宋雪梅，鄧星，袁振亞，嚴為巧，黃曉潔，袁牧*

(1.徐州市婦幼保健院生殖醫(yī)學中心,徐州 221009;2.宜春市婦幼保健院生殖醫(yī)學中心,宜春 336000)

卵母細胞質量是輔助生殖技術(ART)助孕治療中能否成功妊娠的關鍵因素之一。目前在實施ART前一般會對患者的卵巢儲備功能進行評估,包括患者年齡、基礎竇卵泡數(shù)(AFC)、基礎卵泡刺激素(bFSH)和抗苗勒管激素(AMH)等[1-2]。隨著女性年齡增加,卵巢儲備功能逐步下降。近年來關于卵巢儲備功能減退(DOR)的研究主要集中在不同促排卵方案在DOR患者中的應用效果[3-4],以及雄激素、輔酶Q10、生長激素等預處理方法對于DOR患者的輔助治療[5]。之前有文獻報道,ART治療中35歲以下婦女每周期的活產(chǎn)率為32.2%,35至37歲婦女為26.2%,38至40歲婦女則進一步下降,僅為18.5%[6],故本研究中將年輕女性特指為<38歲的女性。Morin等[7]研究報道年齡<38歲DOR女性活產(chǎn)率低于卵巢儲備功能正?；颊叩脑蚴瞧涿總€周期獲得的卵母細胞數(shù)量少而非其卵母細胞的發(fā)育潛能差。但對于年輕(<38歲)DOR女性,其卵巢儲備功能的過早減退是否會引起卵母細胞質量下降及增加胚胎染色體非整倍體率風險的研究報道仍較少。胚胎植入前非整倍體遺傳學檢測(PGT-A)是在胚胎植入宮腔前進行染色體數(shù)目的檢測,以篩查非整倍體胚胎,挑選染色體正常的胚胎植入子宮,從而降低早期流產(chǎn)的風險[8]。本研究通過對因反復自然流產(chǎn)、反復種植失敗和嚴重畸精子癥行PGT-A的年輕DOR患者進行研究,探討年輕女性DOR是否會影響胚胎的染色體非整倍體率,并進一步觀察整倍體囊胚移植后胚胎的繼續(xù)發(fā)育潛能。

一、資料與方法

1.研究對象:回顧性分析2020年1月至2022年9月在徐州市婦幼保健院生殖醫(yī)學中心行PGT-A患者的臨床資料,共計180例患者(243個周期),共收集達活檢標準的囊胚737枚。將納入患者按照是否存在DOR分為對照組(155例,196個周期)和DOR組(25例,47個周期)。納入標準:(1)臨床診斷為DOR[9](bFSH≥10 U/L,AFC≤5～7個,AMH≤1.1 ng/ml);(2)女方年齡<38歲;(3)反復種植失敗(移植次數(shù)≥3次或累計移植≥4～6個優(yōu)質胚胎或≥3個高評分囊胚仍未種植);(4)反復自然流產(chǎn)(≥2次自然流產(chǎn));(5)嚴重畸精子癥。其中DOR組納入標準滿足(1)(2)的同時需滿足(3)或(4)或(5),對照組納入標準滿足(2)的同時需滿足(3)或(4)或(5)。排除標準:(1)卵巢手術史;(2)單基因病;(3)夫婦一方染色體數(shù)目或結構異常;(4)手術取精者;(5)存在其它影響妊娠及流產(chǎn)因素者。所有行PGT-A的患者均簽署知情同意書。本研究將非整倍體及嵌合體胚胎的移植排除在研究范圍之外。

2.研究方法:(1)體外受精及囊胚培養(yǎng):常規(guī)促排卵后B超引導下穿刺取卵,在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后拆除卵母細胞周圍的顆粒細胞,MⅡ期卵母細胞行ICSI授精,使用G-TLTM一步式培養(yǎng)液(Vitrolife,瑞典)進行胚胎培養(yǎng),在時差成像培養(yǎng)箱(Embryo Scope+,Vitrolife,瑞典)內培養(yǎng)至囊胚。(2)囊胚活檢和PGT-A:采用Gardner評分標準[10]對囊胚進行分級,評分≥3BC或3CB的囊胚用活檢針取3～5個囊胚滋養(yǎng)外胚層細胞后按照玻璃化冷凍試劑盒(加藤,日本)操作說明進行玻璃化冷凍?；顧z細胞全基因組擴增采用胚胎植入前染色體非整倍體檢測試劑盒,二代測序采用Illumina測序平臺(北京嘉寶仁和),其中整條染色體異常、4 Mb及以上的拷貝數(shù)變異和染色體異常比例大于80%的囊胚為非整倍體囊胚,異常比例20%～80%的囊胚為嵌合體囊胚。(3)解凍周期移植及妊娠結果判定:采用人工激素替代周期準備子宮內膜,所有患者均進行單囊胚移植,于移植日給予黃體支持,移植術后5周行B超檢查,宮內見孕囊及原始心管搏動者判定為臨床妊娠,孕28周后的活胎分娩視為活產(chǎn)。(4)觀察指標:患者的基本資料(年齡、不孕年限、AFC、bFSH、AMH、bE2等)、胚胎實驗室指標(2PN率、囊胚形成率、活檢囊胚整倍體率等)及妊娠結局(臨床妊娠率、流產(chǎn)率、活產(chǎn)率等)。2PN率=正常受精胚胎數(shù)/獲卵數(shù)×100%,囊胚形成率=總囊胚數(shù)/正常受精胚胎數(shù)×100%,可用囊胚形成率=活檢囊胚數(shù)/正常受精胚胎數(shù)×100%,整倍體率=整倍體囊胚數(shù)/活檢囊胚數(shù)×100%,非整倍體率=非整倍體囊胚數(shù)/活檢囊胚數(shù)×100%,嵌合體率=嵌合體囊胚數(shù)/活檢囊胚數(shù)×100%,臨床妊娠率=臨床妊娠周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%,流產(chǎn)率=流產(chǎn)周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%,活產(chǎn)率=活產(chǎn)分娩周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%。

二、結果

1.患者基本資料比較:兩組患者的年齡、不孕年限和bE2均無顯著性差異(P>0.05);DOR組的AFC和AMH顯著低于對照組(P<0.01),而bFSH水平顯著高于對照組(P<0.05)(表1)。

表1 兩組患者基本資料比較(-±s)

2.患者胚胎實驗室指標比較:DOR組與對照組相比,2PN率、囊胚形成率、可用囊胚形成率和活檢囊胚整倍體率、嵌合體率均無顯著性差異(P>0.05)(表2)。

表2 兩組患者胚胎實驗室指標比較(%)

3.患者移植整倍體囊胚后的妊娠結局比較:對照組有125個周期進行了單囊胚移植,DOR組有20個周期進行了單囊胚移植。移植周期的患者年齡、不孕年限、子宮內膜厚度及優(yōu)質囊胚移植周期比例(移植D5/D6優(yōu)質囊胚周期占移植周期比例)均無顯著性差異(P>0.05);臨床妊娠率、流產(chǎn)率和活產(chǎn)率亦無顯著性差異(P>0.05)(表3)。至撰稿時對照組隨訪發(fā)現(xiàn)宮外孕1例,胎兒畸形1例,活胎分娩51例;DOR組隨訪無宮外孕和胎兒畸形,活胎分娩7例,余在繼續(xù)隨訪中。需要說明的是納入本研究的25例年輕DOR患者形成的囊胚行胚胎植入前遺傳學檢測后有3例患者沒有可移植胚胎,其中2例行2個周期促排卵分別獲1枚和3枚可供活檢的囊胚但均為非整倍體囊胚,另外1例行3個周期均未形成囊胚。

表3 兩組患者整倍體囊胚移植周期的一般資料及妊娠結局比較[(-±s),%]

討 論

生理狀態(tài)下女性卵巢內原始卵泡隨著年齡的增長而逐漸閉鎖、退化[1]。本研究結果顯示,雖然年輕(<38歲)DOR患者其AMH和AFC均顯著低于對照組、bFSH顯著高于對照組(P均<0.05),但兩組間臨床妊娠率和活產(chǎn)率并無顯著性差異(P>0.05)。說明對于年輕DOR患者而言,AMH、bFSH和AFC等指標評估的是雙側卵巢內存儲的原始卵泡數(shù)量,并不等同于卵母細胞質量。這與2020年Tiegs等[11]的研究報道一致,其發(fā)現(xiàn)年輕DOR女性(<35歲,AMH<1.0 ng/ml)行宮腔內人工授精(IUI)的妊娠結局與年輕卵巢儲備功能正常的患者相似。還有研究發(fā)現(xiàn)在接受IVF治療的女性中,DOR與活產(chǎn)率不存在相關性[12-13]。因此,不推薦無輸卵管梗阻等不孕因素的育齡期年輕女性行常規(guī)卵巢功能評估,避免引起不必要的焦慮恐慌情緒。

PGT-A適應證包括高齡、反復自然流產(chǎn)、反復種植失敗和嚴重畸精子癥等[14-15]。此前有文獻對不同PGT-A指征患者形成囊胚的非整倍體率和妊娠結局進行研究,認為年齡大于40歲女性患者形成的胚胎染色體非整倍體率顯著增加,而反復種植失敗患者的非整倍體率和活產(chǎn)率與反復自然流產(chǎn)患者相比無統(tǒng)計學差異[16-17]。2023年,本中心一項研究的結果顯示年齡<38歲的反復種植失敗、反復自然流產(chǎn)和嚴重畸精子癥患者的胚胎整倍體率無統(tǒng)計學差異[18]。本研究依據(jù)卵巢儲備功能情況對行PGT-A的患者進行分組,結果發(fā)現(xiàn)DOR組與對照組患者的2PN率、囊胚形成率和可用囊胚形成率均無顯著性差異,但因AFC顯著低于對照組,DOR患者單次促排卵獲卵數(shù)少。因此,DOR組的患者往往需要多次取卵才能獲得可利用的整倍體囊胚進行移植。本研究納入DOR組的25例患者共47個周期,其中16例患者需進行≥2次促排卵周期來積攢胚胎。因此,建議DOR年輕患者盡早完成生育計劃。但本研究納入的DOR患者樣本量偏少,年輕DOR患者對胚胎非整倍體率的影響仍需要后期多中心大樣本研究的支持。

本研究結果顯示年輕DOR患者與卵巢儲備功能正?；颊吣遗呷旧w整倍體率和活產(chǎn)率比較無顯著性差異(P>0.05),提示年輕DOR患者卵巢內卵母細胞數(shù)目減少并不顯著影響胚胎的繼續(xù)發(fā)育潛能。若DOR患者一次促排卵無整倍體囊胚可移植,可以通過增加取卵次數(shù)來增加累計獲卵數(shù)以獲得更多可用于受精的成熟卵母細胞。有學者分別對年齡<38歲和≤40歲的DOR患者進行研究后發(fā)現(xiàn),DOR組與卵巢儲備功能正常的患者相比囊胚整倍體率和活產(chǎn)率均無統(tǒng)計學差異[7,19],本研究結果與其一致。2021年,Jaswa等[8]研究顯示≤42歲DOR患者胚胎整倍體率顯著低于卵巢儲備功能正常的對照組,但按不同年齡分組(<35歲、35～37歲、38～40歲、40～42歲)統(tǒng)計的DOR患者胚胎整倍體率與對照組無統(tǒng)計學差異,可能的原因是DOR組平均年齡顯著高于對照組所致(39.5歲 vs. 37歲),因為高齡患者本身卵母細胞質量下降影響了活檢囊胚的整倍體率。因此,本研究中剔除了引起卵母細胞質量降低的生理性高齡因素來研究DOR人群。

綜上所述,年輕DOR女性雙側卵巢內儲備的原始卵泡數(shù)量減少與卵母細胞質量的好壞并無相關性,且并不影響囊胚的整倍體率和活產(chǎn)率,但因卵巢功能的衰退速度無法預估,建議有生育要求的年輕DOR女性盡早生育。