏈,參與電子傳輸并產(chǎn)生質(zhì)子電化學(xué)梯度,最終通過(guò)復(fù)合物V將ADP轉(zhuǎn)化為ATP。MTCO2是由線粒體DNA編碼的組成復(fù)合物IV活性中心的亞基,Western印跡法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)HARS2基因c.349G>A突變的細(xì)胞MTCO2的表達(dá)量下降,說(shuō)明HARS2基因突變阻礙線粒體翻譯過(guò)程和線粒體蛋白的表達(dá),可能進(jìn)一步抑制線粒體氧化磷酸化作用。ATP檢測(cè)結(jié)果表明突變細(xì)胞總ATP產(chǎn)生水平無(wú)變化,但兩突變組線粒體ATP相對(duì)細(xì)胞總ATP產(chǎn)率降低,說(shuō)明HARS2基因新突變不影響細(xì)胞總ATP合成,但突變引起的呼吸功能缺陷導(dǎo)致線粒體ATP合成效率降低。突變細(xì)胞線粒體ATP產(chǎn)量的減少可能是線粒體質(zhì)子電化學(xué)電位梯度降低的結(jié)果[15]。線粒體功能缺陷的細(xì)胞對(duì)增加的ATP需求特別敏感[16],線粒體通過(guò)向糖酵解轉(zhuǎn)化補(bǔ)償線粒體氧化磷酸化受損造成的能量缺失,維持能量平衡。線粒體在進(jìn)行有氧呼吸過(guò)程中,不斷通過(guò)電子傳遞鏈泄漏出單電子還原氧分子,產(chǎn)生ROS[17]。生理情況下,機(jī)體氧化和抗氧化系統(tǒng)處于抗衡狀態(tài),若線粒體電子傳遞鏈?zhǔn)茏?會(huì)增加ROS的產(chǎn)生,啟動(dòng)機(jī)體內(nèi)源性氧化應(yīng)激,造成細(xì)胞損傷[18]。此次研究表明攜帶HARS2基因c.349G>A突變的細(xì)胞相對(duì)對(duì)照組細(xì)胞的線粒體ROS含量明顯升高,說(shuō)明HARS2基因c.349G>A突變可能通過(guò)損傷線粒體電子傳遞鏈促進(jìn)線粒體ROS的產(chǎn)生。呼吸鏈復(fù)合物活性不足往往會(huì)改變MMP,MMP反映了電子鏈傳遞和氧化磷酸化過(guò)程中氫離子的跨膜運(yùn)輸,是細(xì)胞活力的一個(gè)關(guān)鍵指標(biāo)[19]。利用JC-1探針檢測(cè)發(fā)現(xiàn)攜帶HARS2基因c.349G>A和c.908T>C突變的細(xì)胞MMP較野生型細(xì)胞下降。ROS的積累會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞和線粒體膜脂質(zhì)過(guò)氧化,對(duì)MMP產(chǎn)生負(fù)效應(yīng),MMP下降會(huì)促進(jìn)ROS的產(chǎn)生,二者之間形成惡性循環(huán),共同影響細(xì)胞活力[20]。而耳蝸對(duì)ROS的增加以及細(xì)胞氧化還原狀態(tài)的改變高度易感[21-22],這或許是HARS2基因突變導(dǎo)致耳蝸功能障礙及聽(tīng)力損失的內(nèi)在機(jī)制。

線粒體不僅能產(chǎn)生能量維持細(xì)胞生命活動(dòng),還能調(diào)控細(xì)胞內(nèi)部氧化還原平衡,調(diào)節(jié)鈣穩(wěn)態(tài)和細(xì)胞存活,是細(xì)胞增殖的基石[23]。HARS2作為一種線粒體氨?；磻?yīng)酶蛋白,參與線粒體復(fù)合物亞基的合成,其細(xì)胞功能可能與線粒體氧化磷酸化密切相關(guān)。為進(jìn)一步研究HARS2基因突變對(duì)細(xì)胞增殖的影響,采用CCK8法測(cè)得細(xì)胞增殖曲線,結(jié)果表明攜帶HARS2基因c.349G>A和c.908T>C突變的細(xì)胞增殖能力降低。HARS2突變所致的線粒體翻譯受抑制和呼吸功能障礙轉(zhuǎn)化為整體細(xì)胞健康和生長(zhǎng)缺陷。

綜上,該研究通過(guò)構(gòu)建攜帶野生型、突變型HARS2基因和空病毒載體的HEK 293T細(xì)胞研究突變對(duì)細(xì)胞線粒體功能的影響,研究結(jié)果表明HARS2基因c.349G>A突變抑制線粒體蛋白MTCO2的表達(dá),促進(jìn)線粒體ROS的產(chǎn)生,c.349G>A和c.908T>C突變降低線粒體ATP的合成效率,導(dǎo)致MMP下降,減弱細(xì)胞增殖能力。故此推測(cè)HARS2基因新突變位點(diǎn)所致的線粒體功能障礙和細(xì)胞增殖能力降低可能是Perrault綜合征的發(fā)病機(jī)制,為臨床診斷提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。