馮艷芹，劉璇，劉曉婷，沈偉，李蘭

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/生殖科學(xué)研究院,青島 266109)

POF的發(fā)生主要與機(jī)體內(nèi)氧化應(yīng)激水平相關(guān)[10]。煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide,NAD+)又稱輔酶1,是氧化反應(yīng)中必不可少的輔酶,具有有效的抗氧化作用[11]。大量研究報(bào)道,提高機(jī)體內(nèi)NAD+的水平能夠有效改善卵巢功能、提高卵泡及卵母細(xì)胞數(shù)量[12-13]。NDA+無法直接通過口服補(bǔ)充,但是補(bǔ)充NAD+前體,如煙酰胺單核苷酸(nicotinamide mononucleotide,NMN)、煙酸(niacin,NA)、煙酰胺核糖(nicotinamide riboside,NR)和煙酰胺(nicotinamide,NAM)能有效提高NAD+水平。有報(bào)道稱,補(bǔ)充NA和NAM能夠降低卵母細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平,有效改善卵母細(xì)胞質(zhì)量[14-16]。此外,Wang等[17]發(fā)現(xiàn),通過補(bǔ)充NA可以提高卵巢對(duì)氧化應(yīng)激的反應(yīng)能力,抑制細(xì)胞凋亡進(jìn)而提高卵巢儲(chǔ)備功能。除了NAD+前體外,Li等[18]發(fā)現(xiàn)卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)過程中添加蝦青素(一種天然抗氧化劑)能夠提高抗氧化酶表達(dá)水平,維持卵泡及卵母細(xì)胞存活。由此可見,額外補(bǔ)充抗氧化劑能夠有效改善機(jī)體內(nèi)的氧化應(yīng)激狀態(tài),提高卵巢功能。

單一藥物的抗氧化能力有限,而精優(yōu)能(包含了NAD+前體、蝦青素、β胡蘿卜素、核黃素等抗氧化劑)作為一種特殊的醫(yī)學(xué)用途配方食品(特醫(yī)食品),能較好地滿足特定人群對(duì)營(yíng)養(yǎng)素或者膳食的特殊需要。相較于普通食品,特醫(yī)食品營(yíng)養(yǎng)相對(duì)豐富,營(yíng)養(yǎng)配比更合理、均衡,有利于提高患者的整體健康水平,為疾病的治療提供良好的基礎(chǔ)[19]。本研究對(duì)POF模型小鼠持續(xù)灌胃28 d精優(yōu)能,通過觀察其生殖系統(tǒng)的表型以及氧化應(yīng)激等相關(guān)指標(biāo),探究精優(yōu)能對(duì)POF發(fā)生的緩解作用。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本實(shí)驗(yàn)所用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為ICR小鼠(購(gòu)買于濟(jì)南實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)。小鼠集中飼養(yǎng)于青島農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房,保證適宜的溫度和濕度、充足的食物和飲用水。小鼠飼養(yǎng)及操作遵守實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例,符合倫理規(guī)范。本研究經(jīng)學(xué)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

二、主要試劑

精優(yōu)能(女士型),由同方藥業(yè)集團(tuán)提供,主要有效成分如表1所示。白消安(B2635;Sigma,美國(guó));M2操作液(CE003;中國(guó)邁晨科技)、M16培養(yǎng)液(M7292;Sigma,美國(guó));RNA快速提取試劑盒(AC0202;山東思科捷生物);兔抗小鼠Vasa同源體(mouse vasa homologue,MVH)多克隆抗體(ab13840;Abcam,美國(guó))、兔抗小鼠骨形態(tài)生成蛋白15(BMP15)多克隆抗體(ab108413;Abcam,美國(guó))、兔抗小鼠抗苗勒管激素(AMH)多克隆抗體(DF13527;Affinity,美國(guó))、兔抗小鼠谷胱甘肽過氧化酶4(GPX4)多克隆抗體(A1933;武漢愛博泰克生物科技);DAB顯色液(ZLI-9017;北京中杉金橋)和化學(xué)發(fā)光試劑盒(P0018;上海碧云天生物技術(shù))。

表1 精優(yōu)能女士型主要有效成分及其功能

表1 精優(yōu)能女士型主要有效成分及其功能

成分化學(xué)分子式功能NAMC6H6N2O參與能量代謝、抗氧化NAC6H5NO2參與能量代謝、抗氧化蝦青素C40H52O4抗氧化、抗炎癥、抗癌β胡蘿卜素C40H56抗氧化、抗癌癥核黃素C17H20N4O6參與能量代謝、抗氧化

三、實(shí)驗(yàn)方法

1.小鼠處理方法:本實(shí)驗(yàn)使用3周齡ICR雌鼠,按照體重進(jìn)行單次200 mg·kg-1·d-1的白消安腹腔注射,建立POF小鼠模型。然后將POF鼠分成5組:一組進(jìn)行持續(xù)28 d的PBS灌胃,作為模型對(duì)照組(B組);其余4組小鼠每天按照體重分別灌胃50 mg/kg、100 mg/kg、200 mg/kg、400 mg/kg的精優(yōu)能,持續(xù)28 d,標(biāo)記為B+50、B+100、B+200、B+400組。另外,設(shè)立不注射白消安的空白對(duì)照組(CTRL組),PBS持續(xù)灌胃28 d。收集7周齡小鼠生殖器官樣本,通過對(duì)生殖器官臟器指數(shù)(臟器重量與體重之比)進(jìn)行統(tǒng)計(jì),分析精優(yōu)能緩解POF的最適濃度。然后,以最適濃度(200 mg·kg-1·d-1)再次進(jìn)行POF挽救,通過觀察生殖表型、氧化應(yīng)激水平等指標(biāo),探究精優(yōu)能對(duì)POF發(fā)生的影響。

2.小鼠卵巢石蠟切片與免疫組織化學(xué)染色:收集各組小鼠的卵巢,進(jìn)行固定、沖水、梯度脫水、浸蠟、包埋、切片。得到白片后,進(jìn)行二甲苯脫蠟、梯度復(fù)水、檸檬酸抗原修復(fù);待抗原修復(fù)液自然冷卻后,洗滌并進(jìn)行封閉(30 min)、孵育一抗(生殖細(xì)胞標(biāo)記蛋白MVH)(4℃過夜)、孵育二抗(37℃,45 min);二抗孵育結(jié)束,再次洗滌后,按每張片子100 μl滴加顯色液,靜置1 min后,在體視顯微鏡下觀察染色情況;后經(jīng)過PBS洗滌、蘇木精染色、藍(lán)化、復(fù)水、二甲苯透明、中性樹脂封片,得到可用于進(jìn)行卵泡統(tǒng)計(jì)的卵巢切片,待鏡檢觀察。

3.GV期卵母細(xì)胞收集與體外培養(yǎng):取7周齡小鼠卵巢,在M2操作液中剁碎卵巢,用口吸管將GV期卵母細(xì)胞撿出,移入M16培養(yǎng)液中,在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng),4 h后觀察生發(fā)泡破裂(germinal vesicle breakdown,GVBD)的卵母細(xì)胞比例,12 h后統(tǒng)計(jì)第一極體排出(first polar body extrusion,PBE)的卵母細(xì)胞比例。

4.實(shí)時(shí)定量熒光PCR(RT-qPCR):按試劑盒步驟對(duì)新鮮卵巢組織進(jìn)行RNA提取,并將各組RNA濃度調(diào)至一致,再按試劑盒要求將RNA反轉(zhuǎn)為cDNA。配制RT-qPCR體系(20 μl),包含SYBR qPCR Master Mix、無酶無菌水、目的基因引物、cDNA,反應(yīng)條件為5℃ 10 min、95℃ 15 s、60℃ 1 min,進(jìn)行40個(gè)循環(huán),檢測(cè)卵泡發(fā)育相關(guān)基因Bmp15、Gdf9、Amh和抗氧化酶相關(guān)基因Sod2、Cat、Gpx4的表達(dá)水平。以Gapdh為管家基因,用2-ΔΔCt法計(jì)算mRNA水平。目的基因的PCR引物序列如表2所示。

為解決地級(jí)以上市行政區(qū)域交界河段執(zhí)法問題，廣東省組織主要江河沿線的地級(jí)以上市水務(wù)局簽訂了交界河段聯(lián)合執(zhí)法協(xié)議，在屬地管理原則的前提下，進(jìn)一步明確了工作職責(zé)和工作配合，努力消除執(zhí)法的盲點(diǎn)。廣東與廣西交界的西江界首河段也簽訂了河道采運(yùn)砂監(jiān)管聯(lián)合執(zhí)法協(xié)議，并進(jìn)行了多次協(xié)作執(zhí)法。

表2 各基因的PCR引物序列(5’-3’)

5.蛋白免疫印跡技術(shù)(Westerm Blot,WB):新鮮卵巢組織加入蛋白裂解液,進(jìn)行充分裂解后,離心收集上清液,并加入上清液1/4量的5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液,沸水煮5 min,制備蛋白上樣液;在恒壓100 V下進(jìn)行12%聚丙烯酰胺凝膠電泳;隨后,在恒流300 mA下,將目標(biāo)蛋白轉(zhuǎn)到聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride,PVDF)上,進(jìn)行PVDF膜的封閉、洗滌以及目標(biāo)抗體(BMP15、AMH和GPX4)孵育;最后,使用化學(xué)發(fā)光液顯色,檢測(cè)BMP15、AMH以及GPX4的蛋白水平。以GAPDH作為內(nèi)參蛋白,統(tǒng)計(jì)目標(biāo)蛋白表達(dá)量。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理及方法

結(jié) 果

一、不同濃度精優(yōu)能對(duì)POF小鼠體重及臟器指數(shù)的影響

為探究不同濃度精優(yōu)能對(duì)POF發(fā)生的挽救作用,本研究對(duì)持續(xù)灌胃28 d的各組小鼠進(jìn)行體重檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),白消安處理的POF模型鼠以及灌胃精優(yōu)能的POF鼠,體重?zé)o顯著差異(P>0.05)(表3)。此外,我們還觀察了7周齡小鼠生殖器官的形態(tài),結(jié)果顯示,各組小鼠卵巢和子宮形態(tài)沒有明顯差異(圖1)。

A:7周齡小鼠卵巢形態(tài)圖;B:7周齡小鼠子宮形態(tài)圖。圖1 各組小鼠卵巢及子宮形態(tài)圖

表3 各組小鼠體重及生殖器官臟器指數(shù)比較(-±s)

通過統(tǒng)計(jì)臟器指數(shù)發(fā)現(xiàn),白消安注射會(huì)造成小鼠卵巢和子宮指數(shù)顯著降低(P<0.05),但在灌胃28 d的200 mg·kg-1·d-1(B+200組)或400 mg·kg-1·d-1(B+400組)精優(yōu)能后,小鼠的臟器指數(shù)較B組顯著提高(P<0.05)(表3)。

二、精優(yōu)能對(duì)POF小鼠卵巢儲(chǔ)備功能的影響

上述結(jié)果發(fā)現(xiàn),灌胃一定濃度(200 mg·kg-1·d-1或400 mg·kg-1·d-1)的精優(yōu)能,能夠顯著提高POF模型小鼠卵巢和子宮指數(shù)(P<0.05)。為了明確精優(yōu)能對(duì)POF發(fā)生的影響,接下來主要探究200 mg/kg精優(yōu)能對(duì)POF小鼠卵巢儲(chǔ)備的挽救效果,并額外設(shè)置了非POF模型單獨(dú)灌胃28 d精優(yōu)能(200 mg·kg-1·d-1)的組別:CTRL+200(C+200)組。

分析卵巢切片及卵泡計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn):B組、CTRL組、B+200組間比較,各級(jí)卵泡比例均無顯著差異(P>0.05);各組總卵泡數(shù)分別為CTRL組(380.0±61.62)枚、B組(102.3±15.35)枚、B+200組(163±27.93)枚、C+200組(372.3±83.35)枚。B組總卵泡數(shù)較CTRL組顯著減少(P<0.01);B+200組卵泡總數(shù)較B組顯著增加(P<0.05)(圖2A、2B、2C)。

A:孵育MVH抗體后的小鼠卵巢切面及各級(jí)卵泡形態(tài)(棕色示MVH陽性細(xì)胞,即卵母細(xì)胞),右側(cè)列示各級(jí)卵泡典型圖像(PmF:原始卵泡;PF:初級(jí)卵泡;SF:次級(jí)卵泡;AF:有腔卵泡);B:各組卵泡總數(shù)統(tǒng)計(jì)圖;C:4組間各級(jí)卵泡比例統(tǒng)計(jì)圖。與B組比較,*P<0.05,#P<0.01。圖2 精優(yōu)能改善POF小鼠卵巢儲(chǔ)備

此外,RT-qPCR結(jié)果顯示,與B組相比,B+200組卵泡生長(zhǎng)相關(guān)基因(Gdf9、Bmp15)及卵巢儲(chǔ)備相關(guān)基因(Amh)表達(dá)量顯著升高(P<0.01)。同時(shí),WB檢測(cè)結(jié)果顯示,灌胃精優(yōu)能后卵巢組織中BMP15和AMH的蛋白水平也顯著提高(P<0.05)(圖3)。提示精優(yōu)能補(bǔ)充能夠改善POF小鼠的卵巢儲(chǔ)備功能。

A:各組相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平比較:與B組比較,#P<0.01;B:各組中BMP15和AMH蛋白表達(dá)水平比較:與B組比較,*P<0.05,#P<0.01。圖3 精優(yōu)能改善POF小鼠卵泡發(fā)育及卵巢儲(chǔ)備相關(guān)基因的表達(dá)水平

三、精優(yōu)能對(duì)卵母細(xì)胞數(shù)量及發(fā)育潛能的影響

在結(jié)果二中,我們發(fā)現(xiàn)精優(yōu)能能夠增加卵泡數(shù)量、改善卵巢儲(chǔ)備,但其對(duì)POF小鼠卵母細(xì)胞發(fā)育潛能是否有影響還有待繼續(xù)研究。因此,本實(shí)驗(yàn)收集了7周齡小鼠GV期卵母細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng),觀察其發(fā)育情況(圖4);并對(duì)GV期卵母細(xì)胞數(shù)量、GVBD率以及PBE率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn),200 mg·kg-1·d-1的精優(yōu)能能夠顯著增加POF小鼠GV期卵母細(xì)胞數(shù)量(P<0.05),促進(jìn)了POF小鼠第一極體排出(P<0.05)(表4)。

圖4 7周齡小鼠卵母細(xì)胞發(fā)育情況(比例尺:100 μm)

表4 不同處理各組小鼠卵母細(xì)胞成熟指標(biāo)的比較(-±s)

四、精優(yōu)能對(duì)POF小鼠抗氧化能力的影響

為了探究精優(yōu)能是否是通過抗氧化作用緩解白消安造成的POF,我們檢測(cè)了幾種常見的抗氧化酶的表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與B組相比,B+200組卵巢組織內(nèi)Sod2、Cat和Gpx4 mRNA水平均顯著升高(P<0.05),GPX4蛋白水平也顯著增加(P<0.05)(圖5),提示精優(yōu)能可以有效提高卵巢內(nèi)抗氧化能力。

與B組比較,*P<0.05,#P<0.01。圖5 各組小鼠卵巢組織內(nèi)抗氧化酶表達(dá)水平比較

討 論

大量研究證實(shí),體內(nèi)外各種不利因素會(huì)造成卵巢內(nèi)卵泡數(shù)量降低、卵母細(xì)胞質(zhì)量下降,最終導(dǎo)致卵巢功能衰竭,如POF[4,9,20]。其中,化療造成的POF格外普遍。現(xiàn)階段,有大量化療藥物用于構(gòu)建POF小鼠模型,如順鉑、環(huán)磷酰胺、白消安等[8-9]。白消安是極少數(shù)能夠在3歲以下兒童中使用的化療藥物之一,但對(duì)生殖能力有著嚴(yán)重?fù)p傷[21-22]。已有研究報(bào)道,白消安能夠影響卵巢儲(chǔ)備及卵母細(xì)胞質(zhì)量[1]。本研究也發(fā)現(xiàn),與空白對(duì)照組相比,注射白消安后,小鼠卵巢及子宮指數(shù)明顯降低、卵泡及卵子數(shù)量也顯著減少,呈現(xiàn)典型的POF癥狀。

臨床上常常使用激素補(bǔ)充治療來改善POF,但激素治療存在依賴性,并且長(zhǎng)期激素補(bǔ)充有可能造成腺癌、冠心病、中風(fēng)等疾病[4,23]。近年來的研究發(fā)現(xiàn),通過移植骨髓、臍帶血等間充質(zhì)干細(xì)胞也可以有效改善POF[24-26],但其臨床試驗(yàn)還未成熟。因此,尋求有效緩解POF的方法格外重要。

從POF發(fā)生機(jī)制上而言,ROS水平升高是誘發(fā)POF的潛在原因之一[10,27]。本研究發(fā)現(xiàn),持續(xù)灌胃28 d精優(yōu)能后,能夠降低白消安引起的POF小鼠的氧化應(yīng)激水平,增加Cat、Gpx4等抗氧化酶的表達(dá)水平,有效緩解白消安誘發(fā)的POF小鼠卵巢及子宮指數(shù)、卵泡數(shù)量及卵母細(xì)胞成熟率的下降。這與先前的一些關(guān)于NAD+改善POF的研究結(jié)論[15,17,28]相一致。本研究發(fā)現(xiàn),補(bǔ)充抗氧化劑尤其是復(fù)合型的抗氧化劑,可以有效改善化療等因素引起的POF,也為臨床POF患者提供了有效的食用級(jí)候選治療產(chǎn)品。事實(shí)上,NA、NAM不僅能夠改善POF,在生物醫(yī)學(xué)其他方面也有潛在的應(yīng)用前景,包括抗腫瘤、抗炎癥、抗衰老等[29-30]。然而,需要注意的是,有研究稱,補(bǔ)充過量NAM會(huì)造成生物毒性,影響卵母細(xì)胞減數(shù)分裂進(jìn)程。因此,關(guān)于NAD+前體在人類中的應(yīng)用,還有待加強(qiáng)機(jī)制探索和有效監(jiān)督。

綜上,本研究表明,持續(xù)28 d灌胃200 mg·kg-1·d-1的精優(yōu)能,能夠通過降低POF小鼠卵巢內(nèi)氧化應(yīng)激水平,緩解POF小鼠生殖器官指數(shù)下降、卵泡及卵子數(shù)量降低,并有效維持卵母細(xì)胞發(fā)育潛能,有效緩解POF的發(fā)展過程。