段超群，鄧星，彭偉，劉珍，張露，李清，解興興，韓艷

(宜春市婦幼保健院輔助生殖科,宜春 336000)

體外受精/卵胞漿內(nèi)單精子注射(IVF/ICSI)技術(shù)迅速發(fā)展,臨床妊娠率不斷提高,可達(dá)50%,但抱嬰回家率仍只有30%左右[1]。胚胎移植后可能出現(xiàn)胚胎丟失包括生化妊娠、流產(chǎn)等不良結(jié)局,因此如何選擇最有發(fā)育潛能的胚胎移植是改善臨床妊娠率、降低流產(chǎn)率的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。囊胚階段的胚胎具有與子宮內(nèi)膜更為同步,并且能更好地判斷胚胎發(fā)育潛能等優(yōu)勢(shì)[2-3]。囊胚移植雖然提高了臨床妊娠率,但是胚胎丟失的情況并未見明顯下降[4],這可能與我們?cè)谝浦矔r(shí)選擇的胚胎質(zhì)量有關(guān)。形態(tài)學(xué)評(píng)分系統(tǒng)依然是目前應(yīng)用最廣泛的胚胎選擇方法[5],然而胚胎發(fā)育是一個(gè)動(dòng)態(tài)過程,單一時(shí)間點(diǎn)的觀察并不能準(zhǔn)確反映胚胎的發(fā)育潛能[6]。本研究通過回顧性分析IVF/ICSI助孕患者行單囊胚移植后,妊娠丟失發(fā)生與移植囊胚及其對(duì)應(yīng)卵裂期胚胎評(píng)分、卵裂模式的關(guān)系,希望能指導(dǎo)臨床挑選更適合的胚胎進(jìn)行移植,從而改善臨床結(jié)局。

一、資料與方法

1.研究對(duì)象及分組:回顧性分析2017年7月至2022年7月于宜春市婦幼保健院輔助生殖科行單囊胚移植且移植后β-HCG陽性的患者的臨床資料。納入/排除標(biāo)準(zhǔn):女方年齡<40歲;受精方式為IVF或ICSI;單囊胚移植且移植后HCG陽性的周期;甲狀腺、腎上腺功能等未見明顯異常;排除子宮畸形(如縱膈子宮、雙角子宮等)以及嚴(yán)重的輸卵管積水、宮腔粘連、復(fù)發(fā)性流產(chǎn)、反復(fù)植入失敗患者。本研究通過宜春市婦幼保健院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

共收集單囊胚移植后HCG陽性周期196個(gè)。根據(jù)臨床妊娠結(jié)局將研究對(duì)象分為3組:生化妊娠組(34個(gè)周期)、早期流產(chǎn)組(22個(gè)周期)和持續(xù)妊娠組(140個(gè)周期)。

2.單囊胚移植周期資料回顧:促排卵方案采用早卵泡期長效長方案或拮抗劑方案,并在扳機(jī)后36～38 h行陰道超聲監(jiān)測(cè)下取卵術(shù),取卵術(shù)后給予常規(guī)黃體支持。受精后第3天(D3)卵裂期胚胎轉(zhuǎn)移至G2-plus培養(yǎng)液(Vitrolife,瑞典)中,在37℃、6%CO2及5%O2的三氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng),培養(yǎng)至D5或D6囊胚期,行鮮胚移植或凍融胚胎移植(FET)。FET周期采用自然周期或激素替代周期準(zhǔn)備內(nèi)膜:月經(jīng)規(guī)律有排卵患者行自然周期準(zhǔn)備內(nèi)膜,于排卵日后第5天進(jìn)行單囊胚復(fù)蘇移植;無排卵或月經(jīng)周期不規(guī)律患者行激素替代周期準(zhǔn)備內(nèi)膜,根據(jù)B超檢查提示的子宮內(nèi)膜情況來擬定單囊胚復(fù)蘇移植時(shí)間。

妊娠結(jié)局的判斷:囊胚移植后第9天測(cè)定β-HCG水平≥20 U/L但移植后第28天行陰道B超監(jiān)測(cè)未見孕囊者為生化妊娠;移植后第28天行陰道B超監(jiān)測(cè)存在孕囊者為臨床妊娠;臨床妊娠但于12周前流產(chǎn)者為早期流產(chǎn);臨床妊娠且胎兒心管搏動(dòng)維持至12周后者為持續(xù)妊娠。

3.連續(xù)性觀察胚胎質(zhì)量方法:對(duì)受精后D2和D3卵裂期胚胎、D5和D6囊胚期胚胎進(jìn)行連續(xù)性觀察并記錄評(píng)分。D2和D3卵裂期胚胎評(píng)分參考Istanbul共識(shí)[7],根據(jù)卵裂球數(shù)量、碎片程度、卵裂球均勻度等進(jìn)行評(píng)分,評(píng)分分為Ⅰ～Ⅳ級(jí),其中Ⅰ和Ⅱ級(jí)為優(yōu)質(zhì)卵裂期胚胎。囊胚期胚胎評(píng)分參照Gardner囊胚評(píng)分法[8]進(jìn)行,根據(jù)囊胚的擴(kuò)張和孵出程度分成1～6期,3～6期囊胚進(jìn)一步對(duì)內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM)和滋養(yǎng)層細(xì)胞(TE)分級(jí)為A～C,3BB及以上為優(yōu)質(zhì)囊胚?；谶@一標(biāo)準(zhǔn),將ICM評(píng)級(jí)或TE評(píng)級(jí)為A、B的歸為優(yōu)質(zhì)ICM或TE(A+B)。胚胎評(píng)分均由兩位實(shí)驗(yàn)室人員進(jìn)行,一人評(píng)分,另一人核對(duì),以減少主觀差異。

4.觀察/分析指標(biāo):患者的基礎(chǔ)資料以及促排卵、受精/胚胎培養(yǎng)和囊胚移植相關(guān)指標(biāo)。包括年齡、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、不孕年限、不孕類型、基礎(chǔ)卵泡刺激素(bFSH)水平、基礎(chǔ)黃體生成素(bLH)水平、抗苗勒管激素(AMH)水平、竇卵泡計(jì)數(shù)(AFC);獲卵數(shù)、成熟卵數(shù);授精方式、D3優(yōu)質(zhì)卵裂胚比例、D2優(yōu)質(zhì)卵裂胚比例、D2～D3胚的4細(xì)胞(4C)到8細(xì)胞(8C)卵裂模式占比、優(yōu)質(zhì)ICM囊胚占比和優(yōu)質(zhì)TE囊胚占比;移植類型、內(nèi)膜厚度、移植胚胎的優(yōu)質(zhì)囊胚比例。將D2卵裂至4C、D3卵裂至8C的D2～D3卵裂模式歸為優(yōu)質(zhì)卵裂模式。

二、結(jié)果

1.患者基礎(chǔ)資料比較:本研究共納入196個(gè)單囊胚移植周期,其中生化妊娠組34個(gè)周期,早期流產(chǎn)組22個(gè)周期,持續(xù)妊娠組140個(gè)周期。3組間患者年齡、BMI、不孕年限、基礎(chǔ)FSH、LH、AMH水平、AFC比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05);生化妊娠組原發(fā)不孕比例顯著低于早期流產(chǎn)組和持續(xù)妊娠組(P<0.05)(表1)。

表1 各組患者基礎(chǔ)臨床資料比較[(-±s),n(%)]

2.患者促排卵、受精及單囊胚移植周期各參數(shù)比較:3組間獲卵數(shù)、成熟卵數(shù)、IVF受精比例、新鮮周期比例、移植日內(nèi)膜厚度比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(表2)。

表2 各組患者促排卵、受精及移植周期相關(guān)指標(biāo)比較[(-±s),n(%)]

3.胚胎發(fā)育實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)比較:3組間囊胚評(píng)分、D2～D3卵裂模式、囊胚ICM評(píng)分、囊胚TE評(píng)分、囊胚形成時(shí)間比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。其中,生化妊娠組的優(yōu)質(zhì)囊胚率顯著低于其他兩組(P<0.05);生化妊娠組優(yōu)質(zhì)卵裂模式(D2～D3的4C～8C卵裂模式)占比顯著低于早期流產(chǎn)組(P<0.05);生化妊娠組囊胚ICM和TE的A+B評(píng)分占比、D5囊胚占比均顯著低于持續(xù)妊娠組(P<0.05);而3組間D2、D3卵裂期胚胎評(píng)分比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(表3)。

表3 各組患者胚胎發(fā)育實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)比較[n(%)]

4.影響單囊胚移植生化妊娠的多因素Logistic回歸分析:因年齡、BMI為常見影響生化妊娠的因素,故納入年齡、BMI、不孕類型、ICM評(píng)分、TE評(píng)分等構(gòu)建多因素Logistic回歸方程。調(diào)整混雜因素后發(fā)現(xiàn),繼發(fā)不孕、囊胚TE評(píng)分、囊胚形成時(shí)間對(duì)單囊胚移植生化妊娠的影響具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表4)。

表4 單囊胚移植生化妊娠的多因素Logistic回歸分析

三、討論

在IVF/ICSI治療中,由于對(duì)患者妊娠結(jié)局的密切關(guān)注,生化妊娠的發(fā)生往往被捕捉到,其發(fā)生率為20%～30%;同時(shí),輔助生殖技術(shù)助孕患者仍存在10%～20%的自然流產(chǎn)率,這無疑給不孕不育夫婦帶來了巨大的心理創(chuàng)傷和經(jīng)濟(jì)壓力[9]。如何降低生化妊娠率和流產(chǎn)率、提高活產(chǎn)率是輔助生殖領(lǐng)域一直備受關(guān)注的問題。而生化妊娠、流產(chǎn)與胚胎質(zhì)量密切相關(guān),隨著單胚胎移植臨床應(yīng)用的增加,選擇“最佳”胚胎進(jìn)行移植并達(dá)到活產(chǎn)一直是臨床的迫切需求?？赡艿姆椒ㄖ皇茄娱L胚胎培養(yǎng)時(shí)間至囊胚階段。盡管囊胚選擇的形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)具有一定的主觀性,但它排除了8細(xì)胞期后發(fā)育受損的胚胎,并降低了移植染色體異常的優(yōu)質(zhì)胚胎的風(fēng)險(xiǎn)[10]。

形態(tài)學(xué)評(píng)分仍是目前應(yīng)用最廣泛的胚胎評(píng)分方法。由于囊胚發(fā)育是一個(gè)階段連續(xù)性的過程,從D2、D3卵裂期胚胎至D5、D6囊胚發(fā)育的各階段我們都進(jìn)行了形態(tài)學(xué)觀察,主要觀察指標(biāo)為卵裂球細(xì)胞數(shù)目及其均勻度、胚胎碎片比例、囊胚擴(kuò)張狀態(tài)及TE、ICM情況等。郭映純等[11]研究發(fā)現(xiàn),移植優(yōu)質(zhì)卵裂胚來源的優(yōu)質(zhì)囊胚相較于移植非優(yōu)質(zhì)卵裂胚來源的優(yōu)質(zhì)囊胚,可獲得較高的臨床妊娠率和較低的流產(chǎn)率。Xia等[12]研究表明,相較于高質(zhì)量卵裂胚來源的囊胚,低質(zhì)量卵裂胚來源的囊胚移植組流產(chǎn)率較高。而Herbemont等[13]研究顯示,D2和D3卵裂期胚胎質(zhì)量的好壞并不影響囊胚的種植率和流產(chǎn)率。方璐等[14]研究發(fā)現(xiàn),來源于D3優(yōu)胚組和非優(yōu)胚組的囊胚復(fù)蘇移植后的流產(chǎn)率并無顯著差異。以上研究顯示不同卵裂期胚胎評(píng)分對(duì)囊胚移植妊娠結(jié)局的影響存在爭(zhēng)議。那么囊胚評(píng)分及其對(duì)應(yīng)的卵裂期評(píng)分對(duì)單囊胚移植患者的妊娠結(jié)局究竟有多大的參考價(jià)值呢?本研究通過比較單囊胚移植周期生化妊娠組、早期流產(chǎn)組和持續(xù)妊娠組的囊胚質(zhì)量及其對(duì)應(yīng)的D2、D3卵裂期胚胎質(zhì)量參數(shù),探究胚胎發(fā)育不同時(shí)期的評(píng)分對(duì)妊娠丟失的影響,為選擇最具發(fā)育潛能的囊胚提供可能依據(jù)。

本研究共納入196個(gè)單囊胚移植周期,其中生化妊娠組34個(gè)周期、早期流產(chǎn)組22個(gè)周期、持續(xù)妊娠組140個(gè)周期。3組間基礎(chǔ)資料包括年齡、BMI、不孕年限、基礎(chǔ)性激素水平、AMH水平、AFC、獲卵數(shù)、成熟卵數(shù)、受精方式、移植周期類型及移植日內(nèi)膜厚度等比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;生化妊娠組的繼發(fā)不孕比例(88.2%)較早期流產(chǎn)組(59.1%)和持續(xù)妊娠組(65.7%)更高。同時(shí)我們探討了移植囊胚評(píng)分、對(duì)應(yīng)的D2/D3卵裂期胚胎評(píng)分、D2～D3卵裂模式、囊胚ICM評(píng)分、囊胚TE評(píng)分、囊胚形成時(shí)間(D5/D6)與生化妊娠和早期流產(chǎn)的關(guān)系,結(jié)果發(fā)現(xiàn),生化妊娠組的優(yōu)質(zhì)囊胚率(70.6%)較早期流產(chǎn)組(100.0%)和持續(xù)妊娠組(93.6%)顯著降低;與持續(xù)妊娠組相比,生化妊娠組的囊胚ICM和TE的A+B評(píng)分占比、D5囊胚占比均顯著降低。

為排除混雜因素影響,本研究進(jìn)一步以生化妊娠組為病例組、持續(xù)妊娠組為對(duì)照組進(jìn)行了多因素Logistic回歸分析。因?yàn)槟挲g、BMI為常見影響生化妊娠的因素,將其也納入回歸方程。調(diào)整混雜因素后,結(jié)果發(fā)現(xiàn)繼發(fā)不孕、TE評(píng)分、囊胚形成時(shí)間對(duì)單囊胚移植生化妊娠的影響具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。生化妊娠組移植TE評(píng)級(jí)為A/B的囊胚所占的比例較持續(xù)妊娠組顯著降低(P<0.05),這意味著囊胚TE評(píng)分與持續(xù)妊娠相關(guān)。Honnma等[15]也發(fā)現(xiàn)TE的形態(tài)學(xué)評(píng)分與持續(xù)妊娠率呈顯著正相關(guān)?？赡苁窃u(píng)分更高的TE細(xì)胞分泌HCG的時(shí)間更早且分泌量更多,而HCG能夠刺激黃體生成,調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜容受性,在維持妊娠中發(fā)揮重要作用[16]。此外,本研究中生化妊娠組移植D6囊胚比例顯著高于持續(xù)妊娠組,這可能與D6囊胚中非整倍體率高于D5囊胚有關(guān)[17]。然而,多因素Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)移植囊胚對(duì)應(yīng)的卵裂期評(píng)分并非單囊胚移植妊娠丟失的獨(dú)立影響因素(P>0.05),這與Herbemont等[14]的研究結(jié)果一致,即D2和D3卵裂胚質(zhì)量的好壞并不顯著影響囊胚移植的流產(chǎn)率。此外,Poulain等[18]發(fā)現(xiàn),移植D3質(zhì)量較差胚胎來源的優(yōu)質(zhì)囊胚后,植入率為29.4%,研究認(rèn)為D2或D3胚胎形態(tài)學(xué)評(píng)估的預(yù)測(cè)價(jià)值有限。根據(jù)目前的研究結(jié)果,如果采取囊胚移植策略,可以建議胚胎學(xué)家在第2天不再評(píng)估胚胎質(zhì)量,這樣可以避免非必要地從培養(yǎng)箱中取出培養(yǎng)皿,從而減少胚胎培養(yǎng)環(huán)境變化對(duì)后續(xù)植入率等的潛在影響[19]。

綜上所述,無論卵裂階段的胚胎質(zhì)量如何,我們建議優(yōu)先選擇D5優(yōu)質(zhì)囊胚進(jìn)行移植,并優(yōu)先考慮TE評(píng)分級(jí)別高的囊胚,以期減少IVF/ICSI治療中胚胎丟失的發(fā)生。但因本研究樣本量較小,后續(xù)還需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量加以探討,以驗(yàn)證囊胚評(píng)分及其對(duì)應(yīng)的卵裂期評(píng)分對(duì)妊娠丟失的影響。