張園清,張春丹,陳斌卿,江 嬌,鄭中堯,郭 瑩,劉坤祥,徐 虹

(西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,陜西楊凌,712100)

銨態(tài)氮是作物根系直接吸收利用氮素的重要形態(tài)之一,但國內(nèi)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)長期施用銨態(tài)氮肥,導(dǎo)致土壤中累積過多的NH4+,遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了作物生長所需的最適含量(0.1～0.5 mmol·L-1),進(jìn)而造成銨鹽毒害[1]。在一些近水灘地、湖泊洼地和海濱鹽漬土壤中,缺氧引起的反硝化作用和硝酸鹽異化效應(yīng)[2]使大量硝態(tài)氮被還原成銨態(tài)氮,又加劇了土壤的銨鹽毒害。因此,高銨脅迫已成為目前農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中面臨的一個重要環(huán)境問題,而一些鹽堿地植物可能同時受到高鹽與高銨的雙重脅迫。

植物谷氨酰胺合成酶(GS)有兩種形式,分別是定位于細(xì)胞質(zhì)的GS1和定位于葉綠體的GS2。GS1主要參與同化根吸收的NH4+以及葉片衰老過程中的氮素再利用;GS2可同化光呼吸過程所釋放的NH4+[3]。當(dāng)土壤中NH4+濃度過高時,根吸收的NH4+會立即被GS1同化為谷氨酸,在細(xì)胞中會產(chǎn)生大量質(zhì)子,從而加重酸負(fù)荷并導(dǎo)致植物中毒[4-5];當(dāng)NH4+的供應(yīng)量超過根最大的儲存和同化能力時,NH4+可通過木質(zhì)部被轉(zhuǎn)移到地上[6]。在鹽脅迫條件下,低鹽誘導(dǎo)GS基因的表達(dá),高鹽則抑制GS的活性[7-8]。Hoshida等[9]研究表明,過表達(dá)GS2基因可提高水稻的耐鹽性。Sahu等[10]研究表明,鹽脅迫條件下,耐銨水稻品種具有更高的GS活性。上述研究結(jié)果表明,GS參與植物對高銨和高鹽脅迫的響應(yīng)過程,并推測這兩種脅迫下的響應(yīng)機(jī)制相似。研究植物在高銨和高鹽脅迫下GS的調(diào)控機(jī)制,可為篩選兼具耐高銨及高鹽特性的優(yōu)良品系提供理論依據(jù)。

小麥作為旱生作物,對高銨脅迫敏感[11-12],在基因組中有12個編碼GS的基因(9個TaGS1和3個TaGS2[13]),協(xié)同完成小麥的氮素同化與轉(zhuǎn)運[14-16]。GS活性與小麥的氮素利用率和最終產(chǎn)量密切相關(guān),在一些低氮高效型小麥品種中,開花后GS活性顯著增加[17]。

銅麥6號是陜西省銅川市選育的旱地國審小麥新品種,具有綜合抗性好、高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的優(yōu)良特性,已在黃淮冬麥區(qū)旱地大面積推廣。研究表明,銅麥6號對低溫、鹽、干旱及其多重脅迫均具有較強(qiáng)的耐受性[18]。本研究以銅麥6號為試驗材料,探討高銨、高鹽及其雙重脅迫對小麥苗期生長的影響,分析小麥GS基因家族成員(根中的TaGS1;1、TaGS1;2和TaGS1;3基因以及葉片中的TaGS2基因)在逆境脅迫下的表達(dá)模式,初步揭示其對高銨與高鹽脅迫的響應(yīng)機(jī)制,以期探索銅麥6號在鹽堿地種植的可行性,并建立以TaGS為指標(biāo),篩選耐高銨與高鹽小麥新種質(zhì)的選育體系。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試小麥品種銅麥6號由陜西省大唐種業(yè)股份有限公司提供;對照品種中國春由本實驗室種植保存;煙農(nóng)19 (抗旱,耐鹽堿)[19]購自山東省祥豐種業(yè)有限責(zé)任公司;三抗10號(耐鹽堿)、矮優(yōu)王(即三抗矮優(yōu)王,抗旱)、煙農(nóng)21(抗旱)購自濟(jì)南朝暉種業(yè)有限公司;山農(nóng)25(抗旱)購自淄博博信農(nóng)業(yè)科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 高銨與高鹽處理下小麥種子發(fā)芽率的檢測

取供試小麥品種的種子,用75%的酒精溶液浸種1 min,然后用清水沖洗3次;室溫浸種萌發(fā)2 d至種子露白后,轉(zhuǎn)移至鋪有濾紙的9 cm培養(yǎng)皿中,分別用170 mmol·L-1NaCl和10 mmol·L-1NH4Cl溶液進(jìn)行高鹽和高銨處理,以蒸餾水為對照,每皿種子50粒,每個處理3次重復(fù);培養(yǎng)3 d后,以胚芽長≥0.3 cm為標(biāo)準(zhǔn)檢測種子發(fā)芽勢;培養(yǎng)7 d后,分別用10 mmol·L-1KNO3、10 mmol·L-1KNO3+170 mmol·L-1NaCl、10 mmol·L-1NH4Cl溶液繼續(xù)培養(yǎng)萌發(fā)的小麥種子4 d,觀察胚芽生長情況,統(tǒng)計胚芽長≥ 0.5 cm的種子數(shù),計算發(fā)芽率。

1.2.2 高銨與高鹽處理下小麥幼苗形態(tài)指標(biāo)的測定

以銅麥6號和中國春為材料,消毒后浸種萌發(fā),然后進(jìn)行水培試驗;取培養(yǎng)5 d至一葉期的小麥幼苗,移栽至弘博萊公司生產(chǎn)的水培盒中,在植物光照培養(yǎng)箱(25±1℃,16 h光照/8 h黑暗,光照強(qiáng)度3 000 Lux)中繼續(xù)培養(yǎng)2 d后,分別用85 mmol·L-1NaCl、10 mmol·L-1NH4Cl、85 mmol·L-1NaCl+10 mmo·L-1NH4Cl進(jìn)行培養(yǎng),以蒸餾水為對照,每3 d更換一次溶液。分別在處理后的第0、1、3、5、7天取樣,測量幼苗單株葉片和根的鮮重、主根和第一葉葉片的長度,并計算根冠比(幼苗單株根鮮重與葉片鮮重的比值),比較分析中國春與銅麥6號的差異。

1.2.3 高銨與高鹽處理下小麥幼苗GS家族基因的表達(dá)模式分析

主要檢測小麥GS基因家族中TaGS1;1、TaGS1;2和TaGS1;3基因(根系)以及TaGS2基因(葉片)的表達(dá)模式。采用1.2.2處理后-80 ℃凍存的小麥葉片和根組織約0.1 g,液氮研磨至干粉,加1 mL Trizol(西安海寧生物工程有限公司)提取總RNA,提取步驟按照說明書進(jìn)行,用Nanodrop紫外分光光度計測定RNA的濃度。用UEIris RT mix with DNase(All-in-One)反轉(zhuǎn)錄試劑盒(蘇州宇恒生物科技有限公司),按照說明書將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板,用2×SYBR Green qPCR Master Mix試劑盒(蘇州宇恒生物科技有限公司),在BioRad CFX Opus 384實時定量PCR儀上進(jìn)行qRT-PCR。PCR反應(yīng)體系為20 μL,包括2×SYBR Green qPCR Master Mix 10 μL,上、下游引物(10 μmol·L-1)各0.5 μL,cDNA模板2 μL,RNase free water 7 μL。PCR反應(yīng)程序:95 ℃ 120 s;95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,40個循環(huán);溶解曲線按照儀器提供的標(biāo)準(zhǔn)流程執(zhí)行。參考韋一昊等[13]設(shè)計的引物(表1),由楊凌天潤生物科技有限公司合成。以TaTEF1為內(nèi)參基因。采取2-ΔΔCt法計算基因的相對表達(dá)量,3次生物學(xué)重復(fù),用SPSS 22軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計與顯著性分析。

表1 本研究所用的qRT-PCR引物

2 結(jié)果與分析

2.1 高銨與高鹽處理對小麥種子發(fā)芽勢的影響

由表2可以看出,對照處理下,銅麥6號和中國春的種子發(fā)芽勢均大于80%,但與煙農(nóng)19、三抗10號和煙農(nóng)21無顯著差異,顯著高于矮優(yōu)王和山農(nóng)25。高銨處理下,銅麥6號的種子發(fā)芽勢最高,達(dá)84.00%,但與中國春、三抗10號和矮優(yōu)王無顯著差異,顯著高于煙農(nóng)19、山農(nóng)25和煙農(nóng)21。高鹽處理下,所有小麥的種子發(fā)芽勢均明顯降低,其中銅麥6號的種子發(fā)芽勢最高,但與煙農(nóng)19無顯著差異,顯著高于其他5個品種?？偟膩砜?高銨和高鹽處理下所有品種的種子發(fā)芽勢均有所降低,但銅麥6號在高銨處理下,與對照處理差異不明顯,仍具有相對較高的發(fā)芽勢,而在高鹽處理下明顯下降。

表2 高銨和高鹽處理對小麥種子發(fā)芽勢的影響

由于高鹽處理抑制了種子的萌發(fā)和幼芽的伸長,影響后續(xù)觀察與分析,種子萌發(fā)后第4 d,用10 mmol·L-1KNO3溶液代替蒸餾水作為對照,用10 mmol·L-1KNO3+ 170 mmol·L-1NaCl代替170 mmol·L-1NaCl作為高鹽處理,補(bǔ)充一定的氮源,消除單鹽毒害的影響。在不同的處理溶液中繼續(xù)培養(yǎng)4 d,統(tǒng)計發(fā)芽率。從表3可以看出,大多數(shù)品種在外加氮源(KNO3)后,促進(jìn)了種子的萌發(fā)。在10 mmol·L-1NH4Cl(高銨)處理下,銅麥6號的發(fā)芽率最高,顯著高于煙農(nóng)19、矮優(yōu)王、山農(nóng)25和煙農(nóng)21,但與中國春和三抗10號無顯著差異。在170 mmol·L-1NaCl + 10 mmol·L-1KNO3(高鹽)處理下,煙農(nóng)19的發(fā)芽勢最高,但與銅麥6號無顯著差異,顯著高于其他品種。

表3 外加氮源條件下高銨和高鹽處理下小麥品種的發(fā)芽勢

按照耐銨指數(shù)(10 mmol·L-1NH4Cl 與10 mmol·L-1KNO3兩個處理下發(fā)芽率的比值)排序,從高到低依次為銅麥6號>三抗10號>矮優(yōu)王>山農(nóng)25 >中國春>煙農(nóng)19 >煙農(nóng)21;按照耐鹽指數(shù)(170 mmol·L-1NaCl +10 mmol·L-1KNO3與10 mmol·L-1KNO3兩個處理下發(fā)芽率的比值)排序,從高到低依次為煙農(nóng)19 >銅麥6號>山農(nóng)25 >中國春>三抗10號>矮優(yōu)王>煙農(nóng)21。后續(xù)試驗分析選擇耐銨性與耐鹽性都與銅麥6號有較大差異的中國春作為對照品種,進(jìn)一步比較高銨與高鹽脅迫對銅麥6號幼苗生長的影響。

2.2 高銨、高鹽及其雙重處理對小麥幼苗生長的影響

2.2.1 高銨、高鹽及其雙重處理對小麥幼苗鮮重的影響

由圖1可以看出,對照處理的種子水培14 d后,葉片和根的鮮重均有所下降,說明靠種子自身貯存的營養(yǎng),小麥幼苗大約可以維持14 d的生長。高銨處理下銅麥6號幼苗的葉片鮮重持續(xù)增加,中國春幼苗在處理3 d后,葉片鮮重有所下降。高銨處理抑制了小麥幼苗根的生長,在處理7 d后對中國春根系生長的抑制作用大于銅麥6號。高鹽以及高銨與高鹽雙重處理3～7 d后,對小麥幼苗根的生長都有抑制作用,且對中國春的抑制作用大于銅麥6號。銅麥6號的幼苗葉片鮮重在高鹽處理1～5 d均持續(xù)增加,在處理5 d后開始下降,而中國春的幼苗葉片鮮重在處理3 d后就開始下降。

H2O:對照處理;NH4Cl:高銨處理;NaCl:高鹽處理;NaCl+NH4Cl:高銨與高鹽雙重脅迫處理。圖2～6同。

對高銨、高鹽及其雙重處理7 d后兩品種的幼苗葉片和根的鮮重進(jìn)行分析,從圖2可以看出,與對照處理相比,除高銨處理下銅麥6號的葉片鮮重有所提高外,高銨、高鹽及其雙重處理下兩品種的葉片和根的鮮重均有所降低,且三個處理下銅麥6號的葉片鮮重,以及高鹽處理下銅麥6號的根鮮重均顯著高于中國春。總的來看,三種處理對中國春幼苗的傷害更大,說明銅麥6號具有較強(qiáng)的耐高銨和耐高鹽特性。

**和***分別表示中國春和銅麥6號在0.01和0.001水平上差異顯著。圖3～5同。

2.2.2 高銨、高鹽及其雙重處理對小麥幼苗葉片和主根長度的影響

對高銨、高鹽及其雙處理7 d后兩品種的葉片和主根長度進(jìn)行分析,從圖3可以看出,與對照處理相比,三種處理均抑制了兩品種幼苗的葉片伸長,且對中國春的抑制程度大于銅麥6號,三種處理下銅麥6號的葉片長度均顯著高于中國春。與葉片有所不同,高銨處理促進(jìn)了中國春和銅麥6號幼苗的主根伸長,高鹽處理抑制了兩個品種幼苗的主根伸長,而高銨與高鹽雙重處理抑制了中國春幼苗的主根伸長,但對銅麥6號的抑制作用不明顯。高銨、高鹽處理下兩品種的主根長度無顯著差異,而高銨與高鹽雙重處理下,銅麥6號的主根長度顯著高于中國春。

*表示中國春和銅麥6號在0.05水平上差異顯著。圖4～5同。

綜合比較圖1、圖2和圖3,發(fā)現(xiàn)持續(xù)7 d的高銨、高鹽及其雙重處理均影響小麥幼苗的生長,對葉片和根的影響略有不同,品種間存在差異。高銨處理對幼苗生長的影響較小,但會降低幼苗根鮮重和第一葉葉片長度。高鹽處理會顯著抑制幼苗的生長以及根伸長。大多數(shù)情況下,銅麥6號幼苗的生長優(yōu)于中國春,具有較強(qiáng)的耐高銨和耐高鹽特性;而中國春對高鹽脅迫較敏感,具有一定的耐高銨特性。

2.2.3 高銨、高鹽及其雙重處理對小麥幼苗根冠比的影響

從圖4可以看出,對照處理下,中國春的根冠比在處理0、1、5和7 d均顯著小于銅麥6號。在高銨、高鹽及其雙重處理下,相對于對照處理,兩品種的根冠比均有所降低。高銨、高鹽處理7 d后,銅麥6號的根冠比顯著大于中國春;高銨與高鹽雙重處理7 d后,銅麥6號與中國春的根冠比差異不顯著。銅麥6號的根冠比除高鹽處理1 d后顯著小于中國春外,其他處理不同時間點均大于中國春,推測這與銅麥6號是旱地小麥品種有關(guān),根系發(fā)達(dá)、根冠比大是旱地小麥共有的形態(tài)特征。

圖4 不同處理對中國春和銅麥6號幼苗根冠比的影響

2.3 高銨、高鹽及其雙重處理對小麥幼苗TaGS基因表達(dá)的影響

2.3.1 根中TaGS1;1、TaGS1;2和TaGS1;3基因的表達(dá)模式

從圖5可以看出,在高銨處理下,兩品種TaGS1;1基因的相對表達(dá)量隨處理時間的延長呈持續(xù)升高的變化趨勢,在處理1～7 d后中國春TaGS1;1基因的表達(dá)量均顯著高于銅麥6號;在高鹽處理下,兩品種TaGS1;1基因的相對表達(dá)量隨處理時間的延長均呈先升后降的變化趨勢,均在處理5 d后達(dá)到峰值,在處理5～7 d后銅麥6號的表達(dá)量顯著高于中國春;在高銨與高鹽雙重處理下,兩品種TaGS1;1基因的相對表達(dá)量隨處理時間的延長均呈“升-降-升”的變化趨勢,中國春在處理7 d后達(dá)到峰值,銅麥6號在處理5 d后達(dá)到峰值,在處理1～7 d后中國春TaGS1;1基因的表達(dá)量均顯著高于銅麥6號。

在高銨處理下,兩品種TaGS1;2基因的相對表達(dá)量隨處理時間的延長均呈先升后降的變化趨勢,均在處理1 d后達(dá)到峰值;在高鹽處理下,TaGS1;2基因的表達(dá)量隨處理時間的延長在中國春中呈先降后升的變化趨勢,在銅麥6號中呈“升-降-升”的變化趨勢;在高銨與高鹽雙重處理下,兩品種TaGS1;2基因的表達(dá)量隨處理時間的延長均呈先升后降的變化趨勢,均在處理3 d后達(dá)到峰值。三種處理下銅麥6號TaGS1;2基因的表達(dá)量均在處理1～5 d后顯著高于中國春。

在高銨處理下,TaGS1;3基因的相對表達(dá)量隨處理時間的延長在中國春中持續(xù)升高的變化趨勢,在銅麥6號中呈“升-降-升”的變化趨勢,且在處理1 d后達(dá)到峰值,在處理1～7 d銅麥6號TaGS1;3基因的相對表達(dá)量顯著高于中國春;在高鹽處理下,兩品種TaGS1;3基因的相對表達(dá)量隨處理時間的延長呈持續(xù)升高的變化趨勢,在處理1～7 d后中國春TaGS1;3基因的相對表達(dá)量顯著高于銅麥6號;在高銨與高鹽雙重處理下,TaGS1;3基因的相對表達(dá)量隨處理時間的延長在中國春中呈持續(xù)升高的變化趨勢,在銅麥6號中呈先升后降的變化趨勢,且在處理3 d后達(dá)到峰值,在處理1 d后其表達(dá)量顯著高于中國春,在處理5～7 d后顯著低于中國春。

2.3.2 葉片中TaGS2基因的表達(dá)模式

從圖5可以看出,在高銨處理下,中國春和銅麥6號葉片TaGS2基因的相對表達(dá)量隨處理時間的延長均呈先升后降的變化趨勢,分別在處理1 d和5 d后達(dá)到峰值,在處理3～5 d后銅麥6號的相對表達(dá)量顯著高于中國春;在處理1 d后顯著低于中國春。在高鹽處理下,中國春和銅麥6號TaGS2基因的相對表達(dá)量隨處理時間的延長也均呈先升后降的變化趨勢,分別在處理1 d和3 d后達(dá)到峰值,在處理3～7 d后銅麥6號的相對表達(dá)量顯著高于中國春。在高銨與高鹽雙重處理下,TaGS2基因的相對表達(dá)量隨處理時間的延長在中國春中呈“降-升-降-升”的變化趨勢,在銅麥6號中呈先升后降的變化趨勢,均在處理3 d后達(dá)到峰值,在處理1～5 d后銅麥6號的相對表達(dá)量顯著高于中國春。

3 討論

3.1 高銨與高鹽處理對小麥苗期生長和生理指標(biāo)的影響

耐銨小麥品種具有較高的氮素利用效率和產(chǎn)量,可提高鹽堿地的利用率,因此篩選耐銨品種具有重要意義。劉 揚等[20]和李春順等[19]以高銨(10 mmol·L-1NH4+)條件下的小麥種子萌發(fā)率、幼苗形態(tài)、根冠比為指標(biāo),篩選出煙農(nóng)19、豫麥49等耐高銨品種,以及鄭引1號、鎮(zhèn)麥9523、魯麥15等高銨敏感型品種。本研究發(fā)現(xiàn),銅麥6號表現(xiàn)出耐高銨和耐高鹽的特性,煙農(nóng)19則表現(xiàn)為耐高鹽、不耐高銨的特性,這與李春順等[19]的研究結(jié)果不一致,但與李德福等[21]的研究結(jié)果較為一致。與銅麥6號相比,模式品種中國春的耐高銨性與耐鹽性均較低。

3.2 高銨與高鹽處理對小麥苗期TaGS基因表達(dá)模式的影響

當(dāng)NH4+為單一氮源時,短時間內(nèi)會誘導(dǎo)小麥根中GS的活性增加,長時間則會抑制GS的活性[22]。高銨處理條件下,耐高銨品種由于具有較強(qiáng)的銨同化能力,其葉片中GS的活性和游離氨基酸含量增加,但NH4+含量降低[19]。鹽脅迫條件下,小麥GS活性隨著鹽濃度的增加而下降,且隨著鹽濃度的增加,葉片中NH4+的濃度也會持續(xù)增加[7-8],因此高鹽脅迫也會引起銨鹽毒害。

本研究發(fā)現(xiàn),小麥苗期根中3個TaGS1基因均響應(yīng)高銨和高鹽處理,且對高鹽處理更敏感。除高銨與高鹽雙重處理7 d后中國春TaGS1;2的表達(dá)量顯著高于銅麥6號外,其他處理銅麥6號TaGS1;2的表達(dá)量均顯著高于中國春,說明銅麥6號的耐脅迫特性與TaGS1;2密切相關(guān),這與朱忠欣[23]在水稻中的研究結(jié)果一致。原因可能是3個TaGS1基因?qū)Ω咪@、高鹽處理的響應(yīng)分工不同,TaGS1;1和TaGS1;3基因主要作用于根尖,而TaGS1;2基因在根尖和根毛區(qū)都可發(fā)揮作用[6]。

此外,高銨與高鹽雙重處理對小麥幼苗生長及TaGS1基因表達(dá)的抑制,并不是兩種脅迫效應(yīng)的簡單疊加,外源NH4+也會緩解高鹽脅迫(NaCl)所造成的傷害,這從另一個方面說明存在某種機(jī)制使細(xì)胞對NH4+的吸收轉(zhuǎn)運與Na+的吸收有關(guān)。我們提出假設(shè),液泡中NH4+或Na+的貯存,是耐銨鹽毒害或耐鹽脅迫的重要原因,植物細(xì)胞質(zhì)膜和液泡膜上存在著NH4+/H+反向或同向轉(zhuǎn)運體,通過改變胞內(nèi)H+濃度可以調(diào)控Na+/H+-ATPase的活性,進(jìn)而影響對Na+的吸收,但有待進(jìn)一步試驗驗證。

小麥TaGS2基因與耐鹽性密切相關(guān),通過同化光呼吸所產(chǎn)生的NH4+,保護(hù)PSII的活性,減少電子傳遞所產(chǎn)生的超氧化物[24]。Hoshida等[9]研究表明,過表達(dá)GS2基因的水稻中,葉肉細(xì)胞NH4+和Na+的濃度與GS2的活性高度相關(guān)。本研究結(jié)果也表明,除高銨和高鹽處理1 h外,其他三個處理下不同時間點,銅麥6號葉片中TaGS2基因的表達(dá)量均高于中國春,表明銅麥6號苗期葉片TaGS2基因的表達(dá)與其耐高銨和耐高鹽特性密切相關(guān)。本研究在銅麥6號苗期鑒定的耐高銨和耐高鹽特性,并不能代表其在分蘗期、拔節(jié)期和灌漿期的耐脅迫特性,因此后續(xù)需用盆栽或大田試驗進(jìn)行進(jìn)一步鑒定,并對脅迫條件下TaGS基因的表達(dá)模式及功能進(jìn)行深入研究,為選育耐高銨優(yōu)良種質(zhì),提高小麥在高銨及高鹽脅迫下的氮素利用效率及產(chǎn)量奠定基礎(chǔ)。