白躍宗

（上海思路迪生物醫(yī)學科技有限公司，上海 200120）

作為一種關鍵的細胞間通信工具，外泌體因其富含的生物信息分子而受到廣泛關注和研究。尤其在腫瘤液體活檢領域，外泌體展現(xiàn)出巨大的發(fā)展?jié)摿蛻脙r值[1]。目前，關于外泌體在腫瘤診斷領域的研究成果較多，為腫瘤的早期診斷和全程管理提供了新的視角和策略。然而，外泌體研究領域仍有一些爭議和待解決的問題，如最佳的外泌體提取方法、精確定量以及外泌體在不同類型腫瘤中的作用機制等[2]。本文深入探討外泌體在肺癌、腸癌、卵巢癌（ovarian cancer，OC）、胃癌（gastric cancer，GC）、胰腺癌、膀胱癌（bladder cancer，BC）以及骨與軟組織肉瘤（bone and soft tissue sarcomas，BSTS）等多種腫瘤診斷中的價值和臨床批準的相關情況，發(fā)現(xiàn)外泌體在腫瘤早期診斷、疾病監(jiān)測和治療反應評估等方面的潛在價值，并為外泌體在腫瘤液體活檢領域的進一步發(fā)展提供參考。

1 外泌體的定義和功能

外泌體是一類直徑30 ~ 150 nm的囊泡，通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體等細胞器形成內(nèi)質(zhì)膜囊泡，并融合至細胞膜釋放到細胞外。外泌體可以依據(jù)其來源細胞、生物生成途徑和功能特性等因素進行分類，其中功能特性分類方式較為常見，可進一步細分為外泌小體、微泡等[3]。外泌體生理功能涉及細胞間通訊、物質(zhì)轉(zhuǎn)運和細胞功能調(diào)節(jié)等過程，內(nèi)含蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸[如信使核糖核酸（messenger ribonucleic acid，mRNA）、微小核糖核酸（micrornA，miRNA）、長鏈非編碼核糖核酸（long non-coding RNA，lncRNA）]等多種生物活性物質(zhì)，其成分特性可反映來源細胞生理及病理狀態(tài)。外泌體表面表達的特異性標志物主要有CD9、CD63和CD81等[4]。

外泌體在多種疾病的發(fā)生、發(fā)展中具有重要意義，其具有以下主要生物學功能：外泌體可攜帶病原性物質(zhì)如蛋白質(zhì)、核酸片段等，參與腫瘤細胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和耐藥性等病理過程；外泌體可作為細胞間信號傳遞載體，影響免疫調(diào)節(jié)、炎癥反應和纖溶過程等，進一步影響疾病進程；外泌體中某些特定癌癥相關的突變基因、mRNA、非編碼RNA等特異性生物標志物可作為疾病診斷的潛在靶點，有助于實現(xiàn)早期、高靈敏度和高特異性的疾病診斷[5]。

2 外泌體在體外診斷中的優(yōu)勢

體外診斷（in vitrodiagnostics，IVD）是在人體外進行的醫(yī)學檢測，主要通過分析來自人體的生物樣本（如血液、尿液、唾液或組織樣本）以識別或評估特定的健康狀況或疾病。在腫瘤診斷領域，體外診斷是一種有效的工具，可以通過檢測和分析特定的生物標志物來發(fā)現(xiàn)、監(jiān)測和評估癌癥。

國家藥品監(jiān)督管理局（National Medical Products Administration，NMPA）定義體外診斷試劑為“直接或間接用于人體樣本（如血液、體液、組織等）的檢測、測定的醫(yī)療器械”，這主要包括用于人體疾病診斷或身體狀況檢測的試劑、試劑盒、校準品及質(zhì)控品。美國食品和藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）將體外診斷產(chǎn)品定義為“在人體外使用的器械，其目的是用于在樣本中尋找來自人體的微量物質(zhì)或微生物”。這些產(chǎn)品可用于診斷疾病，也可用于預防、監(jiān)控、篩查或預測疾病的進程或治療。因此，無論在國內(nèi)還是國際上，IVD均被認為是一種重要的醫(yī)療檢測手段，對于腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)和管理起關鍵作用。

外泌體作為一種創(chuàng)新的液體活檢技術，在IVD中具有獨特的優(yōu)勢。

首先，外泌體的小尺寸和多樣性表面蛋白質(zhì)使其能夠在體內(nèi)循環(huán)，并在遠離來源細胞的位置釋放其包含的生物分子（如核酸、蛋白質(zhì)等）。這些分子能夠反映其母細胞的生理和病理狀態(tài)，例如腫瘤細胞釋放的外泌體中含有特定的腫瘤標志物。因此，外泌體作為一種無創(chuàng)檢測方法，避免了傳統(tǒng)組織活檢等侵入性操作所帶來的風險，例如采集尿液可分析泌尿系統(tǒng)疾病，采集腦脊液可分析中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病等[6]。

其次，外泌體中裝載的生物分子具有一定的穩(wěn)定性，能夠在體液中存活較長時間。外泌體有雙層脂質(zhì)膜，可以保護內(nèi)部的生物分子不受外部環(huán)境的影響，同時也可以防止這些分子在血液循環(huán)中被降解或排泄。此外，有研究表明外泌體中的RNA和蛋白質(zhì)等生物分子可能與外泌體膜上的一些蛋白質(zhì)、糖基等形成穩(wěn)定的復合物，也有助于保持這些分子的穩(wěn)定性[7]。

此外，外泌體在多種疾病中均具有顯著的生物學作用，在相關疾病的早期診斷和預后評估方面具有較大應用潛力。例如，外泌體能夠在細胞間傳遞信號分子、轉(zhuǎn)移RNA和蛋白質(zhì)等生物分子，從而影響受體細胞的生物學行為。在某些疾病中，外泌體可以通過這種方式傳遞異常的信號分子和突變的RNA和DNA等生物分子，從而導致疾病的發(fā)生和發(fā)展。此外，外泌體也參與多種疾病的炎癥反應、免疫調(diào)節(jié)和血管生成等生物學過程[8]。

3 外泌體檢測方法

外泌體的分離方法較多，各具優(yōu)缺點，其選擇可基于不同方法的分離效率、靈敏度、特異性、操作復雜度、花費時間、經(jīng)濟成本以及適用性等多方面進行綜合評估。

超速離心被廣泛認為是外泌體分離的“金標準”[9]。該方法依賴于外泌體與其他組分之間的大小和密度差異進行分離。然而，超速離心分離的外泌體的產(chǎn)量和純度受到轉(zhuǎn)子類型、離心時間和樣品黏度等多種因素的影響[10]。此外，重復的超速離心可能會降低外泌體的產(chǎn)量并對其質(zhì)量產(chǎn)生負面影響。

基于尺寸的技術，如超濾和順序過濾也被廣泛應用于外泌體的分離。超濾通常作為初始步驟，用于將大量原始材料中的外泌體濃縮為小體積樣本，并用于后續(xù)的純化過程[11]。順序過濾通常包括3個步驟：過濾細胞和細胞殘骸、去除游離蛋白并濃縮樣本、使用具有特定孔徑的濾膜對外泌體進行分選[12]。

捕獲技術與免疫親和力密切相關，常用于生產(chǎn)高純度的外泌體。磁珠是一種可經(jīng)過修飾以結合膜表面目標蛋白質(zhì)的材料，在捕獲技術中起核心作用。外泌體表面含有多種膜蛋白，如CD9、CD63、ALG-2交互蛋白X（ALG-2-interacting protein X，ALIX）和上皮細胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecule，Ep-CAM），可以利用抗體包被的磁珠進行富集。然而，基于磁珠的分離策略不適用于大規(guī)模的外泌體分離，高昂的成本和低產(chǎn)量限制了其進一步開發(fā)和應用[13]。

沉淀技術主要依賴于使用聚合物來沉淀胞外囊泡，然后再進一步純化處理。聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）是用于胞外囊泡分離最常用的聚合物，可有效提高外泌體富集度并增加其產(chǎn)量[14]。然而有報道稱這些方法會導致樣品中各種污染物，例如非胞外囊泡蛋白的共沉淀[15]。

微流控系統(tǒng)是分離外泌體與其他納米級顆粒的理想工具，可實現(xiàn)高速和精確的分離過程。此外，微流控技術還是唯一一種可以連續(xù)分離的技術。目前廣泛使用的微流控分離外泌體的設備基本都集成了上述多種技術，包括基于外泌體尺寸分離的技術、基于免疫親和力分離的技術和微流控本身連續(xù)動態(tài)分離的技術[16]。

理想的外泌體分離方法應該相對簡單、快速、高效、廉價且可擴展，不應該損壞外泌體本身，也不需要太復雜的設備。事實上，不同的方法在效率、重復性和對功能結果的影響方面均有各自的優(yōu)勢和劣勢。通過進一步優(yōu)化分離方案和使用組合的分離技術，可能有助于克服這些劣勢，并加速外泌體研究在基礎和臨床應用中的推進。

4 外泌體在腫瘤體外診斷中的研究進展

4.1 肺癌

肺癌是精準診斷和液體活檢的研究熱點，特別是如何通過外泌體這一無創(chuàng)檢測來實現(xiàn)酪氨酸激酶抑制劑（TKI）治療肺癌的療效預測和耐藥監(jiān)測。有研究納入了52例肺腺癌患者的樣本，對腫瘤組織和惡性胸腔積液（malignant pleural effusions，MPEs）中的外泌體進行了突變狀態(tài)的檢測，結果顯示利用外泌體進行基因檢測的靈敏度為100%，特異性為96.55%，一致性為98.08%；在接受表皮生長因子受體-酪氨酸激酶抑制劑（EGFR-TKI）治療的患者中，通過外泌體檢測到EGFR突變的患者顯示出83%的有效率和100%的疾病控制率，表明MPEs中的外泌體DNA可作為肺腺癌中EGFR檢測的有效樣本類型[17]。

由于外泌體脂質(zhì)雙層的性質(zhì)可以保護miRNA免受體液中RNA酶的降解，因此外泌體miRNA已成為早期診斷和預后判斷的無創(chuàng)生物標志物的理想來源。有研究發(fā)現(xiàn)，非小細胞肺癌（NSCLC）患者的外泌體miR-21表達水平較健康者更高，但是單一外泌體miRNA檢測的特異性不佳，高水平的外泌體miR-21也在結直腸癌、乳腺癌和肝癌等其他癌癥中被發(fā)現(xiàn)[18]。因此，檢測多個外泌體來源miRNA可能對NSCLC診斷更有價值。有研究顯示，miR-21、miR-378、miR-139和miR-200在NSCLC患者和健康受試者中表達有差異，這為早期NSCLC的診斷提供了更多可選的生物標志物[19]。

隨著肺癌進入免疫治療時代，已有研究在評估腫瘤源性外泌體中程序性死亡-配體1（programmed death-ligand 1，PD-L1）作為免疫檢查點抑制劑（immune checkpoint inhibitor，ICI）治療生物標志物的潛力。有研究者評估了51例癌癥患者（40例為晚期NSCLC）腫瘤組織PD-L1（tPD-L1）和血液PD-L1（bPD-L1）之間的相關性，其中bPD-L1包括外泌體PD-L1 mRNA、外泌體PD-L1蛋白表達和血漿中的可溶性PD-L1蛋白（sPD-L1）；監(jiān)測了這些標志物在ICI治療過程中的變化，結果發(fā)現(xiàn)，tPD-L1和bPD-L1之間存在正相關，PD-L1 mRNA的倍數(shù)變化為2.04及以上和外泌體PD-L1蛋白表達的倍數(shù)變化為1.86及以上的患者有最佳的客觀響應率（ORR）和總生存率（OS）[20]。另一項由85例NSCLC患者參與的研究發(fā)現(xiàn)，與sPD-L1不同，外泌體PD-L1與NSCLC的疾病進展、淋巴結狀態(tài)、腫瘤大小、轉(zhuǎn)移和分期有關，但外泌體PD-L1與腫瘤組織PD-L1的免疫組織化學（IHC）狀態(tài)無關[21]。Okuma等[22]使用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）對39例NSCLC患者的研究發(fā)現(xiàn)，血漿sPD-L1水平低的患者中，59%在免疫治療后達到了部分或完全響應，而血漿sPD-L1水平高的患者中只有25%有響應；此外，基線血漿sPD-L1水平高的患者中有75%快速進展，而基線血漿sPD-L1水平低的患者中進展的只占22%，提示血漿sPD-L1可能作為肺癌免疫治療的新生物標志物。

4.2 卵巢癌

OC、宮頸癌（CC）和子宮內(nèi)膜癌（EC）是3種最常見的婦科惡性腫瘤，其中OC的致死率最高。由于缺乏早期診斷工具，超過70%的OC患者初診即晚期，5年生存率約為47%[23]。一項有關168例Ⅲ~Ⅳ期高級別漿液性卵巢癌（HGSOC）患者和65名健康受試者對照組的研究顯示，在HGSOC患者中miR-1246、miR-595和miR-2278的表達顯著增加，其中miR-1246具有最高的檢測性能，其診斷靈敏度為87%，特異性為77%，準確度為84%，ROC曲線下面積（AUC）為0.89[24]。

外泌體蛋白在OC中的臨床診斷潛力也有相關研究。一項研究分析了40例Ⅲ期或Ⅳ期OC患者的血漿樣本和40例健康受試者對照組的血漿樣本中脂多糖結合蛋白（LPB）、纖維蛋白原γ鏈（FGG）、纖維蛋白原α鏈（FGA）和凝膠剪切蛋白（GSN）在診斷方面的作用，結果顯示：在OC組中FGA和GSN水平顯著升高，診斷OC的AUC分別為0.845 9（0.760 2 ~ 0.931 7，P＜0.000 1）和0.830 9（0.734 3 ~0.927 4，P＜0.000 1），而FGG和LBP水平顯著下調(diào)，診斷OC的靈敏度為0.744 7（0.632 3 ~ 0.8571，P＜0.0001）和0.658 8（0.538 1 ~ 0.779 4，P＜0.001），提示FGA在4種候選蛋白中具有最高的診斷靈敏度[25]。一項有關70例OC患者（63例Ⅲ~Ⅳ期和7例Ⅰ~Ⅱ期）和30例健康受試者對照組的研究顯示，OC患者的血漿樣本外泌體中人類白細胞抗原G（HLA-G）水平增加了將近7倍（平均為14.3 μg · L-1），而健康對照組為1.9 μg · L-1[26]。

4.3 結直腸癌

研究發(fā)現(xiàn)，外泌體具有能夠識別癌癥個體和確定其組織來源的能力。該研究包含497個樣本，其中包括426個人類樣本（腫瘤樣本和正常組織對照樣本分別為275個和152個）和71個小鼠樣本（腫瘤樣本和正常組織對照樣本分別為36個和35個），對所有樣本中分離出的外泌體進行了蛋白質(zhì)組分析，并將其分類為Exo S（50 ~ 70 nm的胞外囊泡）、Exo L（90~ 120 nm的胞外囊泡）和Exo微粒（＜50 nm）3個亞組，結果表明，該研究分析能以100%的靈敏度和92%的特異性區(qū)分癌癥患者和非癌癥患者，并且能夠?qū)⒑谏亓觥⒔Y直腸癌、胰腺癌和肺癌加以區(qū)分[27]。

另外一項包含了健康受試者（13例）、腺瘤患者（25例）和Ⅰ~Ⅳ期的腺癌患者（Ⅰ期16例、Ⅱ期15例、Ⅲ期16例、Ⅳ期15例）的研究通過對血清外泌體進行液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析，鑒定出了谷氨酸-半胱氨酸連接酶調(diào)節(jié)亞單位（GCLM）、凱爾血型糖蛋白（KEL）、載脂蛋白F（APOF）、補體因子B（CFB）、cGMP特異性磷酸二酯酶（cGMP）和雙功能嘌呤生物合成蛋白（ATIC）6種蛋白質(zhì)，在對其聯(lián)合檢測下能夠?qū)⒔】祵φ铡⑾倭龊拖侔┱呦嗷^(qū)分[28]。

分析外泌體中的非編碼RNA為結直腸癌的診斷和隨訪提供了一種簡單的方法，其中包括miRNA和lncRNA（含circRNA）。有研究利用多階段和縱向隊列的血液樣本進行外泌體內(nèi)含物分析，鑒定出EV-miR-320c為轉(zhuǎn)移性結直腸癌的生物標志物[29]。對結直腸癌和對照樣本進行高通量RNA測序分析顯示，結直腸癌組circLPAR1的表達下調(diào)，circLPAR1是從溶血磷脂酸受體1（LPAR1）基因轉(zhuǎn)錄本的外顯子3和4環(huán)化生成的circRNA；結直腸腫瘤患者血漿中外泌體circLPAR1的水平隨著腫瘤分期上升而顯著下降，但在腫瘤切除后又顯著升高；這種circRNA可能構成結直腸癌診斷的特異性生物標志物[30]。

4.4 胃癌

在GC患者血清中，某些外泌體蛋白、miRNA和lncRNA的表達上調(diào)，提示外泌體可能是GC的潛在診斷標志物。一項研究納入了30例受試者，其中包括20例GC患者（Ⅰ期10例，Ⅱ~Ⅳ期10例）和10例健康對照，與健康對照相比，20例GC患者胃液來源的外泌體樣本中BarH-like 2 homeobox蛋白（BARHL2）表現(xiàn)出高度甲基化；BARHL2甲基化區(qū)分GC和非GC樣本的ROC曲線下面積達到0.92，檢測靈敏度為90%，特異性為100%[31]。這些結果表明，使用胃液分泌的外泌體DNA對BARHL2進行甲基化分析可用于臨床GC的早期診斷。

血漿外泌體中的lncRNA LINC00152是GC的潛在生物標志物。研究發(fā)現(xiàn)，血漿和外泌體中LINC00152水平無差異，表明LINC00152可能穩(wěn)定存在于血漿中，其能被成功檢測出來，可能是因為得到了外泌體脂質(zhì)雙分子層的保護[32]。研究顯示，在126例GC患者中的血清外泌體lncRNA HOTTIP顯著高于120名正常對照組，提示HOTTIP是GC的潛在新型診斷和預后生物標志物[33]。

ICI為GC治療帶來新的希望。然而，由于缺乏適當?shù)纳飿酥疚铮珿C免疫療法難以選擇最佳獲益人群，所以整體療效仍然不盡人意。近期的一項研究采集了112例接受ICI相關治療的GC患者的血漿，分為3個隊列，并從42個關鍵候選蛋白中識別出4種血漿外泌體源性蛋白質(zhì)（ARG1、CD3、PD-L1、PD-L2），然后將血漿外泌體源性蛋白質(zhì)構建成一個EV評分指標；結果顯示，該評分在基線時強有力地預測免疫治療結果，并可動態(tài)監(jiān)測疾病進展，EV評分為1及以上的GC從ICI中獲得了更多的治療益處，而EV評分小于1的GC則可能從ICI聯(lián)合人表皮生長因子受體2（HER2）靶向治療中獲得更多益處[34]。

4.5 胰腺癌

研究顯示，與健康者相比，胰腺癌患者glypican-1（GPC1）陽性外泌體的比例顯著增加，早期胰腺癌患者血清中外泌體GPC1水平明顯高于健康者，早期胰腺癌的診斷準確率和靈敏度均為100%[35]。少數(shù)研究則認為GPC1可能不是胰腺導管腺癌（PDAC）的理想診斷標志物。對健康者、慢性胰腺炎和PDAC患者外泌體中GPC1和miRNA的比較分析顯示，外泌體miRNA（miR-10b、miR-30c）的表現(xiàn)優(yōu)于GPC1，能夠更好地區(qū)分健康者、慢性胰腺炎和PDAC患者[36]。另一項研究表明，具有高GPC1表達的PDAC患者存在GPC1富集的循環(huán)外泌體（cirExos）；然而，cirExos中的GPC1水平不能用于區(qū)分PDAC和良性胰腺疾病，GPC1富集的cirExos在PDAC切除手術后下降，高cirExos GPC1水平與腫瘤具有較大相關性，表明GPC1可能與腫瘤負荷有關，可能不是PDAC的生物標志物[37]。盡管如此，更多的研究支持GPC1作為PDAC細胞來源的外泌體特異性標志物，提示GPC1在診斷或預后策略中的實用性值得進一步探討。

4.6 膀胱癌

目前，診斷BC的金標準是膀胱鏡檢查和組織學評估，早期發(fā)現(xiàn)是BC診斷和監(jiān)測的關鍵，因此無創(chuàng)且靈敏度高的生物標志物亟待開發(fā)。一項埃及的研究利用ELISA檢測了70例BC患者（包括T0 ~ T3階段）與12例健康對照者的尿液和血清樣本中腫瘤來源外泌體的水平；結果顯示，與健康受試者相比，BC患者外泌體水平在疾病的不同階段均有所增加，隨著腫瘤浸潤程度增加（T0 ~ T3階段），血清和尿液中腫瘤來源的外泌體水平也逐漸增加；血清樣本外泌體水平檢測相較尿液來源檢測BC的特異性更高（100%vs83.3%），而尿液樣本外泌體水平檢測BC的靈敏度更佳（92.%vs82.4%）[38]。另有研究表明，缺氧BC細胞可分泌豐富的lncRNA UCA1外泌體來重塑腫瘤微環(huán)境，并促進腫瘤的生長和進展，表明血清外泌體lncRNA UCA1可能是BC的潛在診斷生物標志物[39]。

一些研究還探討了外泌體非編碼RNA在BC診斷中的聯(lián)合應用。例如，基于3種血清外泌體lncRNA（PCAT-1、UBC1和SNHG16）組合的診斷模型對于早期BC的判斷具有高準確性，效能優(yōu)于尿液細胞學檢查的結果[40]?；加辛馨徒Y轉(zhuǎn)移的BC患者預后極差。研究顯示，外泌體可作為淋巴系統(tǒng)與BC之間的信息傳遞通道，并通過傳遞表觀遺傳信息和遺傳信息重塑淋巴系統(tǒng)，淋巴結轉(zhuǎn)移相關轉(zhuǎn)錄本2（LNMAT2）的外泌體lncRNA在BC患者血清樣本中顯著升高；此外，與沒有淋巴結轉(zhuǎn)移的BC患者相比，淋巴結轉(zhuǎn)移BC患者的血清外泌體中LNMAT2表達水平更高，且血清外泌體LNMAT2過表達與BC患者短期低生存率相關[41]。

4.7 骨與軟組織肉瘤

間葉組織起源的BSTS是一組異質(zhì)性腫瘤，具有100多種組織學亞型，每種BSTS組織學亞型均具有特定的核酸或蛋白質(zhì)特征，可實現(xiàn)肉瘤的分子診斷。尤文肉瘤（Ewing,s sarcoma，ES）家族腫瘤（Ewing,s sarcoma family of tumors，ESFT）是一組原發(fā)性BSTS，大多數(shù)ESFT患者在確診時已存在微轉(zhuǎn)移病灶。ES的診斷方法依賴于對腫瘤組織的侵入性切除，目前臨床實踐中暫未見液體檢測方法用于診斷ES和評估微小殘留病灶。尤文肉瘤斷點區(qū)域1-友病毒白血病整合1（Ewing,s sarcoma breakpoint region 1-friend leukemia integration 1，EWSR1-FLI1）可在ES細胞中誘導組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶（enhancer of zeste homolog 2，EZH2）的表達，EZH2參與細胞多能性維護和致癌轉(zhuǎn)化，因此其表達可能與ES患者的不良預后相關；在ES患者的血漿外泌體中可檢測到EZH2mRNA表達，而在健康受試者或其他肉瘤患者中未見[42]。因此，檢測外泌體可以幫助診斷ES并在預測治療反應和復發(fā)方面發(fā)揮潛在作用。此外，通過免疫捕獲方法檢測ES患者的外泌體可以顯著提高EWSR1-FLI1融合轉(zhuǎn)錄本的檢測靈敏度，避免患者腫瘤組織DNA測序帶來的斷點誤差[43]。

骨肉瘤（osteosarcoma，OS）是骨骼最常見的原發(fā)性腫瘤。10% ~ 20%的OS患者初診即存在轉(zhuǎn)移，而肺部轉(zhuǎn)移是導致OS患者死亡的主要原因；然而大多數(shù)OS患者確診時已有影像學難以檢測的微轉(zhuǎn)移病灶，致5年生存率不到20%[44]。有研究顯示，70例OS患者外泌體中PD-L1水平較健康對照者（22例）更高，AUC為0.695（95% CI：0.577 ~ 0.814）；此外，肺轉(zhuǎn)移患者外泌體中PD-L1水平比未轉(zhuǎn)移的患者更高，推測PD-L1高表達與患者的不良預后相關，其機制可能與PD-L1介導的免疫抑制有關[45]。

橫紋肌肉瘤（rhabdomyosarcoma，RMS）起源于具有肌源性分化的原始間葉細胞。RMS有2種主要的組織學亞型：肺泡型RMS（alveolar rhabdomyosarcoma，ARMS）和胚胎型RMS（embryonal rhabdomyosarcoma，ERMS），配對框基因-叉頭框蛋白O1（paired box gene-forkhead box protein O1，PAXFOXO1）是RMS的特異性分子標志物。近期的一項研究發(fā)現(xiàn)，62%的轉(zhuǎn)移性RMS患者初診液體活檢顯示PAX-FOXO1基因表達也為陽性；而所有局部進展的ARMS患者初診液體活檢顯示PAXFOXO1基因均為陰性，表明從外泌體RNA中檢測到的PAX-FOXO1基因融合可能是RMS腫瘤特異性生物標志物，可用于區(qū)分RMS是否發(fā)生轉(zhuǎn)移[46]。

5 外泌體相關腫瘤診斷標志物的臨床獲批情況

目前，外泌體在腫瘤診斷的應用仍處于轉(zhuǎn)化醫(yī)學研究階段，獲得監(jiān)管部門批準和商業(yè)應用的產(chǎn)品較少。2016年，Exosome Diagnostics公司推出了全球首個外泌體癌癥診斷產(chǎn)品ExoDx Lung（ALK）。該方法敏感且準確，可以檢測出NSCLC患者中的EML4-ALK突變，達到了88%的靈敏度和100%的特異性，提供了比游離細胞DNA（cell-free DNA，cfDNA）更敏感的基因融合檢測方法[47]。

此外，ExoDx Prostate IntelliScore（EPI）也已通過FDA認證。該方法檢測外泌體中ETS相關基因（ETS-related gene，ERG）、前列腺癌基因3（prostate cancer gene 3，PCA3）和SAM銳角域含有ETS轉(zhuǎn)錄因子（SAM pointed domain containing ETS transcription factor，SPDEF）的RNA，并提供外泌體診斷前列腺智能評分（ExoDx prostate intelliscore，EPI），用來預測前列腺特異抗原（prostate specific antigen，PSA）水平為2 ~ 10 μg · L-1的患者是否有可能發(fā)展為高級別前列腺癌。根據(jù)ExoDx的數(shù)據(jù)顯示，在前瞻性研究中該方法達到了93%的靈敏度，并且當EPI閾值為15.6時可以幫助臨床避免26%不必要的穿刺活檢。有3個獨立的前瞻性和多中心臨床試驗表明，EPI的表現(xiàn)優(yōu)于標準方案，可用于協(xié)助早期診斷前列腺癌并避免不必要的前列腺活檢[48]。

2022年2月，中國NMPA授予了上海思路迪生物醫(yī)學科技有限公司開發(fā)的創(chuàng)新產(chǎn)品外泌體卵巢癌輔助診斷試劑盒（化學發(fā)光法）以優(yōu)先審批，同意理由是該產(chǎn)品屬于“臨床急需，且在我國尚無同品種產(chǎn)品獲準注冊的醫(yī)療器械”[49]。

6 結語與展望

近年來，外泌體技術的研究取得了突破性進展。首先，在外泌體的分離與純化方法上，傳統(tǒng)的超速離心法繁瑣且效率低下，新興的磁性納米顆粒捕獲技術可有效地從生物樣本中捕獲和分離外泌體，大大提高了分離純度和效率。此外，微流控芯片技術也為外泌體的高通量分析提供了有力支持，使得從單個外泌體中獲得的生物信息更加豐富和精確。其次，在外泌體的檢測方法上，科研人員正開展多種新型生物傳感器的研究，如表面增強拉曼光譜（SERS）傳感器、免疫磁珠檢測技術和熒光技術等。這些技術提高了檢測靈敏度和特異性，為外泌體的定量分析和生物標志物檢測奠定了基礎[50]。然而，盡管這一領域的研究潛力巨大，截至2023年6月，F(xiàn)DA批準的基于外泌體技術的體外診斷產(chǎn)品數(shù)量依然非常有限。這一現(xiàn)象的原因有多個方面：首先，外泌體診斷技術仍處于早期發(fā)展階段，許多理論和實踐問題尚未完全解決，包括外泌體的分離、純化和檢測技術，以及確保其穩(wěn)定性和可靠性的問題。其次，外泌體的生物安全性和有效性尚需進行大量的臨床試驗驗證，這需要大量的時間和資金投入。此外，當前的監(jiān)管環(huán)境也對外泌體產(chǎn)品的市場推廣構成挑戰(zhàn)，中美監(jiān)管當局的審批過程嚴謹，且對新興技術往往持保守態(tài)度。

總的來說，外泌體在腫瘤體外診斷的應用前景廣闊，但目前進展較慢，主要由于技術難題、臨床試驗的長期性以及監(jiān)管環(huán)境的挑戰(zhàn)。然而，隨著轉(zhuǎn)化醫(yī)學和臨床研究的深入進行，跨學科、產(chǎn)學研之間的緊密合作將為技術創(chuàng)新和應用提供有力保障，外泌體技術在體外診斷領域的應用將得到更快地推進。期待更多基于外泌體的診斷產(chǎn)品通過監(jiān)管的批準，為腫瘤的臨床診斷、治療及預防提供更加精準和高效的解決方案。