晁岳恩,王沙沙,楊 劍,楊 攀,黃 超,汪慶昌,曹廷杰

(河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院小麥研究所,河南鄭州 450002)

小麥?zhǔn)俏覈?guó)主要農(nóng)作物之一,是多種面食的原料。小麥面粉的獨(dú)特性在于其蛋白與水相互作用能交聯(lián)形成疏松多孔的面筋。小麥的加工品質(zhì)與其蛋白含量密切相關(guān),小麥粉含有8%～20%的蛋白質(zhì),其中面筋蛋白約占小麥總蛋白質(zhì)含量的80%～85%,面筋蛋白的類型和含量影響面團(tuán)的強(qiáng)度、粘彈性、延展性等指標(biāo),決定著面粉的加工適用性[1-5]。在實(shí)際面制品加工中發(fā)現(xiàn),部分小麥品種蛋白含量較低,但面筋強(qiáng)度較高,說(shuō)明面粉質(zhì)量不僅受籽粒蛋白含量影響,蛋白成份也是重要的影響因素[6]。面筋蛋白的主要成份是麥谷蛋白和醇溶蛋白,麥谷蛋白按分子量大小可分為高分子量麥谷蛋白(HMW-GS)和低分子量麥谷蛋白(LMW-GS);HMW-GS通過(guò)分子間或分子內(nèi)二硫鍵作用形成面筋骨架,決定著面團(tuán)的強(qiáng)度和彈性[5-10]。HMW-GS僅占總面筋蛋白的10%,其亞基的組合方式被認(rèn)為決定著70%的面粉質(zhì)量特性[11-12];除遺傳因素外,栽培措施對(duì)面粉質(zhì)量也有影響[13]。

在育種過(guò)程中卻發(fā)現(xiàn),即使HMW-GS組合完全一致、蛋白含量相同的小麥品種的面粉質(zhì)量存在較大差異,面團(tuán)強(qiáng)度參數(shù)存在顯著差異,暗示除HMW-GSs外,可能還存在其它影響面團(tuán)強(qiáng)度性狀的蛋白類型。本研究以具有一定親緣關(guān)系且HMW-GS組合完全一致、蛋白含量基本相同、面粉質(zhì)量有較大差異的兩個(gè)品種為材料,在籽粒面筋蛋白積累速度較為穩(wěn)定的灌漿中期[14-16],通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析兩個(gè)品種面筋蛋白相關(guān)基因的表達(dá)差異,探討其面粉質(zhì)量差異的可能原因,為小麥品質(zhì)育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試品種為鄭麥369和鄭麥158,前期研究發(fā)現(xiàn),二者間HMW-GS組含完全相同,蛋白含量相同,面團(tuán)強(qiáng)度差異顯著。于2019—2020年度種植在河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)基地,小區(qū)長(zhǎng)6 m,寬2 m,行距0.2 m,相鄰種植,無(wú)重復(fù),常規(guī)管理。鄭麥369親本組合為鄭麥366×良星99,鄭麥158親本組合為(Bigeaz-250/96)×周麥16)×鄭麥366。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析樣品分別取自花后14、21、28 d的穗中部?jī)蓚?cè)籽粒,液氮速凍后帶回試驗(yàn)室保存于-80 ℃冰箱。收取成熟籽粒,磨粉并測(cè)定面粉質(zhì)量參數(shù)。

1.2 面粉品質(zhì)參數(shù)檢測(cè)

制粉:參照AACC 26-20方法,用BUHLER實(shí)驗(yàn)?zāi)ツシ?。粗蛋白含?用丹麥FOSS公司凱氏定氮儀Kjeltec測(cè)定。面團(tuán)流變學(xué)參數(shù):用德國(guó)Brabender公司的810104型粉質(zhì)儀(Farinograph),按GB/T14614-93測(cè)定吸水率、面團(tuán)形成時(shí)間、穩(wěn)定時(shí)間、弱化度。面筋參數(shù):用瑞典Perten公司的2200型面筋儀(Glutomatic),按GB/T14608-93測(cè)定小麥粉濕面筋含量及濕面筋指數(shù)。

1.3 面粉蛋白提取

醇溶蛋白和麥谷蛋白提取按照文獻(xiàn)優(yōu)化的方法[17],其中,SDS-PAGE分離膠濃度12%,濃縮膠濃度4%,考馬斯亮藍(lán)(R-250)染色。

1.4 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及生物信息學(xué)分析

RNA提取、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及生物學(xué)信息分析由杭州聯(lián)川生物技術(shù)有限公司(中國(guó),杭州)完成,所有技術(shù)操作、基因組比對(duì)、轉(zhuǎn)錄本組裝、FPKM定量及GO和KEGG富集分析工作均由該公司完成。每個(gè)樣品三次生物學(xué)重復(fù)。使用StringTie軟件(https://ccb.jhu.edu/software/hisat2)對(duì)基因或轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行組裝并用FPKM[每百萬(wàn)測(cè)序片段中來(lái)自某一基因每千堿基長(zhǎng)度的數(shù)目:FPKM = total_exon_fragments / mapped_reads(millions) 的exon_length(kB)]定量,使用R包edgeR(https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/edgeR.html)對(duì)樣本之間的差異基因進(jìn)行分析,差異倍數(shù)>2倍或<0.5倍,且P<0.05定義為差異表達(dá)基因。

1.5 面粉硫及巰基含量測(cè)定

硫含量檢測(cè):濃硝酸消化后用液相離子色譜測(cè)定硫元素含量(IC-2001; TOSOH, Japan),陰離子標(biāo)準(zhǔn)液使用Wako Pure Chemicals(Japan),詳細(xì)操作采用Maruyama優(yōu)化的方法[18]?？値€基和自由巰基含量測(cè)定及二硫鍵含量計(jì)算參考Wang等[19]的方法。

1.6 蛋白質(zhì)量評(píng)價(jià)

從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)下載不同類型的HMW-GSs氨基酸序列信息,利用巰基和二硫鍵含量預(yù)測(cè)在線程序(SCRATCH Protein Predictor:http://scratch.proteomics.ics.uci.edu),對(duì)部分差異表達(dá)基因編碼蛋白和HMW-GSs的自由巰基、二硫鍵含量進(jìn)行預(yù)測(cè),并利用蛋白質(zhì)量評(píng)價(jià)模型進(jìn)行評(píng)分比較[20]。

1.7 數(shù)據(jù)處理

采用 Excel 2007進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 面粉質(zhì)量參數(shù)分析

從表1可知,兩個(gè)品種的粗蛋白含量無(wú)顯著差異,鄭麥158的濕面筋含量和吸水率顯著低于鄭麥369,但面筋指數(shù)、形成時(shí)間和穩(wěn)定時(shí)間顯著高于后者,鄭麥158穩(wěn)定時(shí)間約為鄭麥369的兩倍,推測(cè)鄭麥158含有較多對(duì)面團(tuán)強(qiáng)度貢獻(xiàn)較大的面筋蛋白。

2.2 面筋蛋白亞基分析

從圖1可以看出,兩個(gè)品種的HMW-GS組合完全一致(1、5+10、7+8),說(shuō)明HMW-GS組合可能不是兩個(gè)品種之間面粉質(zhì)量差異的主要原因;LMW-GSs和醇溶蛋白的電泳圖譜稍有差異,推測(cè)這些蛋白的組成和含量差異可能是導(dǎo)致兩個(gè)品種之間品質(zhì)差異的原因。

圖1 兩個(gè)品種的麥谷蛋白和醇溶蛋白電泳圖

2.3 面筋蛋白的基因表達(dá)差異

根據(jù)測(cè)序結(jié)果,發(fā)現(xiàn)在小麥花后14、21、28 d時(shí),兩個(gè)品種間籽粒中HMW-GS基因表達(dá)均無(wú)顯著性差異,這與其蛋白檢測(cè)結(jié)果相同,說(shuō)明HMW-GSs不是兩個(gè)品種間面團(tuán)強(qiáng)度性狀差異的主要原因。由表2可知,與鄭麥369比較,鄭麥158在3個(gè)時(shí)間點(diǎn)共有24個(gè)(46次)基因表達(dá)有顯著差異,其中顯著上調(diào)表達(dá)基因12個(gè)(23次),顯著下調(diào)表達(dá)基因12個(gè)(23次)。上調(diào)表達(dá)基因包括9個(gè)燕麥類似蛋白基因(18次)、2個(gè)γ-醇溶蛋白基因(4次)和1個(gè)α-醇溶蛋白基因;下調(diào)表達(dá)基因包括11個(gè)α-或α/β-醇溶蛋白基因(21次)和1個(gè)燕麥類似蛋白基因(2次)。其中,燕麥類似蛋白基因占鄭麥158顯著上調(diào)表達(dá)基因總量的75%,暗示燕麥類似蛋白可能對(duì)面團(tuán)強(qiáng)度性狀有重要作用。

表1 兩品種的面粉品質(zhì)特性

表2 不同發(fā)育時(shí)期籽粒中表達(dá)顯著差異的貯藏蛋白基因

鄭麥158顯著上調(diào)表達(dá)基因的染色體組定位分析顯示,上調(diào)表達(dá)的基因全部位于A、D染色體組,其中A染色體組基因出現(xiàn)15次,占總數(shù)的65%。另外,從燕麥類似蛋白的染色體定位看,這些基因分別定位在7A、7D和4A染色體,7B染色體未發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)的燕麥類似蛋白基因。所以,從本研究?jī)蓚€(gè)材料來(lái)說(shuō),A組染色體編碼的面筋蛋白與面粉強(qiáng)度性狀的相關(guān)性最高,D組次之。

2.4 面粉硫及巰基集團(tuán)含量分析

為分析兩個(gè)品種的巰基集團(tuán)含量與面粉品質(zhì)的相關(guān)性,對(duì)面粉中的硫和巰基(自由巰基、總巰基)及分子內(nèi)二硫鍵含量進(jìn)行了分析,結(jié)果(表3)發(fā)現(xiàn),二者間總巰基含量無(wú)顯著差異,鄭麥158的總硫含量明顯較低,其自由巰基含量顯著高于鄭麥369。面粉中面筋蛋白占總蛋白含量的80%以上,可以用面粉中的硫及巰基含量衡量其在面筋蛋白中的含量。暗示在含硫氨基酸的組成上,鄭麥158面筋蛋白中的半胱氨酸殘基含量比例較高,且分子內(nèi)二硫鍵比例較低,而鄭麥369面筋蛋白中的甲硫氨酸殘基含量比例較高。

表3 兩個(gè)品種面粉中的巰基含量

2.5 差異表達(dá)蛋白的質(zhì)量評(píng)價(jià)

根據(jù)在線軟件(SCRATCH Protein Predictor)的分析原理,蛋白分子內(nèi)二硫鍵的有無(wú)和自由巰基數(shù)量分屬兩個(gè)獨(dú)立的預(yù)測(cè),即:當(dāng)一個(gè)蛋白被預(yù)測(cè)為無(wú)分子內(nèi)二硫鍵時(shí),也會(huì)預(yù)測(cè)潛在的二硫鍵含量。因此,在對(duì)蛋白的面粉質(zhì)量貢獻(xiàn)進(jìn)行評(píng)價(jià)時(shí),首先考慮二硫鍵的有,然后再考慮二硫鍵的數(shù)量。當(dāng)一個(gè)蛋白預(yù)測(cè)為無(wú)分子內(nèi)二硫鍵時(shí),其半胱氨酸數(shù)量全部視為自由巰基數(shù)量;有分子內(nèi)二硫鍵時(shí),總半胱氨酸數(shù)量減去形成二硫鍵的半胱氨酸數(shù)量后剩余的半胱氨酸數(shù)量即為自由巰基數(shù)量。具體評(píng)分方法按照分值=0.9x+0.3y計(jì)算,其中x為某個(gè)蛋白質(zhì)的自由巰基數(shù)量,y為這個(gè)蛋白質(zhì)的分子內(nèi)二硫鍵數(shù)量[20]。

從數(shù)據(jù)庫(kù)下載的部分HMW-GSs和差異表達(dá)基因編碼蛋白的評(píng)估分值見(jiàn)表4和表5,按照HMW-GS對(duì)面團(tuán)強(qiáng)度貢獻(xiàn)評(píng)分不低于3.6作為優(yōu)質(zhì)蛋白評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn),11個(gè)上調(diào)的差異表達(dá)基因編碼蛋白中,有9個(gè)達(dá)到優(yōu)質(zhì)蛋白標(biāo)準(zhǔn),其中γ-醇溶蛋白(TraesCS1D02G001100)在3個(gè)時(shí)間點(diǎn)都顯著上調(diào)表達(dá),且分值超過(guò)了全部HMW-GS的評(píng)分;僅有有兩個(gè)基因(TraesCS4A02G451811:Avenin-like b1;TraesCS1A02G007700:Gamma-gliadin A)沒(méi)有達(dá)到優(yōu)質(zhì)亞基標(biāo)準(zhǔn),但其評(píng)分(3.0分)也與中等類型的HMW-GS相同。在分析的3個(gè)下調(diào)基因中(在3個(gè)時(shí)間點(diǎn)出現(xiàn)8次),也有1個(gè)編碼蛋白達(dá)到了優(yōu)質(zhì)HMW-GS的分值,表明可能也有對(duì)面團(tuán)強(qiáng)度有貢獻(xiàn)的蛋白在鄭麥158中呈下調(diào)表達(dá)趨勢(shì)。

表4 基于巰基預(yù)測(cè)結(jié)果的HMW-GS質(zhì)量評(píng)價(jià)

表5 基于巰基預(yù)測(cè)結(jié)果的差異表達(dá)基因編碼蛋白的質(zhì)量評(píng)價(jià)

3 討論

面團(tuán)強(qiáng)度參數(shù)是衡量面粉品質(zhì)的重要指標(biāo),與面包烘焙體積呈正相關(guān)[5]。HMW-GS及其組合方式是影響面團(tuán)強(qiáng)度的主要遺傳因素[5-12]。本研究結(jié)果卻表明,燕麥類似蛋白和部分醇溶蛋白對(duì)面團(tuán)強(qiáng)度性狀也有較大影響。

燕麥類似蛋白為近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一類富含半胱氨酸的小麥面筋蛋白,被視為非典型面筋蛋白質(zhì)成分(atypical gluten components),包括a、b兩個(gè)大類,又可分為若干小類[21-22]。目前,燕麥類似蛋白與面粉品質(zhì)的相關(guān)研究還不多,已有的研究與本研究結(jié)果相似,如Wang等[23]曾將中國(guó)春中的一個(gè)b類燕麥類似蛋白基因在鄭麥9023中表達(dá),轉(zhuǎn)基因材料的面團(tuán)強(qiáng)度明顯提高,但在這個(gè)蛋白中額外引入1個(gè)半胱氨酸突變后,面團(tuán)強(qiáng)度和彈性下降;二硫鍵預(yù)測(cè)結(jié)果表明,新增加的巰基與分子內(nèi)的其他自由巰基形成了分子內(nèi)二硫鍵,表明與總巰基含量相比,面筋蛋白的高自由巰基含量才是其影響面團(tuán)強(qiáng)度的根本原因。Ma等[24-25]研究也發(fā)現(xiàn),類燕麥b貯藏蛋白具有改善面團(tuán)強(qiáng)度的潛力。關(guān)于a類燕麥類似蛋白與面粉質(zhì)量的關(guān)系,目前尚未檢索到相關(guān)研究文獻(xiàn),但從本研究結(jié)果看,高面團(tuán)強(qiáng)度品種鄭麥158的9個(gè)顯著上調(diào)的燕麥類似蛋白基因中,包括5個(gè)a類燕麥類似蛋白基因,且評(píng)分也全部達(dá)到了優(yōu)質(zhì)蛋白水平,由此推測(cè)a類燕麥類似蛋白在面團(tuán)強(qiáng)度性狀中發(fā)揮著重要效應(yīng)。

差異表達(dá)基因的染色體組定位分析顯示,燕麥類似蛋白基因全部位于A、D染色體組,在B組染色體上沒(méi)有發(fā)現(xiàn)燕麥類似蛋白基因。據(jù)推測(cè),普通六倍體小麥的四倍體祖先中曾發(fā)生過(guò)4AL/7BS易位或近著絲粒倒位情況,可能導(dǎo)致了原來(lái)應(yīng)該位于7BS的燕麥蛋白編碼位點(diǎn)轉(zhuǎn)移到了4AL上[26]。

醇溶蛋白是面筋蛋白的主要成分之一,通常認(rèn)為,醇溶蛋白是以非共價(jià)鍵形式結(jié)合到面筋中,主要影響面團(tuán)的粘性和延展性,對(duì)面團(tuán)強(qiáng)度具有負(fù)向效應(yīng)。本研究結(jié)果表明,高面團(tuán)強(qiáng)度鄭麥158的顯著下調(diào)表達(dá)的基因中,醇溶蛋白基因數(shù)量占總數(shù)的78.6%,這與醇溶蛋白對(duì)于面團(tuán)強(qiáng)度具有負(fù)向效應(yīng)的觀點(diǎn)一致[27-29]。但是,在鄭麥158的顯著上調(diào)表達(dá)基因中,兩個(gè)γ-醇溶蛋白(TraesCS1D02G001100,TraesCS1A02G007700)基因也表現(xiàn)顯著性上調(diào),其中位于1D染色體的醇溶蛋白(TraesCS1D02G001100)基因在3個(gè)時(shí)期均表現(xiàn)顯著性上調(diào),生物信息學(xué)分析表明其含有8個(gè)自由巰基,面團(tuán)強(qiáng)度的貢獻(xiàn)評(píng)分為7.2分,超過(guò)了公認(rèn)的優(yōu)質(zhì)HMW-GS(1Dy10和1Dx5),暗示其面團(tuán)強(qiáng)度有較大貢獻(xiàn)。有研究表明,某些醇溶蛋白也可以通過(guò)分子間二硫鍵結(jié)合到面筋中(尤其是奇數(shù)半胱氨酸殘基含量的蛋白質(zhì)至少存在一個(gè)自由巰基),進(jìn)而影響到面團(tuán)的強(qiáng)度[20,30-34]。

研究表明,面粉蛋白中的自由巰基和二硫鍵對(duì)面團(tuán)結(jié)構(gòu)及面團(tuán)穩(wěn)定性有重要影響,在揉面過(guò)程中,不同面粉蛋白質(zhì)分子的自由巰基相互結(jié)合成二硫鍵,形成的面筋骨架決定著面團(tuán)的結(jié)構(gòu)和特性[35-39]。因此,小麥蛋白中的巰基含量是決定面團(tuán)流變學(xué)特性及烘焙質(zhì)量的關(guān)鍵因素[40-41]。本研究表明,高面團(tuán)強(qiáng)度的鄭麥158中,自由巰基含量、總巰基含量和總二硫鍵含量均高于面團(tuán)強(qiáng)度較低的鄭麥369。因此,進(jìn)一步探索小麥籽粒蛋白中的高半胱氨酸和高自由巰基含量形成原因,對(duì)于闡釋小麥面粉質(zhì)量形成機(jī)制、完善優(yōu)質(zhì)小麥育種技術(shù)具有參考意義。

4 結(jié)論

燕麥類似蛋白在面團(tuán)強(qiáng)度性狀上有較大貢獻(xiàn),可能是決定面團(tuán)強(qiáng)度性狀的另一遺傳因素,個(gè)別類型的γ-醇溶蛋白可能對(duì)面團(tuán)強(qiáng)度性狀也有貢獻(xiàn);探索小麥籽粒蛋白中高半胱氨酸和高自由巰基含量的形成原因,對(duì)于完善現(xiàn)有優(yōu)質(zhì)小麥育種技術(shù)具有一定的參考意義。