花威，畢臻樂，林琳，胡凱猛，聞丹憶

（上海立迪生物技術(shù)股份有限公司，上海 201203）

過去幾十年來，隨著腫瘤相關(guān)研究的突破，抗腫瘤藥物的數(shù)量激增[1]。腫瘤患者的生存期也因此得到一定程度的延長，然而大多數(shù)腫瘤患者的發(fā)病率和死亡率仍較高[2]。靶向抗癌藥物和免疫治療的研究近年來取得了顯著進(jìn)展，但藥物療效、安全性和耐藥問題仍然存在。相比其他疾病的治療藥物，Ⅰ期臨床抗腫瘤新藥獲得最終上市批準(zhǔn)的可能性非常低[3]，其主要原因之一是臨床前腫瘤模型與臨床患者之間存在差異性。缺乏合適的研究模型不僅在一定程度上限制了新藥研發(fā)，而且阻礙了精準(zhǔn)醫(yī)療的發(fā)展[4-5]。目前，腫瘤的發(fā)生、發(fā)展通常被認(rèn)為與遺傳因素、表觀遺傳改變以及環(huán)境因素等相關(guān)，而腫瘤生物模型可以模擬腫瘤發(fā)生和發(fā)展，有助于進(jìn)行腫瘤的機制研究，可為腫瘤患者提供更好的治療選擇。本文旨在探討各類臨床前腫瘤模型的特征、效用及優(yōu)缺點，并針對患者的精準(zhǔn)治療，闡述基于腫瘤生物模型的功能性檢測平臺的發(fā)展情況，并就其在體外診斷（in vitrodiagnostics，IVD）中應(yīng)用前景進(jìn)行展望。

1 腫瘤生物模型概況

腫瘤生物模型包括體內(nèi)培養(yǎng)模型和體外培養(yǎng)模型，是用于進(jìn)一步研究腫瘤細(xì)胞或組織的可擴增生物模型。體外模型包括細(xì)胞系、條件性重編程（conditional reprogramming，CR）細(xì)胞、類器官（organoids）；體內(nèi)模型包括同源腫瘤模型、細(xì)胞源性或人源性腫瘤模型等，基于這些腫瘤生物模型的功能性檢測各有特點（見表1）。

表1 功能性檢測平臺的特征Table 1 Characteristics of functional assays

1.1 體外培養(yǎng)模型

1.1.1 腫瘤細(xì)胞系 傳統(tǒng)的腫瘤細(xì)胞系作為體內(nèi)外研究工具，在癌癥研究和藥物研發(fā)中的應(yīng)用時間較長，發(fā)揮著重要作用[6]。美國國家癌癥研究所（National Cancer Institute，NCI）和Hamon治療腫瘤學(xué)研究所建成了大量的原代細(xì)胞系。除了美國模式培養(yǎng)物保藏所（American Type Culture Collection，ATCC），全球亦有其他細(xì)胞庫保存有多種細(xì)胞系[7]。

1.1.2 條件性重編程細(xì)胞 傳統(tǒng)細(xì)胞系等體外模型也是癌癥研究的重要工具，但原發(fā)腫瘤細(xì)胞很難在體外進(jìn)行擴增，建立腫瘤細(xì)胞系的成功率低至1% ~10%[8]。然而CR技術(shù)有效提高了原代細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞系建立的成功率，一個關(guān)鍵因素是使用飼養(yǎng)細(xì)胞和Rho相關(guān)卷曲螺旋蛋白激酶（Rho-associated coiled-coil containing kinases，ROCK）抑制劑來幫助腫瘤細(xì)胞和其他上皮細(xì)胞在體外持續(xù)擴增（見圖1A）[9]。目前，大量腫瘤細(xì)胞通過CR技術(shù)建立，包括腺囊癌[10]、乳腺癌[11]、前列腺癌[12]、胰腺癌[13]、直腸癌[14]、肺癌[15]、宮頸癌[16]等。此外，CR細(xì)胞可使用人源腫瘤異種移植（patient-derived xenograft，PDX）模型和人源腫瘤類器官（patient derived organoid，PDO）建立[17]，其在傳代超過200代次的同時，還可保留腫瘤細(xì)胞異質(zhì)性[18]。CR細(xì)胞作為一種合適的體外藥效檢測工具，已應(yīng)用于藥物研發(fā)和精準(zhǔn)醫(yī)療[19-20]。Mimoto等[20]建立了復(fù)發(fā)性雌孕激素受體陽性（HR+）和人表皮生長因子受體陰性（HER2-）的乳腺癌CR細(xì)胞，檢測了腫瘤細(xì)胞異質(zhì)性和藥物敏感性：CR細(xì)胞的突變狀態(tài)和病理特征保持不變，但RNA表達(dá)與原發(fā)腫瘤細(xì)胞不同；雌激素受體陽性（ER+）/孕激素受體陽性（PgR+）/HER2-的肝轉(zhuǎn)移CR細(xì)胞對224種藥物的反應(yīng)結(jié)果顯示，其中66種化合物降低了細(xì)胞活力，包括選擇性雌激素受體降解劑（SERD）和細(xì)胞周期依賴性激酶4/6（CDK4/6）抑制劑；在轉(zhuǎn)移切除術(shù)后使用SERD和CDK4/6抑制劑治療的患者13個月無復(fù)發(fā)，與CR細(xì)胞藥物篩選結(jié)果一致。另一項研究從7例前列腺癌患者中提取了CR細(xì)胞，其包括原發(fā)性前列腺癌到晚期去勢抵抗性前列腺癌（castrationresistant prostate cancer，CRPC）等不同時期患者；通過對306種新興的抗癌藥物和臨床抗癌藥物的高通量篩選，確定了Bcl-2家族抑制劑navitoclax以及紫杉烷、美帕辛和類維生素A是抗CRPC CR細(xì)胞有效藥物，其中navitoclax最有效[21]。

圖1 CR細(xì)胞、類器官、PDX和MiniPDX流程圖Figure 1 Schematic of CR cells, organoids, MiniPDX and PDX

CR細(xì)胞可以通過二維（2D）培養(yǎng)、細(xì)胞球體模型或類器官培養(yǎng)[12]。CR細(xì)胞也可以接種到小鼠體內(nèi)以建立PDX模型[22]。這為建立性能更好的模型提供了一種新方法，包括乳腺癌PDX模型和其他成功率較低的腫瘤模型。CR細(xì)胞或任何其他體外模型的一個主要缺點是無法評估藥物的藥代動力學(xué)和藥效動力學(xué)（pharmacokinetics and pharmacodynamics，PK/PD）特性，因為被測藥物的濃度通常是恒定的，而藥物在體內(nèi)經(jīng)過吸收、分布、代謝和排泄（ADME）過程，濃度是動態(tài)變化的。此外，體外腫瘤模型一般不適用于前藥的評估。例如，替加氟作為5-氟尿嘧啶（5-FU）的前藥，在肝臟中緩慢代謝為5-FU，因此毒性低于5-FU[23]，而替加氟在臨床上被廣泛應(yīng)用于治療各類腫瘤，但在缺乏代謝酶的情況下，無法在體外直接評估其抗腫瘤作用[24]。

1.1.3 類器官模型 類器官是一種在體外環(huán)境下培養(yǎng)而成的具備三維（3D）結(jié)構(gòu)的微器官。首個類器官就是利用Lgr5+小鼠腸道干細(xì)胞構(gòu)建的小腸類器官[25]。和細(xì)胞球不同的是，類器官是在3D結(jié)構(gòu)中生長的細(xì)胞，在組織學(xué)和遺傳學(xué)上均與原始組織相似，并且類器官還保留了再生能力[26]。

應(yīng)用類器官技術(shù)可將患者腫瘤組織和循環(huán)腫瘤細(xì)胞中分離的細(xì)胞培養(yǎng)成類器官（見圖1B）[27]?；颊邅碓吹念惼鞴倏梢栽隗w外擴增，長期低溫保存。除了能夠擴增之外，類器官還可以保留腫瘤的異質(zhì)性。一些誘變技術(shù)如成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列（CRISPR）/CRISPR相關(guān)蛋白9（Cas9）已被發(fā)現(xiàn)并被用于誘導(dǎo)腫瘤組織發(fā)展成腫瘤類器官[28]。生成類器官所需的時間隨腫瘤種類的不同而有所差異[29]。根據(jù)已建立的各種PDOs發(fā)現(xiàn)不同瘤種的建模成功率也不同，其中非小細(xì)胞肺癌（non-small-cell lung cancer，NSCLC）成功率最高達(dá)88%[30]，而肝細(xì)胞癌（HCC）類器官的建模成功率僅為19%[31]。然而，體外模型共有的缺點同樣存在于類器官，其無法評估需要經(jīng)過代謝的藥物和抗血管生成藥物，但類器官同樣可以移植，從而實現(xiàn)體內(nèi)模型的建立和體內(nèi)藥效研究。

1.2 腫瘤體內(nèi)模型

1.2.1 同源腫瘤模型 同源腫瘤模型是通過將體外擴增的小鼠腫瘤細(xì)胞系皮下或原位注射到免疫功能缺陷的小鼠體內(nèi)建立。同源腫瘤模型在癌癥研究和藥物開發(fā)中的應(yīng)用已超過50年，涉及肺癌、乳腺癌、腸癌、胃癌和惡性黑色素瘤等癌種[32]。同源腫瘤模型于免疫小鼠體內(nèi)建立，因此適用于檢測影響免疫功能的藥物。有研究在一組常用的小鼠同源腫瘤模型（包括4T1、MC38、B16F10 AP-3、CT26和LL/2）中檢測了抗細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)蛋白4（CTLA-4）和抗程序性死亡配體1（PD-L1）治療的反應(yīng)，這些同源腫瘤模型對免疫治療表現(xiàn)出不同的反應(yīng)，在不同模型中基因表達(dá)存在顯著差異，這與腫瘤免疫浸潤相關(guān)；這類模型有“inflamed”表型和“non-inflamed”表型2種，選擇合適的模型用于免疫治療至關(guān)重要[33]。細(xì)胞系可快速在體外擴增，同源小鼠模型也具有建?？?、費用低、易傳代的優(yōu)點。然而，細(xì)胞系建模缺乏基因組、表觀遺傳和微環(huán)境異質(zhì)性，無法很好地模擬患者體內(nèi)的復(fù)雜環(huán)境[34]；另一個缺點是僅有少數(shù)細(xì)胞系可用來建立同源小鼠模型，限制了這些模型的應(yīng)用。

1.2.2 細(xì)胞源性異種移植模型 和同源腫瘤模型一樣，細(xì)胞源性異種移植（cell line-derived xenograft，CDX）建模也是通過體外擴增細(xì)胞系，隨后注射到小鼠體內(nèi)來完成?；贑DX模型易于傳代、建模周期短、可用性強和傳代費用低等優(yōu)點，CDX被大量用于藥物研發(fā)中的藥效、PK、PD研究[35]。Suzawa等[36]檢測了阿法替尼（一種不可逆的EGFR/HER2抑制劑）在幾種NSCLC細(xì)胞系（包括A549、Calu-3、HCC827、NCI-H1299、NCI-H1781、NCI-H1975、NCIH1993和NCI-H2170）中的抗腫瘤活性，探討細(xì)胞遺傳改變與細(xì)胞對阿法替尼敏感的相關(guān)性；發(fā)現(xiàn)HER2突變的細(xì)胞系（H2170、Calu-3和H1781）對阿法替尼敏感，而非HER2突變或表皮生長因子受體（EGFR）的NSCLC細(xì)胞系則對阿法替尼不敏感。然而，CDX模型也存在一些顯著的缺點：1）體外傳代后細(xì)胞生物特征可能會改變，致使不同實驗室使用的細(xì)胞系在致瘤性、基因組和表觀遺傳特性方面存在差異；2）與原發(fā)腫瘤相比，CDX異質(zhì)性較低；3）CDX是在免疫缺陷小鼠中建立，這限制了CDX在免疫治療和免疫調(diào)節(jié)藥物研究中的應(yīng)用[37-38]。

1.2.3 基因工程小鼠模型 基因工程小鼠模型（genetically engineered mouse model，GEMM）是原位腫瘤模型，通過基因改造技術(shù)使致癌基因表達(dá)或抑癌基因缺失。致癌基因相關(guān)研究和基因改造技術(shù)的發(fā)展促成了基因改造小鼠的出現(xiàn)。這些模型主要使用組織特異性啟動子來驅(qū)動致癌基因的表達(dá)或使用組織特異性重組酶來驅(qū)動抑癌基因的缺失[39]。GEMM是一種自發(fā)模型，可以模擬癌前病變和腫瘤發(fā)生的整個過程。該模型已用于卵巢癌生物標(biāo)志物的開發(fā)[40]、腫瘤機制研究和臨床前藥物試驗[41]。例如，小鼠前列腺轉(zhuǎn)基因腺癌模型（transgenic adenocarcinoma mouse prostate，TRAMP）即經(jīng)雄激素調(diào)節(jié)的前列腺癌模型，該模型可發(fā)展為進(jìn)行性、多病灶、異質(zhì)性前列腺癌，與性成熟度相關(guān)，與臨床疾病高度相似[42]。此外，GEMM也適用于研究免疫治療和免疫相關(guān)藥物。GEMM的優(yōu)點包括原位性、具有完整的免疫系統(tǒng)和微環(huán)境等。然而，通過改變腫瘤驅(qū)動基因建立的腫瘤模型并不能完全模擬真實人體體內(nèi)復(fù)雜的腫瘤環(huán)境。另外，通過基因敲除或點突變技術(shù)建立的基因工程小鼠模型，往往會對其他基因和生物學(xué)過程產(chǎn)生影響，這些影響可能并非研究者預(yù)期的。由于動物本身的異質(zhì)性，GEMM腫瘤形成具有不確定性，潛伏期相較其他移植模型更長，因此，建模需要大量的小鼠和更長的建模周期。此外，GEMM往往只是單基因變異的模型，在模擬人類疾病的復(fù)雜性方面存在的局限性限制了該技術(shù)在癌癥研究中的運用。

1.2.4 人源腫瘤異種移植模型 PDX是通過皮下或原位植入手術(shù)將活檢腫瘤組織塊移植到免疫缺陷小鼠體內(nèi)（見圖1C）[43]。從胸腹水和循環(huán)腫瘤細(xì)胞中富集的腫瘤細(xì)胞也可用于PDX建模[44]。植入后，PDX模型成瘤潛伏期為幾周到幾個月不等，這與癌種、建模方法和原發(fā)腫瘤的生長特征有關(guān)[45]。PDX經(jīng)體內(nèi)連續(xù)傳代，可長期保存，也可用于藥效學(xué)研究[46]。目前，已成功建立不同癌種的PDX模型，包括肺癌[47]、乳腺癌[48]、胰腺癌[49]、結(jié)直腸癌[50]、胃癌[51]、卵巢癌[52]、肝細(xì)胞癌[53]、前列腺癌[54]、腦腫瘤[55]、黑色素瘤[56]、頭頸部腫瘤[57]等。不同癌種的建模成功率為10% ~ 100%。大量研究證明，PDX可以維持原發(fā)腫瘤的基因譜、基因表達(dá)模式、組織學(xué)和藥物反應(yīng)，以及原發(fā)性腫瘤的分子和細(xì)胞異質(zhì)性[58]。此外，PDX模型也顯示出預(yù)測轉(zhuǎn)移潛能和藥物反應(yīng)的可能性[59]。當(dāng)前，PDX模型被廣泛認(rèn)為是比CDX更具有生理相關(guān)性的臨床前模型，廣泛應(yīng)用于癌癥機制的研究和抗腫瘤藥物的發(fā)現(xiàn)[60]。Gao等[60]建立了約1 000例具有多驅(qū)動基因突變的PDX模型，評估了6個癌種對62種不同治療的反應(yīng)，確定了基因型與藥物反應(yīng)間有相關(guān)性，在闡明耐藥機制和候選治療方案方面取得了突破性進(jìn)展。盡管PDX具有顯著的優(yōu)勢，但其建模周期長，PDX建模和藥效研究通常需要6 ~ 8個月的時間，且費用高，不適合用于大量篩藥和個性化精準(zhǔn)醫(yī)療[61]。免疫缺陷小鼠PDX模型由于自身的免疫缺陷，不適用于免疫調(diào)節(jié)劑療效評價。此外，研究表明，人類基質(zhì)細(xì)胞在PDX連續(xù)傳代過程中會逐漸減少，并逐漸被小鼠成分取代，這意味著代次越靠后PDX越偏向鼠源，也就無法保留原代腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性[62]。

除了上述生物模型以外，斑馬魚、線蟲、果蠅等生物模型也廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)的研究領(lǐng)域。腫瘤生物模型的轉(zhuǎn)化研究一直是近幾年研究的熱點。腫瘤的精準(zhǔn)治療已進(jìn)入到依賴于功能性檢測的時代，功能性檢測的基礎(chǔ)就是各類腫瘤生物模型。基于腫瘤生物模型的研究進(jìn)展，功能性檢測的平臺也在不斷更新。

2 基于腫瘤生物模型的功能性檢測

2.1 傳統(tǒng)的腫瘤治療敏感性和耐藥性分析

預(yù)測性的功能性檢測特別是腫瘤治療的敏感性和耐藥分析（chemosensitivity and resistance assays，CSRA）已被研究了幾十年[63]。這些測試依賴于從醫(yī)療過程中獲得的病理合格樣本，包括診斷活檢、原發(fā)病灶或轉(zhuǎn)移灶、積液、腹水、含有循環(huán)腫瘤細(xì)胞的血液等，進(jìn)而對患者腫瘤進(jìn)行建模，包括上述提及的CR細(xì)胞培養(yǎng)、PDX模型和PDO模型。這些模型總體而言在不同程度上保留了患者的遺傳轉(zhuǎn)錄特征及腫瘤異質(zhì)性，在暴露于目標(biāo)治療后，可以較為精準(zhǔn)地提供腫瘤治療藥物的敏感性和耐藥性功能特征。功能性檢測不在于確定疾病表型的根源，而是在于捕捉所有生物學(xué)變量之間的相互作用產(chǎn)生的對藥物的最終反應(yīng)。功能性檢測最終被整合到臨床決策過程中，為癌癥患者接受個體化治療提供參考[64]。最早的化療敏感性測定方法是在20世紀(jì)70年代末設(shè)計的，其主要基于腫瘤的克隆性，但仍顯示出有前景的結(jié)果。近年來，隨著不斷改進(jìn)，基于各種藥敏檢測結(jié)果挑選的化療方案達(dá)到了較高的準(zhǔn)確性[65]。大多數(shù)情況下，這些功能性檢測常見步驟如下：1）分離腫瘤標(biāo)本和腫瘤細(xì)胞；2）在化療藥物管理下進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng)；3）測定腫瘤細(xì)胞活力、死亡率；4）分析數(shù)據(jù)以產(chǎn)生化療敏感性特征。

一項meta分析納入了1991—2019年的42項研究，文獻(xiàn)中針對泛癌種的藥敏結(jié)果證實了功能性檢測在多個癌種的準(zhǔn)確性、敏感性和特異性：其中細(xì)胞培養(yǎng)的成功率均值為88.2%，各種功能性檢測的平均靈敏度在80%以上，陽性預(yù)測值中位數(shù)為83%，陰性預(yù)測值中位數(shù)為82.9%，準(zhǔn)確率中位數(shù)為77.8%[64]。使用功能性檢測還可以為患者帶來臨床獲益，但仍需通過更可靠的干預(yù)性隨機研究來證實。傳統(tǒng)功能性檢測在腫瘤原代細(xì)胞的異質(zhì)性保留和腫瘤的微環(huán)境變化方面依然存在極大的改進(jìn)空間。2015年，研究人員提出了“下一代功能性檢測”的概念，類似于二代測序（next-generation sequencing，NGS）[66]，包括2D離體藥物毒性測試、PDX、PDO等技術(shù)。這些功能性檢測的核心目的是解決基因配對治療癌癥的局限性。

2.2 創(chuàng)新型功能性檢測平臺

2.2.1 患者來源類器官藥敏檢測 Kopper等[67]從32例患者身上獲取腫瘤組織，建立了56個腫瘤類器官模型，包含了卵巢癌的所有主要亞型，這些類器官概括了卵巢癌的特征和腫瘤異質(zhì)性，并表現(xiàn)出患者內(nèi)和患者間的異質(zhì)性，藥敏試驗發(fā)現(xiàn)不同卵巢癌亞型對金標(biāo)準(zhǔn)鉑類藥物化療的反應(yīng)不同。與PDX相比，類器官的實驗周期更短，成本更低，可用于中高通量藥物篩選。因此，建立患者來源類器官評估抗癌藥物，是功能性檢測的方法之一。Pauli等[68]從769例患者中建立了56種腫瘤來源的類器官和19種PDX模型，類器官用于高通量藥物篩選，PDX模型用于驗證藥物方案；該研究將基因組數(shù)據(jù)與個性化體外和體內(nèi)腫瘤模型的藥物篩選相結(jié)合，指導(dǎo)癌癥精準(zhǔn)護(hù)理并推動進(jìn)一步研究。Yao等[69]研究發(fā)現(xiàn)，患者的放化療反應(yīng)與直腸癌類器官（RCO）反應(yīng)高度匹配，準(zhǔn)確率為84.43%，敏感性為78.01%，特異性為91.97%。Tiriac等[70]從入組新輔助放化療（NACR）Ⅲ期臨床試驗的患者中收集了112個局部進(jìn)展期直腸癌（LARC）的活檢組織，并建立了96例PDOs；PDOs的放化療反應(yīng)與患者的臨床反應(yīng)一致，準(zhǔn)確性為84.43%，敏感性為78.01%，特異性為91.97%。提示，PDO可以預(yù)測LARC患者在臨床中的反應(yīng)，并可能用作直腸癌治療的伴隨診斷（companion diagnostics，CDx）工具。值得注意的是，類器官也可以移植，進(jìn)行體內(nèi)建模和藥效研究[67]。

盡管類器官建模速度快且費用低，但其在癌癥研究中的應(yīng)用仍存在局限性。類器官的細(xì)胞在培養(yǎng)過程中會逐漸減少，異質(zhì)性較PDX低。此外，類器官只能在體外給藥，因此不適合評估需要進(jìn)行代謝后才能發(fā)揮作用的藥物[8]。

2.2.2 MiniPDX檢測 MiniPDX是一種體內(nèi)類器官技術(shù)，旨在提供更快速、更準(zhǔn)確的藥效測試，指導(dǎo)個性化癌癥治療[71]。從患者身上獲取新鮮腫瘤樣本，包括手術(shù)樣本、活檢樣本、穿刺樣本以及胸腹水樣本，消化成單細(xì)胞懸液，隨后注入MiniPDX膠囊管中，植入免疫缺陷小鼠皮下，連續(xù)給藥7天后，取出膠囊管，使用相對光單位（relative light unit，RLU）測定腫瘤細(xì)胞增殖情況抑制率（tumor cellular growth inhibitor，TCGI），可顯示該模型對各組治療方案的反應(yīng)（見圖1D）。

MiniPDX藥敏檢測的優(yōu)點為周期短、體內(nèi)藥敏檢測結(jié)果與臨床治療具有高度一致性。MiniPDX藥敏檢測10天可出結(jié)果，不僅可用于抗腫瘤藥物臨床前研究，還可為臨床患者提供快速準(zhǔn)確的藥敏檢測結(jié)果。一位子宮內(nèi)膜間質(zhì)肉瘤患者術(shù)后化療2個療程后發(fā)生肺轉(zhuǎn)移，取轉(zhuǎn)移病灶進(jìn)行MiniPDX藥敏檢測結(jié)果顯示，該患者對阿帕替尼、阿帕替尼+奧拉帕尼2組藥物敏感，經(jīng)過4個月改進(jìn)治療后，該患者肺轉(zhuǎn)移灶逐漸消退[71]。一項針對膽囊癌的研究用MiniPDX檢測了以吉西他濱、奧沙利鉑、5-FU、納米顆粒白蛋白結(jié)合型（NAB）紫杉醇和伊立替康等45種最常用的化療藥物的敏感性，MiniPDX藥敏檢測指導(dǎo)的術(shù)后輔助化療方案顯著延長了其生存期，其中中位總生存期從13.9個月延長到18.6個月，疾病無進(jìn)展生存期從12個月延長到17.6個月[72]。另一項轉(zhuǎn)移性十二指腸腺癌的研究將MiniPDX與NGS相結(jié)合，在揭示關(guān)鍵基因突變的同時進(jìn)行MiniPDX快速藥敏檢測，NGS測序結(jié)果對MiniPDX的藥敏測試結(jié)果提供了進(jìn)一步支持，患者無病生存期達(dá)到34個月[73]。一項研究利用MiniPDX藥敏檢測結(jié)果指導(dǎo)鉑耐藥卵巢癌患者治療，其臨床治療獲益率高達(dá)75%[74]。Wang等[75]對NSCLC治療進(jìn)行研究顯示，MniPDX給藥組患者總生存期（OS）和無進(jìn)展生存期（PFS）優(yōu)于常規(guī)給藥組。Li等[76]在MiniPDX模型上驗證了遺傳學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)預(yù)測的藥物反應(yīng)，建立了從大型組學(xué)數(shù)據(jù)集生成到結(jié)直腸癌體內(nèi)藥物試驗?zāi)Ｐ偷恼麄€工作流程。Yang等[77]選取42例肝癌患者使用MiniPDX篩選最敏感的抗腫瘤藥物方案進(jìn)行肝部分切除術(shù)后的預(yù)防性治療，其與對照（索拉非尼）組相比，顯著延長了肝癌患者的生存期。有研究在患者來源的MiniPDX上證明了靶向神經(jīng)酰胺通路的中間體1-磷酸鞘氨醇（sphingosine-1-phosphate，S1P）是治療轉(zhuǎn)錄組雄激素受體（LAR）腫瘤的一種有前景的方法，其結(jié)果與患者來源的類器官一致，提示在某些情況下，MiniPDX能夠作為基礎(chǔ)研究的驗證工具[78]。由于MiniPDX藥敏試驗結(jié)果與各類腫瘤患者的臨床反應(yīng)基本一致，MiniPDX模型在指導(dǎo)癌癥個體化治療方面顯示出巨大潛力。功能性檢測是有價值的體外診斷工具，已超越了概念驗證階段，其不僅本身可發(fā)揮用藥指導(dǎo)的作用，在結(jié)合分子診斷后也更能進(jìn)一步推動精準(zhǔn)醫(yī)療的發(fā)展。

雖然 MiniPDX 藥敏檢測模型在臨床實踐中的應(yīng)用取得了較大進(jìn)展，但由于MiniPDX 模型使用免疫缺陷小鼠，其無法用于常規(guī)檢測腫瘤免疫治療藥物。目前針對免疫治療的MiniPDX也初步研發(fā)成功，該體系稱為腫瘤免疫快速體內(nèi)療效試驗（immunooncology fastin vivoefficacy test，IO-FIVE），在常規(guī)MiniPDX測試階段較好地保留了人源免疫細(xì)胞，并可在10天左右完成測試。目前已完成超過100例臨床樣本的IO-FIVE測試，可較好地區(qū)分免疫藥物及免疫治療方案的敏感性和耐藥性。

目前，功能性檢測仍應(yīng)用于轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)的場景中，IVD技術(shù)為醫(yī)療領(lǐng)域用于診斷、監(jiān)測、預(yù)防疾病的重要工具。然而，鑒于功能性檢測特殊性以及目前管理政策的影響，功能性檢測朝著IVD轉(zhuǎn)化仍然面臨著諸多挑戰(zhàn)。

3 功能性檢測的IVD之路面臨的挑戰(zhàn)

IVD歸類為醫(yī)療器械。美國食品和藥品監(jiān)督管理局（FDA）進(jìn)一步定義IVD作為醫(yī)療器械的子集，包含“旨在用于疾病或其他狀況診斷的試劑、儀器和系統(tǒng)，包括健康狀況的確定，目的是為了治愈、緩解、處理、預(yù)防疾病或其后遺癥”。隨著IVD技術(shù)的迅猛發(fā)展，檢測層面從基因水平的基因測序、點突變基因診斷、單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms，SNP）檢測，到蛋白水平的各種生物標(biāo)志物檢測，到細(xì)胞水平的循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cell，CTC）檢測、循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）檢測、薄層液基細(xì)胞學(xué)檢測（thinprep cytologic test，TCT）等，到組織水平上的正電子發(fā)射斷層顯像（PET）/計算機斷層掃描（CT）等，再到藥敏層面的功能性檢測技術(shù)。總之，IVD正在向著更簡便、更快捷、非侵入性、多信息化的方向發(fā)展。

功能性診斷（也稱功能性檢測）技術(shù)主要基于腫瘤患者的臨床組織樣本，進(jìn)行原代腫瘤細(xì)胞系（patient-derived cell，PDC）、PDO和PDX的構(gòu)建，進(jìn)而依托構(gòu)建的模型進(jìn)行腫瘤藥物的敏感性測試，為腫瘤患者的精準(zhǔn)診斷和治療策略提供重要的線索和依據(jù)。從概念而言，功能性檢測完全符合IVD概念中患者樣本、體外檢測分析、指導(dǎo)臨床的三大核心內(nèi)涵，是一種新型的IVD技術(shù)平臺。這些功能性檢測可獨立發(fā)揮重要作用，也可與分子診斷學(xué)（如NGS）結(jié)合以提供更加綜合的信息。目前，功能性檢測在規(guī)范化等方面仍需進(jìn)一步完善，以整合于IVD，從而使其進(jìn)入臨床常規(guī)路徑。

3.1 功能性檢測作為伴隨診斷和補充診斷發(fā)揮作用

目前，大部分CDx屬于IVD范疇。CDx和補充診斷（complementary diagnostics，CoDx）的定義很寬泛，前者是將患者體內(nèi)的特定生物標(biāo)志物（無論是單個或一組突變，還是蛋白質(zhì)產(chǎn)物）與特定藥物相關(guān)聯(lián)，后者能夠使用所有CDx使用的技術(shù)和方法，對于患者用藥不是必需的。二者使用性質(zhì)有一定差異，CDx為必須進(jìn)行的檢測，以決定是否適合使用特定的藥物，而CoDx是選擇性的，為治療方案提供信息和依據(jù)，但與用藥無關(guān)。然而，另一種類型的CoDx經(jīng)常被忽視，即功能性檢測。功能性檢測可將臨床前體外/體內(nèi)試驗（由研究對候選藥物的應(yīng)答的特定模型引導(dǎo)）轉(zhuǎn)化到臨床適用的體外實驗；實際上，功能性檢測在治療開始的上游，即患者自己的細(xì)胞或基于患者的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)或移植，可針對特定適應(yīng)證的可用療法而進(jìn)行藥敏試驗。對于無已知敏感性或克服耐藥性藥物的患者來說，功能性檢測結(jié)果可作為生物標(biāo)志物檢測的替代策略，根據(jù)功能性檢測結(jié)果指導(dǎo)患者用藥。因此，功能性檢測可能為包括化療、靶向治療等在內(nèi)的全身性治療提供個體化的藥物使用方法。

CDx和CoDx可能直接影響患者的治療過程，因此，它們需要受到嚴(yán)格的監(jiān)管，其生產(chǎn)和執(zhí)行也需要遵循嚴(yán)格的質(zhì)量管理框架。功能性檢測由于其性質(zhì)上屬于CoDx之一，其結(jié)果針對給定適應(yīng)證的特定治療有推薦和指導(dǎo)屬性；醫(yī)療團(tuán)隊根據(jù)這些信息和病理特征，最終決定最佳的治療策略。然而，與傳統(tǒng)的CDx或CoDx不同，功能性檢測可同時預(yù)測幾種藥物的療效，而非單一治療方案。適用于CoDx的監(jiān)管框架也適用于功能性檢測[64]。

3.2 功能性檢測的方向

3.2.1 內(nèi)在檢測效能的提高和論證 CDx和CoDx所選治療方案的風(fēng)險和獲益依賴于檢測結(jié)果與臨床的一致性。為了獲得足夠的可靠性，必須對功能性檢測的穩(wěn)定性、可重復(fù)性和臨床獲益進(jìn)行嚴(yán)格的論證。與CDx和CoDx一樣，功能性檢測的診斷效能也需3個方面的驗證：分析驗證、臨床驗證和臨床應(yīng)用[66]。分析驗證依賴于幾個參數(shù)：重復(fù)性（同一樣品的連續(xù)測量之間的一致性），再現(xiàn)性（同一測量的幾個樣品之間的一致性），精確度（測量結(jié)果與真實值的接近性），準(zhǔn)確度（測量的重復(fù)性程度）和檢測限（為產(chǎn)生可靠結(jié)果而評估的物質(zhì)的最小量）。患者的臨床應(yīng)答是評估這些功能性檢測技術(shù)優(yōu)劣的金標(biāo)準(zhǔn)。因此，上述多數(shù)參數(shù)必須來源于直接涉及臨床患者的研究。目前，關(guān)于生物標(biāo)志物檢測的總體可重復(fù)性尚無通用規(guī)則；然而，低于15%的變異系數(shù)被認(rèn)為可達(dá)到目標(biāo)[79]。準(zhǔn)確性可在早期發(fā)展階段通過易于獲得的體外模型（如細(xì)胞系）進(jìn)行研究。

3.2.2 標(biāo)準(zhǔn)操作流程和自動化 完善的標(biāo)準(zhǔn)操作程序、對操作人員的充分培訓(xùn)、檢測材料的質(zhì)量（耗材和試劑的批量控制，限制使用具有完全受控配方的標(biāo)準(zhǔn)化試劑）[80]、適當(dāng)?shù)膬x器控制和維護(hù)是對重現(xiàn)性產(chǎn)生積極影響的因素。自動化（液體處理、終點測量）也是非常需要的，以確保整個操作流程能夠滿足在臨床診斷規(guī)模下的通量與樣本周轉(zhuǎn)需求，以及整個過程的可信性和可重復(fù)性，從而促進(jìn)整個流程符合監(jiān)管要求。目前，對于在基質(zhì)中生長的3D腫瘤模型尚未有統(tǒng)一的基質(zhì)處理標(biāo)準(zhǔn)流程，因此限制了其普遍適用性[81]。目前，提供功能性檢測服務(wù)的實驗室就其技術(shù)性能進(jìn)行交流較少，這可能也是相關(guān)技術(shù)普及的障礙之一。

3.2.3 樣本收集處理時間窗 在功能性檢測流程中，必須處理活細(xì)胞或細(xì)胞提取物，因此樣本收集、運輸和處理是關(guān)鍵步驟之一[82]。研究認(rèn)為，可以開發(fā)特定的緩沖液和程序來確保整個功能性檢測過程的標(biāo)準(zhǔn)化，從而進(jìn)行流程控制[83]。樣品質(zhì)量取決于可用的材料，應(yīng)該包含足夠的腫瘤組織，而將不需要的區(qū)域（壞死、纖維、脂肪、黏液或含有血凝塊）減少到最小。樣品收集與運輸方面的主要問題是從床旁采樣到IVD實驗室處理之間的時間窗。樣品收集與運輸需注意：1）保存樣品完整性的最大延遲時間為72 h；2）在不遲于取樣后48 h內(nèi)處理的樣品可獲得最佳樣品完整性；3）樣本冷凍保存是不可取的，因為它既降低了可用于檢測的細(xì)胞數(shù)量，又減弱了它們對細(xì)胞毒性藥物的反應(yīng)。由于技術(shù)和法律風(fēng)險，這種受限的時間窗在一定程度上阻礙了樣品的長途運輸和跨境運輸；樣本如要直接進(jìn)入目標(biāo)國家，還需要繼續(xù)研發(fā)，在延長樣本收集時間的情況下保證檢測的成功性和準(zhǔn)確性。

3.2.4 診斷性臨床試驗 通過適當(dāng)?shù)目刂圃O(shè)計和性能測試，進(jìn)而評估IVD的臨床有效性，其目的是證明其“識別、測量或預(yù)測的結(jié)果是否存在易感性”的能力，即臨床診斷效能[66]。診斷性研究的關(guān)鍵參數(shù)包括診斷靈敏度、診斷特異度、陽性預(yù)測值（positive predict value，PPV）和陰性預(yù)測值（negative predict value，NPV）[84]。對于功能性檢測而言，終點值至關(guān)重要，用于預(yù)測對特定藥物有無應(yīng)答。同時，還應(yīng)全面評估分析功能性檢測過程中的限制因素，特別是關(guān)于采樣和運輸?shù)鹊南拗埔蛩?。最后，臨床效用能夠證明該功能性檢測的結(jié)果與臨床使用結(jié)果相比，能否提高患者從個性化治療中獲得的治療效益。根據(jù)美國臨床腫瘤協(xié)會（American Society of Clinical Oncology，ASCO）的最新建議[85]，臨床效用的評估需要開展大型、隨機、前瞻性臨床試驗，在檢測指導(dǎo)的治療或腫瘤科醫(yī)師選擇的治療后，研究患者治療結(jié)局（緩解率、無進(jìn)展生存期、總生存期）。

目前，隨著針對大量適應(yīng)證的不同方案的開發(fā)，腫瘤藥物敏感性檢測方法也隨之增加。從技術(shù)差異的角度來看，每種上市的抗PD-1/PD-L1抗體均有其配套的CDx，如PD-L1表達(dá)、dd錯配修復(fù)（mismatch repair，MMR）、微衛(wèi)星不穩(wěn)定（microsatellite instability，MSI）檢測等。臨床試驗確定了上述診斷技術(shù)的具體臨界值，療效明確[86]。然而，這些檢測方法不能相互替代，需要實驗室進(jìn)行一系列測試，以適應(yīng)醫(yī)生對一種藥物或另一種藥物的偏好。盡管如此，可以預(yù)見的是，免疫檢查點抑制劑（immune checkpoint inhibitor，ICI）的CDx在未來將具備一定的互換性，因為它們均依賴于共診斷的準(zhǔn)確性[87]。然而，由于其技術(shù)上的極端異質(zhì)性，這些診斷技術(shù)與功能性檢測技術(shù)進(jìn)行系統(tǒng)矯正和互換的可能性較低。對于特定的病理類型，功能性檢測仍然需要找到其適配的瘤種和藥品類型。

4 結(jié)語與展望

目前，IVD已廣泛應(yīng)用于醫(yī)療、藥物研發(fā)、疾病診斷和監(jiān)測等領(lǐng)域，其主要優(yōu)勢在于可以快速、準(zhǔn)確地檢測生物標(biāo)志物并提供個體化信息。隨著分子診斷技術(shù)、納米技術(shù)、生物信息學(xué)、人工智能等領(lǐng)域的不斷發(fā)展，IVD技術(shù)也在不斷創(chuàng)新。腫瘤的功能性檢測是通過體外模型或體內(nèi)模型進(jìn)行的，用于評估腫瘤對特定治療方案的響應(yīng)情況。將腫瘤的功能性檢測轉(zhuǎn)化為IVD需要大量的實驗和臨床驗證，并且需要遵循一系列監(jiān)管要求和標(biāo)準(zhǔn)。用于腫瘤研究和抗癌藥物研發(fā)的模型有多種，這些模型的實驗方法和研究機制大同小異。根據(jù)不同的研究需求選擇最佳模型對研究的開展至關(guān)重要。體外模型（例如類器官）速度快、費用低，適用于高通量篩選，但這類模型缺少治療相關(guān)給藥劑量和PK/PD相關(guān)性，只適用于評估部分藥物。另一些體內(nèi)模型如同源腫瘤異體移植小鼠模型和GEMM則適用于腫瘤免疫相關(guān)研究，但人、鼠生理特征之間的較大差異限制了其應(yīng)用。CDX模型來源于患者腫瘤細(xì)胞系，由于傳統(tǒng)細(xì)胞系類型有限，這類模型缺乏異質(zhì)性。PDX模型則具有較高的準(zhǔn)確性，連續(xù)傳代后仍具有高度異質(zhì)性，但是PDX建模周期長，更適合用于藥效研發(fā)而非精準(zhǔn)治療。目前，基于MiniPDX的臨床應(yīng)用正在持續(xù)增多，MiniPDX相關(guān)的回顧性分析也證明了其用于藥物方案篩選的潛力。MiniPDX獨特的優(yōu)勢包括檢測快、費用低、成功率高、樣本來源廣、臨床一致性高，其不僅能夠?qū)δ[瘤藥物研究起到重要作用，更是推動精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)進(jìn)一步在臨床上造?；颊叩挠行Чぞ?。就目前政策來看，以MiniPDX技術(shù)為代表的功能性檢測申報IVD還有待更多、更有說服力的循證醫(yī)學(xué)證據(jù)的支持，同時也需要進(jìn)一步明確申報門檻和路徑，以實現(xiàn)在臨床上得到更多應(yīng)用，推動腫瘤精準(zhǔn)治療的進(jìn)一步發(fā)展和提高。