袁長(zhǎng)巍，沈肖方，袁曉立，譚雙，曹興午

(1.北京美中宜和北三環(huán)婦兒醫(yī)院,北京 100088;2.中日友好醫(yī)院,北京 100029)

精液分析是評(píng)價(jià)男性生育力最基本、最直接、最重要的檢測(cè)項(xiàng)目,包括精液外觀、精液量、pH值、液化狀態(tài)、粘稠度、精子濃度、精子總數(shù)、精子活動(dòng)率、精子活力分級(jí)、圓形細(xì)胞及精子形態(tài)等參數(shù)。但精液分析并不能準(zhǔn)確預(yù)測(cè)因精子質(zhì)量變化而產(chǎn)生的影響,因此有必要尋找其他的檢測(cè)指標(biāo),來提高男性生育能力的預(yù)測(cè)和管理[1]。在精子形態(tài)學(xué)評(píng)估過程中,我們更多關(guān)注正常與異常形態(tài)精子的百分率。而對(duì)于精子凋亡情況及生精細(xì)胞脫落狀態(tài)并未給予足夠的重視。精子凋亡率可以反映異常染色質(zhì)狀態(tài),而精液中生精細(xì)胞脫落增多則提示可能存在精子發(fā)生障礙或生精上皮受損。精液分析不僅可以對(duì)患者的生育能力提供一個(gè)初步評(píng)估,還可以對(duì)引起某些生育障礙的病因、病變發(fā)生部位提供參考,為確定病因或是否需進(jìn)一步檢查提供依據(jù)[2]。目前,關(guān)于正常精子濃度與低精子濃度的精子凋亡率及生精細(xì)胞脫落狀態(tài)報(bào)道極少,本文對(duì)此進(jìn)行分析并進(jìn)一步探討其在男性不育實(shí)驗(yàn)診斷中的應(yīng)用價(jià)值。

一、資料與方法

1.研究對(duì)象:回顧性分析2022年8～12月于北京美中宜和北三環(huán)婦兒醫(yī)院生殖男科就診的861例不育癥患者的臨床資料。根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)《人類精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(第5版)》的參考標(biāo)準(zhǔn)[3]將納入患者按照不同精子濃度分為兩組:精子濃度≥15×106個(gè)/ml的為正常精子濃度組(n=775),精子濃度<15×106個(gè)/ml的低精子濃度組(n=86)。

2.精液標(biāo)本采集及檢測(cè):禁欲2～7 d后,采用手淫法取精。將精液放置于37℃水浴箱內(nèi),待完全液化后,充分混勻后進(jìn)行檢測(cè)。采用北京穗加軟件提供的計(jì)算機(jī)輔助精子分析(CASA)系統(tǒng),分析精子濃度及活動(dòng)率。采用精子染色液(Diff-Quik)試劑盒(深圳華康生物),分析精子形態(tài)并嚴(yán)格按照操作流程及WHO手冊(cè)所給出的評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)[3]進(jìn)行分類計(jì)數(shù),每張涂片至少評(píng)估200個(gè)精子,并計(jì)數(shù)正常和異常及頭部缺陷、中段缺陷、主段缺陷及過量殘留胞質(zhì)精子的百分率。每張涂片評(píng)估兩次,以確保兩次結(jié)果無較大差異,計(jì)數(shù)200個(gè)精子內(nèi)頭部暗染、固縮(凋亡)精子所占的比例分析精子凋亡率。并計(jì)數(shù)在200個(gè)精子范圍內(nèi)精原細(xì)胞、初級(jí)精母細(xì)胞、次級(jí)精母細(xì)胞及精子細(xì)胞的脫落數(shù)量及占比情況。

二、結(jié)果

1.一般資料:與正常精子濃度組比較,低精子濃度組精子活動(dòng)率和正常形態(tài)精子率顯著降低,精子凋亡率顯著升高(P<0.05),兩組間患者年齡比較無顯著差異(P>0.05)(表1)。

表1 兩組患者一般資料比較(-±s)

2.生精細(xì)胞比較:在正常精子濃度組中共檢出995個(gè)生精細(xì)胞,平均每例檢出1.28個(gè)生精細(xì)胞(200個(gè)精子范圍內(nèi));而低精子濃度組中共檢出440個(gè)生精細(xì)胞,平均每例檢出5.12個(gè)生精細(xì)胞(200個(gè)精子范圍內(nèi))。正常精子濃度組生精細(xì)胞檢出率顯著低于低精子濃度組(P<0.05),兩組間各級(jí)生精細(xì)胞占比情況均無顯著差異(P>0.05)(表2)。

表2 兩組間生精細(xì)胞檢出率及各級(jí)生精細(xì)胞占比情況比較(%)

三、討論

精子的數(shù)量、活力及形態(tài)分析是評(píng)價(jià)精液質(zhì)量最為經(jīng)典的3個(gè)參數(shù),各參數(shù)之間密切聯(lián)系,即使精子濃度或(和)活力正常,形態(tài)缺陷也可能影響精子受精能力,且為最重要的單一因素。精子形態(tài)是精子的外貌特征,在一定程度上亦是反映精子優(yōu)劣的基礎(chǔ)。WHO《人類精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(第6版)[4]強(qiáng)調(diào),精子形態(tài)學(xué)的評(píng)估價(jià)值不僅可用于判斷自然妊娠和輔助生殖技術(shù)(ART)結(jié)局的預(yù)后,還可以為睪丸和附睪功能判斷提供更多有診斷價(jià)值的信息。因此,在遵循精子形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)化評(píng)估的同時(shí),對(duì)其各部位的缺陷特征與潛在疾病的關(guān)系應(yīng)給予更多關(guān)注。特別是對(duì)于某些特異性畸形精子、凋亡精子及生精細(xì)胞的檢出,臨床上應(yīng)給予重視。

Diff-Quik染色法是WHO推薦的精子形態(tài)學(xué)染色方法之一,因其簡(jiǎn)單快速的特征在各實(shí)驗(yàn)室廣泛應(yīng)用。Diff-Quik染色法不僅可以觀察精子和生精細(xì)胞的形態(tài),還可以通過精子頭部暗染程度來判斷和計(jì)數(shù)精子的凋亡率,在每張精子涂片中都可以看到淺色(正常染色模式)和深色(暗染、固縮)染色的精子頭部,后者則代表異常染色質(zhì)狀態(tài),屬于細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)特征,為精子DNA損傷的結(jié)果和表現(xiàn)[5]。精子頭部顏色較暗,其發(fā)生機(jī)制可能與精子DNA鏈斷裂或壓縮異常有關(guān),最終導(dǎo)致染料結(jié)合位點(diǎn)增多而出現(xiàn)暗染狀態(tài)。精子凋亡在精子發(fā)生過程中是一個(gè)重要特征,自發(fā)性凋亡在維持精子的數(shù)量和質(zhì)量方面非常重要,而誘發(fā)過多的精子凋亡則屬于病理現(xiàn)象,是導(dǎo)致精子DNA損傷的機(jī)制之一。精液中可以看到各種形態(tài)的凋亡精子,尤其以小頭精子最為常見;小頭精子常伴有頂體發(fā)育異常,這也是導(dǎo)致受精失敗的重要原因。雖然凋亡精子有一定的活力存在,但自身細(xì)胞結(jié)構(gòu)已發(fā)生了變異,凋亡精子比例越高,發(fā)生不育的風(fēng)險(xiǎn)亦升高。末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶脫氧尿嘧啶缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)主要用于特異性檢出精子凋亡引起的DNA損傷,靈敏度高,可用于精子DNA損傷的量化分析。有研究發(fā)現(xiàn),Diff-Quik染色后,暗染精子(凋亡)百分率與TUNEL陽性精子比例呈現(xiàn)顯著相關(guān)性[6-7]。當(dāng)把精子暴露于可促進(jìn)DNA斷裂和染色質(zhì)解聚的條件下,如過氧化氫、高溫環(huán)境時(shí),其暗染精子百分率也顯著增加。有學(xué)者建議將32%的暗染率作為胚胎發(fā)育和妊娠的預(yù)測(cè)閾值,且該閾值與精子染色質(zhì)結(jié)構(gòu)分析法(SCSA)所建議的閾值(精子DNA碎片化指數(shù)≥30%)非常接近[7-8]。因此,當(dāng)實(shí)驗(yàn)室缺乏成熟可靠的精子DNA檢測(cè)方法時(shí),Diff-Quik染色可作為評(píng)估精子異常染色質(zhì)的一種參考指標(biāo),但此方法具有一定的主觀性,染色時(shí)間過長(zhǎng)可影響評(píng)估結(jié)果,規(guī)范化培訓(xùn)可減少結(jié)果的可變性。

在不同精子濃度精液中,精子凋亡均有一定的發(fā)生率。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),低精子濃度組不僅表現(xiàn)為精子活動(dòng)率和正常形態(tài)精子百分率降低,而且精子凋亡率也顯著高于正常精子濃度組(P<0.05)。低精子濃度患者常因睪丸生精功能低下引起,病因眾多且復(fù)雜,有害因素可直接或間接的造成睪丸及附屬腺體受損、內(nèi)環(huán)境紊亂、生精功能障礙等,這可能是導(dǎo)致精子數(shù)量較少,精子凋亡率增高的重要原因。引發(fā)精子凋亡異常的機(jī)制較為復(fù)雜,而精子的“凋亡逃逸”可能會(huì)使具有DNA損傷的生精細(xì)胞逃避某些凋亡途徑,并進(jìn)一步分化為攜帶損傷DNA的成熟精子[9]。另外,生精細(xì)胞凋亡主要由生精細(xì)胞表面的腫瘤壞死因子受體超家族成員6(Fas)和支持細(xì)胞表面的Fas配體通過Fas/FasL途徑介導(dǎo),Fas/FasL途徑可能是控制精子凋亡的重要途徑[10]。卵胞漿內(nèi)單精子注射技術(shù)(ICSI)的使用可以使卵母細(xì)胞在不依賴于精子形態(tài)學(xué)的情形下完成受精,這在一定程度上削弱了精子形態(tài)學(xué)分析的臨床應(yīng)用價(jià)值。由于精子缺陷的部位、受損程度及凋亡率不同,其生育結(jié)局可能有所不同。精子凋亡率升高必然會(huì)增加精子挑選困難,而凋亡精子的注入將可能誘導(dǎo)胚胎發(fā)生凋亡、囊胚形成率降低,繼而引起胚胎發(fā)育異常、早期流產(chǎn)甚至異常缺陷等的發(fā)生概率增加[11]。特別是對(duì)于一些因精子數(shù)量少而無法進(jìn)行精子DNA檢測(cè)的精液標(biāo)本,精子形態(tài)凋亡率分析可能對(duì)ICSI治療預(yù)后判斷有一定的參考價(jià)值。

正常精液中可見大量精子和少量生精細(xì)胞,各級(jí)生精細(xì)胞按數(shù)量、比例有序排出,呈常態(tài)脫落。由于睪丸受損的時(shí)間、程度及導(dǎo)致受損的因素不同,其生精細(xì)胞的脫落狀態(tài)及臨床表現(xiàn)也不盡相同[12]。本課題組研究發(fā)現(xiàn),低精子濃度組精液中生精細(xì)胞的檢出率顯著高于正常精子濃度組(P<0.05),且平均每例精液生精細(xì)胞檢出的數(shù)量(200個(gè)精子范圍內(nèi))為正常精子濃度的4倍。在低精子濃度組中,生精細(xì)胞的檢出主要以精子細(xì)胞最為常見,初級(jí)精母細(xì)胞次之,精原細(xì)胞和次級(jí)精母細(xì)胞較為少見,與正常精子濃度組比較,各級(jí)生精細(xì)胞的脫落比例均未見顯著差異(P>0.05),說明生精細(xì)胞脫落增多是睪丸受損的敏感信號(hào),是導(dǎo)致精子生成受阻、數(shù)量減少的重要原因,雖然各級(jí)生精細(xì)胞的比例并未表現(xiàn)出異常,但在部分低精子濃度精液中,仍可以觀察到生精細(xì)胞阻滯(部分)在初級(jí)精母細(xì)胞或精子細(xì)胞階段。在低精子濃度精液中,生精細(xì)胞常表現(xiàn)為凋亡特征,而凋亡的發(fā)生涉及一系列基因的激活、表達(dá)及調(diào)控等機(jī)制,其本質(zhì)是更好的適應(yīng)生存環(huán)境而主動(dòng)采取的死亡過程。睪丸生精功能障礙的病程發(fā)展,必定有初始-受損-輕度-中度-重度的病變過程,生精細(xì)胞脫落也必然有早期、中期、高峰期和空化期的不同表現(xiàn),以至精子數(shù)量的多寡及形態(tài)學(xué)的改變與睪丸損傷程度密切相關(guān)。如何及時(shí)、有效地控制生精細(xì)胞的持續(xù)性脫落仍是臨床上關(guān)注的重點(diǎn)和難點(diǎn);而生精細(xì)胞的動(dòng)態(tài)變化,可作為療效觀察和判斷預(yù)后的重要指標(biāo)。

綜上,Diff-Quik染色不僅可以觀察精子的形態(tài),還可以評(píng)估精子凋亡及生精細(xì)胞脫落狀態(tài)。特別是對(duì)于低精子濃度患者,進(jìn)行精液生精細(xì)胞和精子凋亡率檢查,對(duì)進(jìn)一步了解睪丸生精功能受損程度及精子異常染色質(zhì)狀態(tài)有著重要價(jià)值。精液細(xì)胞學(xué)分析已進(jìn)入推廣和應(yīng)用階段,可以在推廣和實(shí)踐中不斷地深入、豐富、糾正和完善。而凋亡精子分類在臨床上的應(yīng)用前景仍值得繼續(xù)關(guān)注、探討和總結(jié)。