鄭美玲，樊青俐，鐘蓮梅

1青海大學(xué)研究生院，西寧 810016 2青海省人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，西寧 810000 3昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，昆明 650000

癲癇是一種常見的慢性中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，包括特發(fā)性、癥狀性及隱源性癲癇，病因復(fù)雜，可能與大腦神經(jīng)元興奮與抑制失衡相關(guān)，但詳細(xì)的發(fā)病機(jī)制尚不明確。近年來研究發(fā)現(xiàn)，腸道菌群可通過迷走神經(jīng)、內(nèi)分泌、免疫、神經(jīng)遞質(zhì)等機(jī)制影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能，從而實(shí)現(xiàn)腸道微生物與大腦之間的雙向聯(lián)系(腦-腸軸)，已證實(shí)腸道菌群與癲癇、多發(fā)性硬化、阿爾茨海默癥等諸多神經(jīng)系統(tǒng)疾病具有關(guān)聯(lián)性[1]。青海處于青藏高原東部，平均海拔約3000 m，低氧、低壓、高寒的氣候特點(diǎn)導(dǎo)致多種慢性疾病發(fā)病率升高[2-4]，并使長期生活在該地區(qū)的居民呈現(xiàn)出特異性疾病譜。此外，在低壓、低氧環(huán)境下，腸道菌群的組成及功能可能隨之改變，此改變是否對(duì)癲癇的發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生影響目前尚不明確。本研究分別收集了來自中高海拔地區(qū)癲癇患者與健康人群的糞便組織，對(duì)其標(biāo)本中的16S rRNA進(jìn)行高通量測(cè)序并結(jié)合生物信息學(xué)分析結(jié)果，比較癲癇患者與健康人群的腸道菌群分布和組成差異，旨在明確中高海拔地區(qū)癲癇患者腸道菌群的結(jié)構(gòu)特征，為開展癲癇病因?qū)W研究提供思路。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

2021年9月至2022年8月，連續(xù)招募世居于中高海拔地區(qū)(海拔2200～4500 m)癲癇患者(middle-high altitude epilepsy，MHE)和中高海拔地區(qū)健康人群(middle-high altitude normal，MHN)。其中MHE來自于青海省人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科癲癇患者，MHN來自于青海省人民醫(yī)院體檢中心體檢的健康人群，并按照年齡、性別與MHE相匹配。

MHE納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)結(jié)合典型的癲癇發(fā)作病史及腦電圖檢查結(jié)果等資料確診為癲癇，癲癇診斷標(biāo)準(zhǔn)符合《國際癲癇學(xué)會(huì)官方報(bào)告：癲癇的實(shí)用臨床定義》[5]；(2)長期(>3年)居住于青海地區(qū)；(3)采樣前2周內(nèi)無抗生素、益生菌、激素等藥物使用史。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并嚴(yán)重的消化系統(tǒng)疾病、消化系統(tǒng)致病性微生物或寄生蟲感染；(2)合并惡性腫瘤、內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病、免疫系統(tǒng)疾病等可能影響腸道菌群穩(wěn)定性的其他疾??；(3)合并嚴(yán)重心、肝、腎等功能障礙；(4)采樣前1周飲食習(xí)慣顯著變化者；(5)孕期或哺乳期女性。

MHN納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)自覺無明顯身體不適且體檢證實(shí)無明確的臨床疾??；(2)長期(>3年)居住于青海地區(qū)且年齡、性別與MHE進(jìn)行1∶1匹配；(3)采樣前2周內(nèi)無抗生素、益生菌、激素等藥物使用史。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)采樣前1周飲食習(xí)慣顯著變化者；(2)孕期或哺乳期女性。

本研究已于中華人民共和國科學(xué)技術(shù)部人類遺傳資源采集審批備案(備案號(hào)：2022CJ1405)，并通過青海省人民醫(yī)院倫理審查委員會(huì)審批(審批號(hào)：2022-36)，所有參與者均簽署知情同意書。

1.2 標(biāo)本采集與基因測(cè)序

1.2.1 標(biāo)本采集與DNA提取

收集研究對(duì)象年齡、性別、肝腎功能、血脂等一般臨床資料及晨起新鮮糞便標(biāo)本約5 g，立即保存于-80 ℃冰箱。采用 QIAamp Fast DNA Stool Mini試劑盒提取標(biāo)本中腸道微生物總DNA，并采用瓊脂糖凝膠電泳、Nandrop和Qubit分別檢測(cè)總DNA完整度、純度和濃度，質(zhì)量合格后進(jìn)行后續(xù)分析。

1.2.2 16S rRNA基因擴(kuò)增與測(cè)序

取質(zhì)控合格的總DNA，采用全式金DNA擴(kuò)增試劑盒(TransGen AP221-02：TransStart Fastpfu DNA Polymerase)對(duì)腸道菌群的16S rDNA V3～V4區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，引物為338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGC AG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)。擴(kuò)增體系：5× FastPfu Buffer 4 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，正反向引物 (5 μmol/L)各0.8 μL，F(xiàn)astPfu Polymerase 0.4 μL，牛血清蛋白0.2 μL，模板DNA 1 ng，滅菌水補(bǔ)齊至20 μL。擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35次循環(huán)；72 ℃孵育5 min。收集擴(kuò)增產(chǎn)物，采用Illumina NovaSeq 6000平臺(tái)按標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程純化后構(gòu)建PE250文庫并進(jìn)行高通量測(cè)序。

1.3 生物信息學(xué)分析

采用Fastp 0.21.0軟件對(duì)原始序列進(jìn)行質(zhì)控后，采用FLASH 1.2.11軟件對(duì)序列進(jìn)行拼接。質(zhì)控合格的序列進(jìn)行分類操作單元(operational taxonomic units，OTU)聚類分析，相似度≥97%的序列被認(rèn)為是同一種OTU，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析。(1)α多樣性(R軟件Mothur 1.47.0程序)：包括稀疏曲線(Shannon指數(shù))、Shannon指數(shù)、Sobs指數(shù)、Chao指數(shù)、ACE指數(shù)、Goods Coverage指數(shù)，其中稀疏曲線(Shannon指數(shù))評(píng)估測(cè)序深度，Shannon指數(shù)評(píng)估菌群多樣性，Sobs指數(shù)為實(shí)際觀測(cè)到的OTU數(shù)目，Chao、ACE指數(shù)可評(píng)估菌群豐富度，Goods Coverage指數(shù)可評(píng)估測(cè)序深度覆蓋樣品中所有物種的概率。(2)β多樣性：采用加權(quán)Bray-Curtis距離矩陣的主坐標(biāo)分析(principal coordinate analysis，PCoA)評(píng)估菌落特征(R軟件Mothur 1.47.0程序)，并繪制基于UniFrac距離矩陣樣本樹樹狀圖(R軟件Vegan2.6-2程序)。(3)差異菌群：基于OTU聚類分析，在門、屬水平比較兩組豐度存在差異的菌群，并繪制物種組成柱狀圖、物種豐度聚類熱圖；采用線性判別分析(linear discriminant analysis，LDA)評(píng)估兩組腸道有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的菌群(Wilcoxon秩和檢驗(yàn)，設(shè)置LDA評(píng)分≥2為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)。

1.4 樣本量估算

由于目前文獻(xiàn)中尚缺乏癲癇與腸道菌群關(guān)聯(lián)強(qiáng)度的相關(guān)數(shù)據(jù)，暫無法進(jìn)行樣本量估算。查閱文獻(xiàn)[6-8]可知，既往癲癇患者腸道菌群多樣性研究的樣本量均較小，如Safak等[6]研究中癲癇患者30例，健康人群10名；Wang等[7]研究中癲癇患者27例，健康人群23名。本研究擬納入癲癇患者32例，健康人群33名，理論上可滿足數(shù)據(jù)分析需要。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。年齡、體質(zhì)量指數(shù)、α多樣性等計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；性別為計(jì)數(shù)資料，以頻數(shù)(百分?jǐn)?shù))表示，組間比較采用卡方檢驗(yàn)。采用R 4.0.3軟件繪制稀疏曲線、樣本樹樹狀圖、物種組成柱狀圖、物種豐度聚類熱圖等。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般臨床資料

共入選符合納入與排除標(biāo)準(zhǔn)的MHE 32例、MHN 33名。兩組年齡、性別、體質(zhì)量指數(shù)、肝腎功能、血脂均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均>0.05)，見表1。

表1 兩組基線資料比較

2.2 腸道菌群多樣性

隨測(cè)序序列條目增加，MHE組與MHN組稀疏曲線(Shannon指數(shù))逐漸趨于平坦，說明測(cè)序數(shù)據(jù)量合理，樣本的α多樣性指標(biāo)已達(dá)穩(wěn)定狀態(tài)(圖1A)。MHE組與MHN組Sobs指數(shù)分別為698.88±257.29、804.33±122.52，Goods Coverage指數(shù)分別為0.995±0.001、0.994±0.001，提示測(cè)序深度已基本覆蓋樣品中的所有物種，測(cè)序結(jié)果可反映樣本中微生物真實(shí)情況。α多樣性分析顯示，MHE組ACE指數(shù)、Shannon指數(shù)、Chao指數(shù)均低于MHN組(P均<0.05)，見表2。

表2 兩組α多樣性比較

通過基于加權(quán)Bray-Curtis距離矩陣的PCoA評(píng)估了腸道菌群β多樣性，結(jié)果顯示MHE組與MHN組在 PCoA1軸和PCoA2軸之間形成兩個(gè)不同的群落，表明二者菌群結(jié)構(gòu)存在差異(圖1B)；基于加權(quán)UniFrac距離矩陣的樣本樹樹狀圖將MHE組與MHN組劃分為5個(gè)聚類組(圖1C)，其中第1、3、5組主要包含MHE，第2、4組包含大部分MHN，進(jìn)一步表明MHE組和MHN組腸道菌群分布存在差異。

2.3 腸道菌群豐度和分布差異

物種組成柱狀圖示：門水平上，MHE組疣微菌門(Verrucomicrobia)、變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteriota)的相對(duì)豐度高于MHN組，擬桿菌門(Bacteroidota)的相對(duì)豐度低于MHN組(圖2A)；屬水平上，MHE組鏈球菌屬(Streptococcus)、志賀菌屬(Escherichia-Shigella)、腸球菌屬(Enterococcus)、小類桿菌屬(Dialister)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)的相對(duì)豐度高于MHN組，普氏菌屬(Prevotella)、糞桿菌屬(Faecalibacterium)、擬桿菌屬(Bacteroides)的相對(duì)豐度低于MHN組(圖2B)。物種豐度聚類熱圖在屬水平上的結(jié)果與物種組成柱狀圖基本一致，但門水平上兩組變形菌門、擬桿菌門的相對(duì)豐度無明顯差異。除此之外，MHE組在門水平上放線菌門、綠彎菌門(Chloroflexi)、酸桿菌門(Acidobacteriota)、芽單胞菌門(Gemmatimona-dota)，屬水平上柯林斯氏菌屬(Collinsella)、梭桿菌屬(Fusobacteriota)、阿克曼菌屬(Akkermansia)的相對(duì)豐度均增高(圖2C、2D)。

圖2 MHE組與MHN組腸道菌群分布特征

LDA結(jié)果顯示，放線菌門、雙歧桿菌屬在MHE組呈優(yōu)勢(shì)分布，腸球菌屬、酸氨基球菌(Acidaminococcales)、芽孢桿菌屬(Phascolarctobacterium)在MHN組呈優(yōu)勢(shì)分布(圖3)。

圖3 MHE組與MHN組腸道菌群分布比較的LDA柱狀圖

3 討論

基于腸道菌群16S rRNA測(cè)序結(jié)果，本研究對(duì)MHE和MHN的腸道菌群差異進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示MHE組腸道菌群α多樣性較MHN組降低，β多樣性與MHN組存在差異；二者腸道菌群分布亦存在明顯區(qū)別，主要表現(xiàn)為MHE組在門水平上疣微菌門、變形菌門、放線菌門，屬水平上柯林斯氏菌屬、梭桿菌屬、雙歧桿菌屬等菌種表達(dá)增多，以及門水平上擬桿菌門，屬水平上擬桿菌屬、普氏菌屬、糞桿菌屬等菌種表達(dá)減少，可能在癲癇的發(fā)生中發(fā)揮促進(jìn)作用。

人類腸道聚集的菌群總量為億萬級(jí)，約是人體細(xì)胞的1.3倍[8]，幾乎參與機(jī)體所有疾病的調(diào)控，因此腸道菌群被稱為人體的“第二大腦”。腸道菌群可通過神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)以及免疫炎癥反應(yīng)等途徑，影響神經(jīng)遞質(zhì)合成與釋放、迷走神經(jīng)活性、微生物代謝，從而對(duì)大腦的生理、行為和認(rèn)知功能產(chǎn)生顯著影響，此種腸道與大腦之間的調(diào)控機(jī)制被稱為“腦-腸軸”[7]。近年來，隨著16S rRNA高通量測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用，臨床對(duì)腸道菌群的認(rèn)識(shí)不斷提升，已有多項(xiàng)研究表明腸道菌群與帕金森病、多發(fā)性硬化、阿爾茨海默癥等多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病存在直接或間接關(guān)聯(lián)性[1]。針對(duì)腸道菌群與癲癇的相關(guān)性，研究者已進(jìn)行了多方面探索[9-10]。王世榮等[11]研究表明，腸道微生物可衍生多種神經(jīng)遞質(zhì)，如乙酰膽堿(乳酸菌家族產(chǎn)生)、γ-氨基丁酸(雙歧桿菌和乳酸菌家族產(chǎn)生)和5-羥色胺(腸球菌和鏈球菌家族產(chǎn)生)，導(dǎo)致興奮-抑制性中樞神經(jīng)系統(tǒng)失衡，增加癲癇發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。Peng等[9]在一項(xiàng)病例對(duì)照研究中發(fā)現(xiàn)，與健康對(duì)照人群比較，癲癇患者腸道菌群在門水平和屬水平均有明顯改變，表現(xiàn)為一些罕見菌屬如奈瑟菌屬、糞球菌屬、梭桿菌屬、羅氏菌屬等含量異常增加。Holmes等[12]通過小鼠模型證實(shí)，生酮飲食引發(fā)的腸道菌群改變可降低戊四唑誘發(fā)癲癇的易感性，為通過改變腸道菌群組成進(jìn)行抗癲癇治療提供了研究依據(jù)。2018年國內(nèi)首次報(bào)道了糞菌移植成功治療癲癇的案例，患者為一位合并克羅恩病的癲癇女性，經(jīng)糞菌移植后停用抗癲癇藥物20個(gè)月無癲癇發(fā)作，證實(shí)菌群移植可通過重塑腸道微生物治療癲癇[13]。但腸道菌群受環(huán)境的影響較顯著[14]。Li等[15]對(duì)不同海拔地區(qū)人群進(jìn)行腸道菌群檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，低氧、低氣壓的環(huán)境特點(diǎn)對(duì)腸道菌群的組成結(jié)構(gòu)存在顯著影響，表現(xiàn)為與平原地區(qū)漢族人群相比，高原漢族人群腸道菌群中的布勞蒂亞菌屬、酸氨基球菌屬、梭桿菌屬等豐度增加，顫螺菌屬和薩特斯菌屬豐度顯著減少，提示海拔可能是影響腸道菌群組成的關(guān)鍵環(huán)境因素之一。

α多樣性、β多樣性是評(píng)估菌群多樣性的最常用指標(biāo)之一。Gong等[16]比較了癲癇患者與健康人群腸道菌群多樣性后發(fā)現(xiàn)，癲癇組Sobs、Shannon、Chao指數(shù)均降低。Cui等[17]研究發(fā)現(xiàn)，癲癇患者Simpson、Shannon、ACE指數(shù)均較健康人群降低。本研究以健康人群為對(duì)照，評(píng)估了中高海拔地區(qū)癲癇患者腸道菌群變化特征，以期為癲癇病因?qū)W研究提供思路。結(jié)果顯示二者腸道菌群α多樣性存在顯著差異，表現(xiàn)為MHE組ACE指數(shù)、Chao指數(shù)、Shannon指數(shù)均較MHN組降低。ACE指數(shù)、Chao指數(shù)均為菌群豐度的評(píng)估指標(biāo)，其數(shù)值越大表示菌群豐度越高；Shannon指數(shù)綜合考慮了群落的豐富度和均勻度，其數(shù)值越高表明群落的多樣性越高。α多樣性分析提示，癲癇患者腸道菌群種類及豐度均降低，與既往研究結(jié)果基本一致[16-17]。在β多樣性分析中，癲癇患者腸道菌群形成了不同于健康人群的群落，提示二者的菌群結(jié)構(gòu)存在差異，腸道菌群可能參與了癲癇的發(fā)生與發(fā)展。

本研究進(jìn)一步比較了MHE與MHN腸道菌群組成差異，結(jié)果顯示相較于MHN組，MHE組在門、屬水平存在多種差異性表達(dá)菌群，表現(xiàn)為疣微菌門、梭桿菌屬、鏈球菌屬、柯林斯氏菌屬等豐度增高，提示癲癇患者腸道菌群處于明顯紊亂狀態(tài)，可能促進(jìn)了該病發(fā)生。文獻(xiàn)報(bào)道，疣微菌門[18]可促進(jìn)粘蛋白降解，該功能可破壞腸道黏膜屏障完整性，導(dǎo)致細(xì)菌易位；通過腸黏膜進(jìn)入血液的細(xì)菌可誘發(fā)全身炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致血腦屏障功能障礙，以致癲癇發(fā)病的閾值降低。梭桿菌屬是常見的機(jī)會(huì)致病菌、致癌菌，其在結(jié)直腸癌和腸炎患者中普遍存在[19]。研究表明[20-21]，梭桿菌屬可分泌多種具有致病性/侵入性毒素，引發(fā)腸道炎癥，而炎癥反應(yīng)已被證實(shí)與癲癇存在因果關(guān)系。鏈球菌屬是化膿性球菌中常見的革蘭陽性球菌，其過度生長可產(chǎn)生過量腫瘤壞死因子α、白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-6等炎癥介質(zhì)，不僅可引起持續(xù)性炎癥反應(yīng)，且腫瘤壞死因子α可促進(jìn)Ca2+內(nèi)流，導(dǎo)致神經(jīng)元興奮性增強(qiáng)，誘發(fā)癲癇發(fā)作[22-23]?？铝炙故暇鷮倬哂姓T導(dǎo)IL-17A表達(dá)的功能[24]，而癲癇發(fā)作期間IL-17A水平與癲癇發(fā)作頻率呈正相關(guān)[25-26]。雙歧桿菌作為益生菌，其與癲癇的關(guān)系尚未明確。動(dòng)物模型顯示[27-28]，生酮飲食干預(yù)后小鼠腸道中雙歧桿菌及促炎免疫細(xì)胞Th17水平均減少，提示生酮飲食治療難治性癲癇的機(jī)制可能與降低雙歧桿菌豐度相關(guān)。本研究可見癲癇患者雙歧桿菌屬表達(dá)豐度增加，與既往研究結(jié)果一致[27，29]。

除多種菌群豐度增多外，本研究亦發(fā)現(xiàn)MHE組擬桿菌門、擬桿菌屬、普氏菌屬、糞桿菌屬等菌種表達(dá)減少。糞桿菌、普氏菌、擬桿菌可產(chǎn)生丁酸鹽、乙酸鹽等短鏈脂肪酸(short-chain fatty acids，SCFAs)[30]，而SCFAs與中樞神經(jīng)系統(tǒng)免疫防御相關(guān)，此類菌種減少可降低SCFAs濃度，通過影響小膠質(zhì)細(xì)胞成熟、神經(jīng)遞質(zhì)水平、血腦屏障通透性，間接促進(jìn)癲癇發(fā)生發(fā)展[27]。

本研究局限性：(1)樣本例數(shù)相對(duì)較少，可能降低了檢驗(yàn)效能；(2)未納入民族、生活方式、飲食習(xí)慣等可能影響菌群特征的因素，可能導(dǎo)致研究結(jié)果存在偏倚；(3)缺乏相關(guān)機(jī)制的探索且由于僅為橫斷面研究，無法明確腸道菌群特征變化與癲癇發(fā)生的因果關(guān)系。期待未來增大樣本量并在基因、代謝層面進(jìn)一步驗(yàn)證腸道菌群特征與癲癇的相關(guān)性。

由于中高海拔地區(qū)獨(dú)特的地理位置及氣候特點(diǎn)，導(dǎo)致長期生活在該地區(qū)居民的腸道菌群分布與結(jié)構(gòu)具有特異性，目前中高海拔地區(qū)癲癇人群腸道菌群多樣性的相關(guān)研究仍相對(duì)空白。本研究首次揭示了中高海拔地區(qū)癲癇患者的腸道菌群分布特點(diǎn)，即疣微菌門、變形菌門、柯林斯氏菌屬、梭桿菌屬等菌種增多，擬桿菌門、擬桿菌屬、普氏菌屬、糞桿菌屬等菌種減少。本研究從腸道菌群的角度出發(fā)，分析了中海拔地區(qū)癲癇發(fā)病的可能病理生理機(jī)制，為癲癇病因?qū)W研究及治療策略制訂提供了線索和理論依據(jù)。

作者貢獻(xiàn)：鄭美玲負(fù)責(zé)標(biāo)本收集、文獻(xiàn)查閱、數(shù)據(jù)分析及論文撰寫；樊青俐負(fù)責(zé)研究設(shè)計(jì)與論文修訂；鐘蓮梅負(fù)責(zé)論文審核。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突