余 燕,周茂潤(rùn),董 嘉,丁茂文,岳文麗,周可金,孫成亮,林咸永
(1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院,安徽合肥 230036;2.浙江大學(xué)環(huán)境與資源學(xué)院,浙江杭州 310058)
全球約30%的土地面積和50%的潛在可耕地是pH值低于5.5的酸性土壤,鋁毒是酸性土壤上作物生長(zhǎng)最主要的限制因子[1-3]。鋁毒害后植物表現(xiàn)出的最典型癥狀是根系生長(zhǎng)受阻,根尖是鋁毒害的原初位點(diǎn)[4]。鋁毒害會(huì)造成植物體一系列生理生化過程紊亂,如抑制養(yǎng)分吸收、干擾激素平衡和植物細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[5-7]。鋁脅迫會(huì)引起植物體內(nèi)活性氧(reactive oxygen species,ROS)代謝失衡,對(duì)植物造成氧化損傷[7-9]。植物在鋁脅迫下可通過誘導(dǎo)有機(jī)酸分泌、提高根際pH值、改變細(xì)胞壁特性和質(zhì)膜功能等機(jī)制抵御鋁的毒害[10-11],但目前關(guān)于在對(duì)鋁脅迫的適應(yīng)過程中植物體內(nèi)多胺、一氧化氮等信號(hào)分子的調(diào)控機(jī)制尚不清楚[12-15]。
多胺是植物體中重要的生理活性物質(zhì),可對(duì)逆境脅迫作出快速反應(yīng),進(jìn)而啟動(dòng)合成和分解過程,參與調(diào)節(jié)植物對(duì)逆境的適應(yīng)性[16-18]。植物體內(nèi)常見的多胺包括腐胺(putrescine,Put),亞精胺(spermidine,Spd)和精胺(spermine,Spm)[19-20]。外源添加適量多胺或者通過分子手段調(diào)控其代謝途徑可在一定程度上緩解植物逆境損傷[21-24]。關(guān)于多胺對(duì)植物鋁脅迫的響應(yīng)也有一些研究報(bào)道。 研究發(fā)現(xiàn),鋁脅迫可誘導(dǎo)水稻根系中Put大量積累,這可能是其抑制水稻根系伸長(zhǎng)的原因[25]。而西洋梨[12]和紅蕓豆[26]中Spd或Put的積累有助于增強(qiáng)植株耐鋁性,但也有人認(rèn)為Put與紅云衫細(xì)胞懸浮液的耐鋁性無關(guān)[27]。在番紅花中,外源Put、Spd和Spm處理均能顯著緩解鋁對(duì)植株根系伸長(zhǎng)的毒害作用[28]。由此可見,鋁脅迫下植物體內(nèi)多胺含量變化及其作用并不完全一致,在農(nóng)作物上也多采用單一品種進(jìn)行研究。本試驗(yàn)以前期篩選的耐鋁性差異顯著的2個(gè)小麥基因型為研究材料,分析了鋁脅迫下小麥根尖多胺種類和含量的變化及其與鋁耐性的關(guān)系,以期進(jìn)一步闡明小麥耐鋁性的生理生化機(jī)制。
本試驗(yàn)以前期篩選的耐鋁性差異顯著的2個(gè)小麥基因型西矮麥1號(hào)(耐性)和揚(yáng)麥5號(hào)(敏感)為研究材料[29]。種子消毒清洗后用去離子水浸種過夜,然后用濕潤(rùn)的紗布包裹置于25 ℃培養(yǎng)箱中避光催芽過夜。將發(fā)芽的種子轉(zhuǎn)移到懸浮于0.5 mmol·L-1CaCl2(pH 4.3 ± 0.1)溶液的塑料筐上進(jìn)行培養(yǎng)。營(yíng)養(yǎng)液的pH用濃度為0.1 mol·L-1的HCl或NaOH進(jìn)行調(diào)節(jié),且每天更換營(yíng)養(yǎng)液??刂婆囵B(yǎng)室的光照強(qiáng)度為300 μmol·m-2·s-1,光照和溫度設(shè)置為白天12 h/25 ℃和夜晚12 h/22 ℃,相對(duì)濕度為70%。3 d后選取長(zhǎng)勢(shì)一致的小麥幼苗進(jìn)行處理。試驗(yàn)設(shè)置無鋁對(duì)照(CK)和30 μmol·L-1AlCl3處理(Al),在鋁脅迫不同時(shí)間取根尖進(jìn)行測(cè)定。
1.2.1 根系伸長(zhǎng)量和鋁含量的測(cè)定
將3 d苗齡且長(zhǎng)勢(shì)一致的小麥幼苗轉(zhuǎn)移在含0或30 μmol·L-1AlCl3的0.5 mmol·L-1CaCl2(pH 4.3 ± 0.1)溶液中處理3、6、12和24 h。用直尺分別量取鋁脅迫前后的小麥主根長(zhǎng)度,各處理重復(fù)測(cè)定20株。根系伸長(zhǎng)量即處理前后的根長(zhǎng)度差。小麥根尖鋁含量依據(jù)Yu等[14]的方法測(cè)定,將處理后的小麥根尖0~10 mm部分(約0.15 g)用刀片迅速切下,用0.5 mmol·L-1CaCl2(pH 4.3 ± 0.1)溶液沖洗3次后放入含10 mL 2 mol·L-1HCl溶液的離心管中震蕩浸提24 h,然后用ICP-MS(Agilent 7500A,California,USA)測(cè)定。
1.2.3 根尖MDA含量和Evans Blue吸收量的測(cè)定
脂質(zhì)過氧化程度通常以MDA含量為指標(biāo),細(xì)胞膜的完整性采用Evans blue吸收量的方法進(jìn)行測(cè)定[31]。
1.2.4 組織染色和顯微觀察
1.2.5 多胺含量的測(cè)定
多胺采用高效液相色譜法進(jìn)行測(cè)定[32-33]。小麥根尖用5%(w/v)預(yù)冷的高氯酸(perchloric acid,PCA)在冰上充分研磨成勻漿,冰浴浸提1 h后,12 000 g 4 ℃下離心20 min。沉淀用5% PCA進(jìn)一步提取,離心,重復(fù)兩次,分別收集三次所得上清液和沉淀。
取混勻的上清液1 mL裝入安瓿瓶中,加入12 mol·L-1HCl封口,在110 ℃下酸解18 h。酸解后,在70 ℃下干燥后重溶于5% PCA中,然后取上清液加入1 mL 2 mol·L-1NaOH和10 μL苯甲酰氯原液進(jìn)行衍生,渦旋20 s混勻,37 ℃反應(yīng)25 min后加入2 mL飽和NaCl混勻中止反應(yīng),加入2 mL的乙醚萃取苯甲?;亩喟?離心后取1 mL乙醚相真空干燥,再次加入1 mL乙醚混勻干燥(重復(fù)2~3次),直到?jīng)]有明顯的苯甲酰氯氣味為止。最后,加入200 μL甲醇渦旋溶解。經(jīng)0.22 μmol·L-1濾膜過濾后,放入棕色液相色譜瓶?jī)?nèi)用高效液相色譜儀(Agilent 1200,USA)檢測(cè)。進(jìn)樣量為10 μL,色譜柱為Elipse XDB-C18反向色譜柱(4.6 mm × 150 mm 5 μm;Agilent,USA),柱溫30 ℃,流動(dòng)相為65%的甲醇,流速0.6 mL·min-1。用紫外檢測(cè)器于254 nm處檢測(cè)。以Put、Spd、Spm(Sigma-Aldrich)樣品做標(biāo)準(zhǔn)曲線,檢測(cè)方法同樣品。沉淀用5% PCA反復(fù)洗滌(2~3次)除去殘留的可溶性多胺,然后裝入安瓿瓶中,加入12 mol·L-1HCl封口,110 ℃下酸解18 h。酸解后,過濾除去碳化物質(zhì),70 ℃下干燥后,重溶于5% PCA,然后按照上述方法進(jìn)行衍生和測(cè)定。上清液和沉淀中含量相加即為多胺總量,單位為μmol·g-1FW。
使用DPS 18.10數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,處理間差異顯著性運(yùn)用LSD法比較,采用OriginPro 2022作圖。
鋁脅迫6 h可顯著抑制兩個(gè)小麥基因型的根系伸長(zhǎng),且隨著鋁脅迫時(shí)間的延長(zhǎng),兩個(gè)基因型根系伸長(zhǎng)的受抑程度均逐漸增大(圖1)。揚(yáng)麥5號(hào)的根系伸長(zhǎng)量始終低于西矮麥1號(hào),且基因型之間的差異隨著鋁脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增大。鋁脅迫24 h后,揚(yáng)麥5號(hào)和西矮麥1號(hào)的根系伸長(zhǎng)量分別為對(duì)照的30.21%和47.15%。鋁脅迫下,揚(yáng)麥5號(hào)根尖的鋁積累量及蘇木精染色深度均顯著高于西矮麥1號(hào)(圖2)。這表明鋁脅迫對(duì)小麥根系造成了毒害,且揚(yáng)麥5號(hào)根系生長(zhǎng)受抑制程度更嚴(yán)重。
圖柱上不同字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。下圖同。
圖2 鋁脅迫下兩個(gè)不同基因型小麥根尖鋁積累情況
鋁脅迫24 h后揚(yáng)麥5號(hào)和西矮麥1號(hào)根尖MDA含量分別較CK增加了147.20%和 67.12%(圖3A),Evans blue吸收量分別增加了226.96%和196.14%(圖3B)。Schiff’s reagent染色后,鋁脅迫24 h后兩個(gè)基因型小麥根尖染色程度均不同程度增加,說明鋁脅迫加劇了小麥根系膜脂過氧化,其中揚(yáng)麥5號(hào)膜脂過氧化程度更嚴(yán)重(圖3C)。從Evans blue吸收的染色結(jié)果(圖3D)看,鋁脅迫24 h后揚(yáng)麥5號(hào)根尖著色更深,進(jìn)一步說明其Evans blue吸收量更大,細(xì)胞膜完整性的破壞程度更嚴(yán)重。
圖3 鋁脅迫對(duì)兩個(gè)小麥基因型根尖膜脂過氧化程度和細(xì)胞膜完整性的影響
圖4 鋁脅迫對(duì)兩個(gè)小麥基因型根尖活性氧產(chǎn)生的影響
在CK條件下,小麥根尖Put含量以及Spd含量較低且相對(duì)穩(wěn)定,而Spm未被檢測(cè)到(可能由于含量低于檢測(cè)限);在鋁脅迫下,2個(gè)基因型根尖Put總量隨鋁脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)均不同程度增加,而Spd總含量則呈降低趨勢(shì)(圖5)。鋁脅迫6 h時(shí)西矮麥1號(hào)的Put含量顯著增加,在脅迫12 h時(shí)達(dá)到峰值32.11 μmol·g-1FW,約為CK的2倍;揚(yáng)麥5號(hào)的Put總量?jī)H在脅迫12 h后比CK增加約26.92%。與Put含量表現(xiàn)相反,鋁脅迫后Spd含量隨鋁脅迫時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸下降,鋁脅迫24 h時(shí)揚(yáng)麥5號(hào)和西矮麥5號(hào)分別較CK下降 46.24%和24.90%(圖5B)。這表明鋁脅迫誘導(dǎo)的多胺水平差異性變化可能是兩個(gè)小麥基因型耐鋁性不同的重要原因。
*和**分別表示在同一時(shí)間下Al脅迫處理與CK差異顯著(P<0.05)和極顯著(P<0.01)。
不同濃度和不同種類的多胺對(duì)鋁誘導(dǎo)的小麥根系伸長(zhǎng)的抑制作用效果不同(圖6)。其中,0.5~10 mmol·L-1Put處理均不同程度地緩解了鋁脅迫對(duì)小麥根系伸長(zhǎng)的抑制;當(dāng)Put濃度為2 mmol·L-1時(shí),緩解效果最佳,揚(yáng)麥5號(hào)和西矮麥1號(hào)的根系伸長(zhǎng)量分別為CK的76.05%和85.00%,分別比鋁單獨(dú)處理高152.96%和89.23%,對(duì)揚(yáng)麥5號(hào)根系伸長(zhǎng)受抑的緩解程度更大。而Spd和Spm不僅無緩解效果,甚至較低的濃度就加劇鋁毒程度(圖6B和C)。
圖6 外源多胺處理對(duì)鋁脅迫下小麥幼苗根系伸長(zhǎng)的影響
D-精氨酸(D-Arginine,D-Arg)是腐胺合成酶精氨酸脫羧酶(ADC)的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑,可有效抑制植物體內(nèi)多胺的合成。圖7結(jié)果顯示,CK條件下添加D-Arg對(duì)鋁毒害相關(guān)的各指標(biāo)無顯著影響,但在鋁脅迫下添加D-Arg處理后揚(yáng)麥5號(hào)和西矮麥1號(hào)根尖的MDA含量、Evans blue吸收量分別增加了48%、107%和43%、69%??梢?抑制多胺合成加劇了鋁對(duì)小麥根系的毒害,且西矮麥1號(hào)的加劇幅度更大,反向證明了腐胺可能有增強(qiáng)植物耐鋁性的作用。
圖7 D-精氨酸(D-Arg)對(duì)鋁脅迫下小麥幼苗根尖MDA含量和Evans blue吸收量的影響
鋁毒是酸性土壤上限制作物生長(zhǎng)最主要的障礙因子,植物根系伸長(zhǎng)受抑是鋁毒害后早期最典型的癥狀[4,7,10]。鋁在植物體內(nèi)的積累常會(huì)引起一系列生理生化變化,如活性氧大量積累、膜脂過氧化以及細(xì)胞膜完整性損傷程度增加等[8-9,31],同時(shí)會(huì)誘導(dǎo)植物對(duì)鋁毒脅迫的適應(yīng)性機(jī)制,如分泌有機(jī)酸、多胺積累等[3,11-13]。本試驗(yàn)結(jié)果表明,鋁脅迫下,西矮麥1號(hào)根系中Put含量迅速增加,Spd含量緩慢下降(圖5),同時(shí)活性氧積累量(圖4)、MDA含量和Evans blue吸收量較低(圖3),根尖鋁積累量(圖2)和根系伸長(zhǎng)受抑程度(圖1)也較輕;而鋁敏感基因型揚(yáng)麥5號(hào)根系Put含量增加較慢且幅度小,而Spd含量下降幅度較大,鋁毒害程度較重,表明鋁脅迫誘導(dǎo)的多胺水平變化與小麥耐鋁性密切有關(guān)。
研究表明,多胺對(duì)增強(qiáng)植物的抗逆性有重要的作用,并且植物體內(nèi)多胺水平的變化對(duì)逆境脅迫非常敏感,抗性植物在脅迫下通常會(huì)積累較高含量的多胺[14,16,19,22]。例如,在鷹嘴豆和大豆中,水分脅迫誘導(dǎo)多胺含量顯著升高,其中Put升幅最大,植株表現(xiàn)出較高脅迫耐性;但多胺尤其Put含量下降時(shí)植株則表現(xiàn)出嚴(yán)重的脅迫損傷[34]。鹽脅迫可顯著誘導(dǎo)耐性品種Pokkali中Put尤其是結(jié)合態(tài)Put的積累,而敏感品種則下降,表明Put積累及其向結(jié)合態(tài)轉(zhuǎn)化有助于增強(qiáng)植物抗鹽性[35]。本研究中,鋁脅迫下不同耐鋁性小麥基因型根尖多胺水平及其變化有所不同。鋁脅迫下西矮麥1號(hào)根尖Put含量的增加幅度顯著大于揚(yáng)麥5號(hào);Spd含量減少,而西矮麥1號(hào)下降幅度卻明顯小于揚(yáng)麥5號(hào)(圖5)。這表明Put含量增加可能有利于提高小麥幼苗對(duì)鋁脅迫的適應(yīng)能力,而Spd含量下降則有可能降低耐鋁性。這與Wen等[12]和Wang等[26]研究得出Spd或Put積累有助于增加西洋梨和紅蕓豆的耐鋁性,以及Wang和Kao[25]研究得出Put大量積累是水稻鋁毒害重要原因的結(jié)論并不完全一致,其原因可能與植物種類、對(duì)鋁脅迫的耐受程度、脅迫程度與時(shí)間的不同有關(guān)。本研究采用耐鋁性差異顯著的兩個(gè)小麥基因型為材料,分析其在短期鋁脅迫下根系多胺含量的變化,更有利于闡明其與耐鋁性的關(guān)系。
植物體內(nèi)多胺生物合成的中心產(chǎn)物是Put,主要來源于ADC和鳥氨酸脫羧酶(CDC)兩種途徑[36]。鳥氨酸脫羧酶途徑主要在植物的生長(zhǎng)發(fā)育中起作用,而ADC則與植物對(duì)脅迫的響應(yīng)有關(guān)[16,35]。例如,Do等[36]對(duì)21個(gè)水稻品種多胺合成相關(guān)基因表達(dá)分析發(fā)現(xiàn),干旱脅迫誘導(dǎo)的多胺積累主要依賴于ADC途徑。鹽脅迫下植株中ADC活性受抑后,Put合成減少[37]。但也有研究認(rèn)為,ADC和ODC兩種酶均受氧化脅迫[38]和鎘脅迫[22]誘導(dǎo),這兩種酶雖然是兩個(gè)獨(dú)立代謝途徑的關(guān)鍵酶,但在某些脅迫條件下可協(xié)同調(diào)控植物體內(nèi)多胺水平的變化。我們前期的試驗(yàn)通過對(duì)多胺合成酶活性的測(cè)定發(fā)現(xiàn),鋁脅迫下多胺的合成主要?dú)w因于ADC活性的增加[14]。鋁脅迫下添加ADC抑制劑D-Arg處理顯著加劇了鋁導(dǎo)致的膜脂過氧化和膜透性增加,且對(duì)西矮麥1號(hào)的加劇程度更嚴(yán)重(圖7),進(jìn)一步反向證明了Put積累在增強(qiáng)小麥耐鋁性中的作用。
鋁脅迫下小麥根尖多胺種類和含量的變化是調(diào)控小麥耐鋁性/鋁敏感性的重要因素。鋁誘導(dǎo)的西矮麥1號(hào)根尖Put含量大幅增加可能是其具有較強(qiáng)耐鋁性的主要原因,而揚(yáng)麥5號(hào)在鋁脅迫下根尖Spd含量大幅下降可能是其對(duì)鋁較敏感的原因。但是關(guān)于多胺種類及含量變化是如何影響植物耐鋁性的尚不清楚,關(guān)于鋁脅迫下植物體內(nèi)多胺調(diào)控植物耐鋁性的生理和分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。