彭帆，王思源，劉洋，邢金良

（空軍軍醫(yī)大學基礎(chǔ)醫(yī)學院生理與病理生理學教研室，陜西 西安 710032）

癌癥是全球主要的死亡原因之一，2020年全球新發(fā)癌癥病例1 929萬例，全球癌癥死亡病例996萬例，其中中國新發(fā)癌癥457萬例、癌癥死亡300萬例，分別占全球新發(fā)與死亡病例的23.7%、30.1%[1]?，F(xiàn)階段，用于癌癥診療手段十分有限，傳統(tǒng)檢測方法主要是基于影像學、病理學以及血清學，金標準仍然是組織病理學檢測，但其屬于侵入性檢查，傷害大，且在腫瘤早期無法定位獲取組織，無法捕捉到腫瘤原發(fā)灶內(nèi)部以及原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶之間的遺傳異質(zhì)性，影響了檢測的準確性。近年來，液體活檢技術(shù)逐漸進入人們視野。液體活檢主要通過檢測腫瘤原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶釋放到外周血或其他體液中的循環(huán)腫瘤細胞（circulating tumor cells，CTC）、循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）或外泌體，從而達到診斷或監(jiān)測腫瘤的目的。液體活檢技術(shù)解決了傳統(tǒng)的組織活檢技術(shù)的主要缺點，并以無創(chuàng)重復(fù)取樣、可實現(xiàn)早期診斷、實時動態(tài)監(jiān)測和克服腫瘤異質(zhì)性等諸多優(yōu)勢而備受青睞[2]，正在成為精準腫瘤學中傳統(tǒng)組織活檢的有利替代[3]。游離DNA（cell free DNA，cfDNA）是目前的熱點研究方向。然而，現(xiàn)有的基于游離核DNA（cell free nDNA，cf-nDNA）的檢測技術(shù)面臨檢測周期長、成本高、檢測特異性和敏感性不足、技術(shù)復(fù)雜、重復(fù)性不佳等問題[4]。循環(huán)游離線粒體DNA（cell free mitochondrial DNA，cf-mtDNA）的存在已在多種癌癥的多項研究中得到證實[5-8]，并表現(xiàn)出良好的性能。同時，mtDNA的獨特特征使循環(huán)cfmtDNA更容易在患者外周血或其他體液中進行定性及定量檢測。最近開展的大規(guī)模測序工作強調(diào)了cfmtDNA在包括癌癥在內(nèi)的各種臨床疾病中的重要作用[9]。同時，基于cf-mtDNA各項特征的精準檢測技術(shù)層出不窮，使得其特征挖掘更加全面、具體。因此，作為一種具有獨特優(yōu)勢的新型腫瘤生物標志物，cf-mtDNA在精準腫瘤學方面具有很大的應(yīng)用前景。然而，目前對血漿cf-mtDNA的生物學特性和臨床應(yīng)用的了解還很少。綜述將對cf-mtDNA分析指標和檢測技術(shù)進行系統(tǒng)介紹。

1 cf-mtDNA拷貝數(shù)

與nDNA的雙拷貝不同，每個線粒體里通常含有數(shù)百至數(shù)千個DNA拷貝[10]。研究表明，mtDNA拷貝數(shù)與線粒體能量代謝異常、細胞內(nèi)環(huán)境的紊亂、細胞生長的異常密切相關(guān)[11]。目前，針對線粒體基因組的拷貝數(shù)的檢測開發(fā)了很多技術(shù)方法。實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）是最常用于mtDNA拷貝數(shù)檢測的方法[12]。通過設(shè)計用于擴增mtDNA中ND1基因的引物與用于擴增nDNA中HGB-1基因的引物實現(xiàn)mtDNA拷貝數(shù)的相對定量[13]。Jiang等[14]基于qPCR計算ND4、ND1的含量，并用二者的比值反映血漿cf-mtDNA的完整性。然而由于血漿cf-mtDNA的片段化，上下游引物覆蓋區(qū)域有限，導(dǎo)致檢測結(jié)果不準確。隨著測序技術(shù)的發(fā)展，全基因組測序（whole genome sequencing，WGS）也被廣泛應(yīng)用于mtDNA拷貝數(shù)的檢測，并且適用于任何類型的樣本。cf-mtDNA的含量最早被發(fā)現(xiàn)可作為癌癥檢測的生物學指標，Jiang等[9]利用WGS發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，肝細胞癌患者的cf-mtDNA含量升高，且血漿中的cf-mtDNA比cf-nDNA片段更短。多項研究相繼證實，cf-mtDNA含量在肺癌[12]、子宮內(nèi)膜癌[15]、結(jié)直腸癌[16]、乳腺癌[17]中顯著升高，提示cf-mtDNA含量具有一定的腫瘤診斷價值。然而，Perdas等[18]首次發(fā)現(xiàn)與健康對照相比，甲狀腺乳頭狀癌患者血漿cf-mtDNA含量顯著降低，且具有較高特異性，對于后續(xù)治療方案制定起到助力作用。Kalavska等[19]通過對接受化療的晚期卵巢癌患者血漿cf-mtDNA含量進行縱向檢測，發(fā)現(xiàn)化療后血漿cf-mtDNA含量顯著降低，且與預(yù)后相關(guān)。Jiang等[14]基于含量計算的cf-mtDNA完整性在腫瘤診斷中也具有一定的意義，因為血漿中檢測到的完整mtDNA的釋放增加是一種腫瘤特異性過程，據(jù)此可區(qū)分正常患者與甲狀腺癌患者。此外，Bulgakova等[20]通過比較肺癌患者、慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease，COPD）患者及健康對照發(fā)現(xiàn)，cf-mtDNA拷貝數(shù)的增加與COPD和非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）的發(fā)展顯著相關(guān)并引起較差預(yù)后，提示cf-mtDNA是NSCLC的診斷和預(yù)后的生物標志物。此外，Li等[8]通過提取肝癌患者、肝炎患者及正常對照共計15例臨床血漿樣本的cfDNA和外泌體DNA，利用WGS和mtDNA靶向捕獲測序技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，與血漿cf-mtDNA相比，外泌體中mtDNA拷貝數(shù)高于血漿中mtDNA拷貝數(shù)，且外泌體中mtDNA拷貝數(shù)在肝炎患者、肝癌患者與正常對照間存在差異性。

2 cf-mtDNA突變

近年來cf-mtDNA突變相關(guān)研究陸續(xù)被報道。多項研究證實，mtDNA體細胞突變的積累可導(dǎo)致線粒體功能紊亂，促進腫瘤惡性發(fā)展。mtDNA突變是腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中最常見的遺傳學事件之一，通過影響在氧化呼吸鏈中發(fā)揮重要作用的基因，進一步影響線粒體代謝穩(wěn)態(tài)。最早Polyak研究團隊針對腸癌細胞系、原位腸癌腫瘤組織及正常結(jié)腸組織進行測序時發(fā)現(xiàn)，腸癌細胞系中存在mtDNA體細胞突變[21]。此后，大量研究開展對mtDNA突變的研究，證實超過50%的腫瘤存在mtDNA體細胞突變，比nDNA突變高約10 ~ 17倍[22-23]。與ctDNA突變檢測技術(shù)方法類似，cf-mtDNA突變檢測方法主要分為2類：基于PCR的數(shù)字PCR（digital PCR，dPCR）、BEAMing（bead，emulsion，amplification and magnetic）、突變擴增系統(tǒng)（amplification refractory mutation system，ARMS）等技術(shù)以及基于第二代測序（next-generation sequencing，NGS）的靶向富集技術(shù)。dPCR是一種新型核酸檢測方法，能夠?qū)怂犷惸[瘤標志物進行高靈敏性和高精確度的絕對定量，可以從DNA分子層面鑒定基因突變，突變檢出限可達0.01%。市面上常見的dPCR儀主要分為微滴式和芯片式2種。目前已有包括國外的RainDance公司和Bio-Rad公司以及國內(nèi)的泛生子和科維思等幾家公司相繼推出了基于dPCR檢測的產(chǎn)品，并已廣泛地應(yīng)用于稀有突變檢測、拷貝數(shù)變異分析和復(fù)雜樣本基因表達檢測等方面。BEAMing技術(shù)結(jié)合了dPCR與流式檢測技術(shù)，用于檢測罕見突變。ARMS是Newton等[24]針對已知突變建立的基于PCR的檢測方法。上述基于PCR的3種技術(shù)方法操作簡單，靈敏性較高、穩(wěn)定性和準確率良好，但通量較低，只能檢測已知突變，未來發(fā)展能力有限。NGS作為檢測未知突變的主要方法，具有其他技術(shù)難以比擬的優(yōu)勢?；贜GS的靶向富集技術(shù)主要包含2類：靶向擴增[25]與靶向雜交捕獲[26]。靶向擴增是通過設(shè)計mtDNA特異性擴增引物實現(xiàn)目標區(qū)域的富集。Liu等[27]發(fā)現(xiàn)，PCR擴增子內(nèi)高度可變的測序深度嚴重降低了突變識別的覆蓋均勻性和準確性。因此，研究人員優(yōu)化了基于靶向擴增的mtDNA測序策略，通過調(diào)整引物設(shè)計方法，包括引物對數(shù)量、擴增子重疊長度和引物修飾對，實現(xiàn)了線粒體基因組的均勻覆蓋，為mtDNA突變檢測奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。同時發(fā)現(xiàn)DNA質(zhì)量對于PCR擴增效率的影響較大，靶向擴增方法對于DNA質(zhì)量較差的血漿、福爾馬林固定石蠟包埋（formalin fixation and paraffin embedding，F(xiàn)FPE）組織、古生物等樣本的富集效率較低?？傮w來講，靶向擴增方法的特異性較強，但引物設(shè)計復(fù)雜、PCR過程易產(chǎn)生假陽性且無法檢測cf-mtDNA片段組學信息。靶向雜交捕獲技術(shù)通過制備與mtDNA互補配對的生物素標記探針實現(xiàn)目標區(qū)域的富集。與基于PCR的靶向擴增方法不同，探針靶向雜交捕獲可使整個基因組被重疊探針所覆蓋，這些探針用于雜交反應(yīng)以捕獲與其互補DNA序列，能夠靶向更多的區(qū)域，并且更全面地分析所有變異類型。Liu等[28]前期建立了一種基于靶向雜交捕獲的cf-mtDNA突變檢測技術(shù)，利用單鏈建庫技術(shù)與分子標簽相結(jié)合，通過靶向雜交捕獲富集mtDNA文庫，克服了游離cf-mtDNA片段化程度高的問題，能夠富集更多的cf-mtDNA，并且分子標簽克服了PCR擴增和測序錯誤導(dǎo)致的假陽性問題，顯著提高了游離mtDNA低頻突變檢測的準確性。此外，研究人員通過系統(tǒng)地比較不同的探針濃度、探針長度、雜交溫度以及PCR擴增次數(shù)等因素對檢測mtDNA突變及含量的準確性及性價比的影響，最終確定最優(yōu)化的NGS檢測新方案，該方法可高效地檢測cf-mtDNA突變。

Weerts等[29]使用單分子實時（single molecule real time，SMRT）測序技術(shù)檢測了8名癌癥患者（5名乳腺癌、3名結(jié)腸癌）的19個組織樣本和9個血漿樣本的mtDNA突變，結(jié)果發(fā)現(xiàn)使用現(xiàn)有方法追蹤血漿中腫瘤特異性cf-mtDNA變異的價值有限。出現(xiàn)上述結(jié)果的可能原因是SMRT檢測突變的靈敏度較低，更適合結(jié)構(gòu)變異的檢測。然而腫瘤組織存在瘤內(nèi)異質(zhì)性，所以單一或少量的腫瘤組織不能反映完整的腫瘤信息。Vikramdeo等[30]首次證實mtDNA突變可以在血漿外泌體中檢測到，并有可能作為一種可靠的胰腺導(dǎo)管腺癌的診斷工具。Riehl等[31]在神經(jīng)母細胞瘤進展前和進展期間的血漿樣本中檢測到腫瘤相關(guān)的mtDNA體細胞變異。Mair等[32]通過對膠質(zhì)母細胞瘤患者來源的原位移植異種移植模型中的循環(huán)核酸進行微滴式數(shù)字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）檢測和靶向捕獲測序發(fā)現(xiàn)，與腫瘤來源的cf-nDNA相比，腫瘤來源的cf-mtDNA的血漿檢測率更高，并且允許在腦脊液和尿液中檢測，表明與cf-nDNA相比，cf-mtDNA可更敏感地檢測和監(jiān)測患者來源的膠質(zhì)母細胞瘤原位異種移植瘤的腫瘤負荷。Campo等[33]通過超深度測序檢測個體cf-mtDNA突變的核苷酸位置的遺傳異質(zhì)性，而不檢測特定的突變，并利用機器學習算法建立模型，能夠有效區(qū)分肝癌患者與健康對照，準確率高達99.78%。Guo等[34]針對cf-mtDNA展開深入研究，開發(fā)了一系列cf-mtDNA精準分析流程，包括評估血漿樣品cf-mtDNA突變檢測中剪切、定位和過濾等關(guān)鍵分析程序，建立了一種創(chuàng)新的數(shù)據(jù)分析平臺；同時也開發(fā)了一種基于隨機森林機器算法的模型，用于準確識別樣本交叉污染，評估污染水平并檢測污染來源的變異位點，可有效提高突變檢測的準確性和靈敏度[35]。此外，Guo等[36]基于隨機森林算法還開發(fā)了一種無對照情景下識別mtDNA突變來源的工具 （mitoSomatic），用于準確區(qū)分腫瘤組織、癌旁非腫瘤組織中mtDNA體細胞突變和遺傳變異。綜上所述，cf-mtDNA突變與腫瘤之間存在密切的關(guān)系，因此cf-mtDNA突變可能成為腫瘤的分子標記，通過對cf-mtDNA突變進行檢測識別，有望在早期腫瘤診斷、治療反應(yīng)性的預(yù)測及腫瘤治療方案的制定上提供有力的支持和指導(dǎo)。

3 cf-mtDNA片段組學

液體活檢不僅限于檢測cf-mtDNA的遺傳學和表觀遺傳學的改變，cf-mtDNA的片段信息同樣具有重要作用，主要包括片段大小、片段末端堿基基序、片段斷點堿基基序等特征，這一研究領(lǐng)域被稱為cfmtDNA片段組學，其所涵蓋的生物學信息在腫瘤診斷、組織溯源等方面具有潛在的應(yīng)用價值。近年來，研究人員越來越多地關(guān)注cf-mtDNA片段組學特征與腫瘤之間的關(guān)系。2019年，劍橋大學的Richard研究團隊通過膠質(zhì)母細胞瘤患者來源的原位移植瘤小鼠模型檢測到血漿中腫瘤來源的DNA主要集中在145 bp，比正常cfDNA片段偏短，研究還發(fā)現(xiàn)檢測血漿中腫瘤mtDNA比ctDNA在膠質(zhì)母細胞瘤早期檢測中更靈敏[32]。除了片段大小，Jiang等[37]研究發(fā)現(xiàn)肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）患者血漿DNA的CCCA末端堿基基序的豐度遠低于非HCC患者。該現(xiàn)象可能與脫氧核糖核酸酶1、脫氧核糖核酸酶1L3、DNA片段化因子亞基β切割cfDNA有關(guān)[38]。提示，cf-mtDNA片段特征和拷貝數(shù)的差異可用于區(qū)分癌癥患者和非癌癥人群。同時，Li等[8]發(fā)現(xiàn)，與血漿cf-mtDNA相比，外泌體中mtDNA具有更大的片段分布，與HCC患者和健康對照相比，肝炎患者外泌體中mtDNA具有更長的片段分布。上述研究表明，通過對cf-mtDNA片段組學特征的檢測和分析，獲得一些腫瘤特定的片段特征，為腫瘤的病理分子機制和治療靶點的探索提供思路和方向。此外，包括末端堿基序列、斷點堿基序列在內(nèi)的cf-mtDNA片段組學其他特征在腫瘤診斷中的價值有待進一步挖掘，腫瘤患者cf-mtDNA片段化機制有待深入研究。

4 cf-mtDNA多組學聯(lián)合

隨著液體活檢相關(guān)研究的不斷深入，cf-mtDNA檢測技術(shù)不斷發(fā)展，多組學聯(lián)合分析成為一種新的趨勢。Zhou等[39]基于長片段PCR擴增（long range PCR，LR-PCR） 與3對mtDNA特異性擴增引物聯(lián)合6對nDNA特異性擴增引物建立了mtDNA與內(nèi)參nDNA同時雜交捕獲探針的制備方法?；诖?，建立了mtDNA拷貝數(shù)、突變、片段組學同時檢測方法。利用該方法，Zhou等[39]發(fā)現(xiàn)HCC患者血漿cfmtDNA拷貝數(shù)顯著低于組織中mtDNA拷貝數(shù)，而cf-mtDNA片段短于cf-nDNA片段；成功檢測到血漿cf-mtDNA中腫瘤特異性mtDNA突變的一部分，特別是來自HCC患者的血漿cf-mtDNA，同時證明血漿樣本中存在大量潛在的癌癥特異性mtDNA突變。此外，另一項研究發(fā)現(xiàn)，與血漿相比，尿液cf-mtDNA拷貝數(shù)更高、片段更長。與健康對照、良性疾病患者相比，腫瘤患者尿液cf-mtDNA中短片段（＜150 bp）的占比顯著升高。尿液cf-mtDNA短片段的富集分析能夠顯著增強mtDNA體細胞突變檢測。尿液和血漿cf-mtDNA之間片段末端的堿基占比不同且與片段大小有關(guān)。通過整合尿液cf-mtDNA的片段組學和突變特征，可以構(gòu)建出有效區(qū)分健康對照與腫瘤患者的診斷模型[40]。目前仍需更多研究證明cf-mtDNA含量、片段組學和突變特征在腫瘤診斷中的臨床實用性。

5 血漿環(huán)狀cf-mtDNA

近幾年，關(guān)于血漿中環(huán)狀mtDNA的報道也日益增多。Newell等[41]使用mtDNA重疊片段的特異性PCR引物擴增血漿游離DNA，證實了血漿中完整mtDNA的存在。隨后，Ma等[6]使用限制性內(nèi)切酶BfaI切割mtDNA以區(qū)分線性和環(huán)狀mtDNA，兩端攜帶BfaI切割特征的mtDNA片段被定義為環(huán)狀mtDNA，而沒有切割特征或具有1個切割特征的mtDNA片段被定義為線性mtDNA；研究還發(fā)現(xiàn)血漿中同時存在線性mtDNA與環(huán)狀mtDNA。有關(guān)環(huán)狀cf-mtDNA是否與線性cf-mtDNA有不同的產(chǎn)生機制尚未見報道。環(huán)狀cf-mtDNA的來源是否具有腫瘤特異性，特征是否能夠發(fā)揮腫瘤診斷價值有待進一步探索和挖掘，成熟穩(wěn)定的環(huán)狀及線性cfmtDNA同時檢測技術(shù)有待進一步建立。

6 結(jié)語與展望

目前，越來越多研究結(jié)果表明，cf-mtDNA作為新型生物標志物在癌癥檢測方面發(fā)揮重要作用，對于延長患者生存期十分關(guān)鍵。盡管液體活檢技術(shù)在癌癥管理方面擁有較好的前景，但只有少數(shù)相關(guān)技術(shù)已被批準用于臨床，究其原因可能是：1）總體上對cf-mtDNA的生物學特性及釋放機制的理解存在不足；2）腫瘤來源的cf-mtDNA濃度較低，易被來自其他細胞的非信息性cf-mtDNA所掩蓋；3）目前提出的液體活檢技術(shù)存在檢測成本高、操作難度大、檢測周期長的局限性，可行性不高[42]。cfmtDNA作為新型生物標志物能夠提供的腫瘤信息在腫瘤早期診斷、治療監(jiān)測、耐藥性評估、預(yù)后預(yù)測方面極具應(yīng)用潛力。隨著精準檢測技術(shù)的不斷發(fā)展和臨床研究的逐漸深入，如單細胞測序技術(shù)、轉(zhuǎn)錄組分析以及長讀長測序的技術(shù)發(fā)展，能夠更精準、更全面、更成本合理地檢測分析cf-mtDNA特征，促進基于cf-mtDNA的多組學特征檢測的腫瘤診斷作為常規(guī)檢查在腫瘤管理中的應(yīng)用。同時，多組學聯(lián)合檢測的運用使得更多特征整合分析，有助于更全面地獲得相關(guān)腫瘤信息，具有提高癌癥檢測的靈敏度和臨床應(yīng)用的潛力[43]。機器學習的發(fā)展為基于cf-mtDNA檢測技術(shù)的精準診療帶來巨大機遇。機器學習通過選取合適的算法，從數(shù)據(jù)中自動歸納邏輯或規(guī)則，并根據(jù)歸納結(jié)果構(gòu)建預(yù)測模型[44]。近年來，機器學習算法被廣泛應(yīng)用于腫瘤來源特征識別[45]，極大地提高了檢測技術(shù)的靈敏性和特異性，助力腫瘤的精準診療。此外，需進一步聚焦于臨床研究，以證明cf-mtDNA在腫瘤管理中的實際應(yīng)用價值，并為未來的個性化醫(yī)療開辟新的途徑。