蔣正寧,高致富,壽露露,江 偉,王 玲,陳甜甜,張 勇,高德榮

(江蘇里下河地區(qū)農業(yè)科學研究所/農業(yè)部長江中下游小麥生物與遺傳改良重點實驗室,江蘇揚州 225007)

小麥赤霉病主要是由禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearum)引起的一種嚴重的小麥穗部病害,除造成產量降低外,在病原菌侵染過程中也會產生多種真菌毒素,嚴重危害人畜健康。小麥赤霉病抗性是由多基因控制的數量性狀[1],抗性機制較為復雜,至今尚未發(fā)現高抗赤霉病的品種。因此,挖掘抗赤霉病基因對于培育抗性品種具有重要意義。

木瓜類半胱氨酸蛋白酶(PLCPs)廣泛存在于多種植物中,參與種子萌發(fā)[2]、花藥發(fā)育[3]、衰老[4-5]以及逆境脅迫響應[6-9]等多種生理過程,且在植物細胞程序性死亡(PCD)過程中發(fā)揮重要調控作用[10-11]。研究表明,PLCPs作為植物抗病反應的關鍵酶,其缺失或突變會導致植物免疫系統(tǒng)受損,減弱寄主的抗病性[8]。如在煙草中沉默PLCPs家族基因NbCathB,能夠抑制ROS的積累和內質網壓力誘導的過敏性-程序性細胞死亡(HR-PCD)[11];擬南芥PLCPs家族基因xcp2突變會導致其更易受到茄科青枯勞爾氏菌(Ralstoniasolanacearum)的侵染[12]。擬南芥PLCPs家族重要成員RD21被認為是細胞死亡的前體信號[13],敲除或者沉默RD21會導致擬南芥更易受到灰霉[14]、卵菌[15]和細菌[16]的侵染;同時擬南芥中RD21還負調控霉菌毒素FB1(伏馬菌素B1)誘導的PCD[17]。

本課題組前期通過RNA-seq數據分析,從抗赤霉病小麥品種(揚麥17)和感赤霉病小麥品種(揚麥15)轉錄組測序中篩選到一個差異表達基因(Traes_2DL_02G546600)。本研究基于該基因序列設計引物,從小麥中克隆獲得三個TaRD21基因(TaRD21-2A/2B/2D),然后對這三個基因進行生物信息學分析,并分析水楊酸(SA)、乙烯利(ETH)及赤霉病菌誘導下這三個基因的表達特性,以期為進一步解析RD21基因在小麥中的功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試小麥材料的感赤霉病品種揚麥15和抗赤霉病品種揚麥17,均由本實驗室保存。所用赤霉病菌為強致病力菌株f0609,由江蘇省農科院植保所陳懷谷研究員提供。

1.2 誘導處理及cDNA合成

將揚麥15和揚麥17分別種植于溫室花盆中,待出苗后在4 ℃人工氣候室中春化3周,然后轉移至溫室中,每天光照16 h,平均溫度28 ℃(晝)/16 ℃ (夜)。將預培養(yǎng)2～3 d的赤霉病菌接種于綠豆湯培養(yǎng)基中,25 ℃振蕩培養(yǎng)4～5 d,使其產生孢子。用4層無菌紗布過濾菌絲,收集孢子,然后用無菌水將孢子液濃度調至5×105～10×105個·mL-1。于開花期采用單花滴注接種法進行接種,每小花接種孢子懸浮液10 μL,以無菌水處理為對照,并作標記。接種后用透明塑料袋套袋保濕,在接種0、24、48和72 h后采集穎殼,每個時間點分別取10穗。

待揚麥17和揚麥15生長2周左右,用2 mmol·L-1水楊酸(SA)和200 μmol·L-1乙烯利(ETH)噴施小麥葉片。分別在噴施0、2、4、6、12和24 h后取樣,以噴施蒸餾水為對照。

以上所有處理的小麥樣品采集后迅速置于液氮中處理,-80℃冰箱保存。用Eastep○RSuper Total RNA Extraction Kit試劑盒(Promega,美國)分別提取上述樣品的總RNA,用M-MLV Reverse Transcriptase試劑盒(Promega,美國)合成 cDNA。所有處理均設3次生物學重復。

1.3 TaRD21基因的克隆

前期利用RNA-seq數據分析了抗赤霉病小麥品種揚麥17和感赤霉病小麥品種揚麥15接種赤霉病菌后基因表達譜之間的差異,獲得1個注釋為RD21 Cysteine proteases的EST(Traes_2DL_02G546600),以此序列檢索小麥最新基因組數據庫WheatOmics 1.0(http://202.194.139.32),獲得基因CDS序列。根據CDS序列設計引物TaRD21-F/R(表1),以接菌72 h后的揚麥17穎殼cDNA為模板進行擴增。PCR擴增體系為20 μL,包括2×Phanta Max Master Mix 10 μL(諾唯贊,南京),模板cDNA 2 μL,上、下游引物(10 μmol·L-1)各0.5 μL,ddH2O 7.0 μL。PCR擴增程序:94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,68 ℃ 30 s,72 ℃ 2 min,35個循環(huán);72 ℃延伸10 min。擴增產物經1%的瓊脂糖凝膠電泳分離,然后進行目的條帶回收和測序。

表1 本研究所用的引物

采用CTAB法提取揚麥17的基因組DNA(gDNA),以此為模板,擴增TaRD21基因的全長片段。所用引物以及PCR擴增體系和擴增程序同上。

1.4 TaRD21基因的染色體定位

根據三個TaRD21基因的gDNA序列,在序列差異較大的內含子區(qū)域設計特異引物clTaRD21-F/R(表1),利用整套小麥缺體-四體對TaRD21基因進行染色體定位分析。

1.5 序列分析和同源性比對

用NCBI在線分析工具ORF Finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)預測基因的開放閱讀框;用SMART在線軟件(http://smart.embl-heidelberg.de)對編碼蛋白的結構域進行分析;用ProtParam在線軟件 (http://expasy.org/tools/protparam.htm1)分析編碼蛋白的理化性質;用SOPMA軟件(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_sopma.html)對編碼蛋白的二級結構進行預測;用TMHMM軟件(https://cbs.dtu.dk/service.php/TMHMM-2.0)進行跨膜結構預測分析;用DNAMAN軟件進行多序列比對,用MEGA 5.0軟件構建系統(tǒng)進化樹。

1.6 TaRD21基因的表達模式分析

根據TaRD21基因序列,設計特異的qRT-PCR引物qTaRD21-2A/2B/2D-F/R(表1),以SA和ETH處理的幼苗cDNA以及接種赤霉病菌的穎殼cDNA為模板,以無菌水處理為對照,利用BioRad CFX96TM實時熒光定量PCR儀檢測目的基因的表達模式。內參基因為β-Actin。按照SYBR Primix ExTaq試劑盒(TaKaRa,北京)說明書配制PCR反應體系。反應程序:95 ℃ 30 s;95 ℃ 10 s,60 ℃ 15 s,72 ℃ 20 s,40個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計算基因的相對表達量。每個樣品設3個重復, 每次處理有3個生物學重復。用DPS7.05軟件進行差異顯著性分析(LSD法)。

2 結果與分析

2.1 TaRD21基因的克隆和蛋白結構分析結果

以TaRD21-F/R為引物,以接菌72 h后的小麥(揚麥17)穎殼cDNA為模板進行PCR擴增,獲得一個大約1 400 bp的片段(圖1)。測序分析發(fā)現,共獲得三個長度分別為1 419、1 410和1 428 bp的cDNA片段,分別編碼472、469和475個氨基酸。同時以TaRD21-F/R為引物,以揚麥17的gDNA為模板進行PCR擴增,獲得一個大約3 500 bp的片段(圖1),經回收與測序,發(fā)現其包含三個不同長度的TaRD21基因序列。

M: Trans2K DNA marker.

2.2 TaRD21基因的染色體定位

以clTaRD21-F/R為引物,以中國春第二同源群缺體-四體的gDNA為模板,進行基因染色體定位分析。結果顯示,以N2A/T2B、N2A/T2D的gDNA為模板時,擴增結果缺少229 bp的片段;以N2B/T2A的gDNA為模板時,擴增結果缺少264 bp的片段;以N2D/T2A的gDNA為模板時,擴增結果缺少351 bp的片段。因此,將三個TaRD21基因定位在小麥第2同源群染色體上(圖2),并分別命名為TaRD21-2A、TaRD21-2B和TaRD21-2D。定位結果與小麥基因組數據庫預測分析結果一致。

1:中國春;2:揚麥15;3:揚麥17;4:N2A/T2B;5:N2B/T2A;6:N2A/T2D;7:N2D/T2A。

2.3 TaRD21基因的生物信息學及二級結構分析

用NCBI在線工具ORF Finder分析發(fā)現,三個TaRD21基因均含有 5 個外顯子和4 個內含子(圖3A)。用SMART軟件分析發(fā)現,三個TaRD21蛋白均含有N端信號肽(signal peptide)、自抑制結構域(auto-inhibitory domain)、蛋白酶結構域(protease domain)和C端顆粒蛋白結構域(granulin domain),其中C端顆粒蛋白結構域大約包含60個氨基酸,含有14個保守的Cys結構(Cx5Cx5CCCx7Cx4CCx6CCx5CCx6Cx6C)(圖3B和圖4),屬于典型的PLCPsRD21亞族。用ProtParam軟件分析發(fā)現,三個TaRD21蛋白分子量在50.4～50.9 kD之間,等電點在5.41～5.71之間,表面帶負電荷的氨基酸均有57個,表面帶正電荷的氨基酸有47～49個,為脂溶性的疏水蛋白,均含有跨膜結構,其二級結構均包含α螺旋、延伸鏈、β折疊和無規(guī)則卷曲在TaRD21-2A蛋白中占比為26.48%、4.87%、52.54%和16.10%;在TaRD21-2B蛋白中占比為23.88%、4.48%、53.73%和17.91%;在TaRD21-2D蛋白中占比為24.63%、5.26%、53.68%和16.42%。

A:TaRD21基因結構示意圖;B:TaRD21蛋白的保守結構域。

下劃線分別代表TaRD21蛋白的4個保守結構域;綠色線為信號肽;粉色線為自抑制結構域;藍色線為蛋白酶結構域;紅色線為顆粒蛋白結構域;黑色點為保守Cys。

2.4 TaRD21基因的同源性比對及進化分析

利用DNAMAN軟件對三個TaRD21基因及TaRD21蛋白的氨基酸序列進行比對,發(fā)現三個基因的DNA序列相似性為89.3%;三個TaRD21蛋白的氨基酸序列相似性為95.6%,差異較大的區(qū)域為信號肽結構域,而其他3個結構域序列保守性較高(圖4)。為進一步研究TaRD21基因在不同物種中的進化情況,利用MEGA 5.0軟件構建小麥TaRD21蛋白與水稻(Oryzasativa)、玉米(Zeamays)、大麥(Hordeumvulgare)、烏拉爾圖小麥(Triticumurartu)、擬南芥(Arabidopsisthaliana)和菠蘿(Ananascomosus) RD21蛋白的系統(tǒng)進化樹,發(fā)現小麥TaRD21蛋白與雙子葉植物擬南芥、菠蘿的RD21蛋白同源性較低,但與單子葉植物水稻、玉米、大麥和烏拉爾圖小麥的RD21蛋白同源性較高;TaRD21-2A蛋白與小麥A基因組起源物種烏拉爾圖小麥TuRD21A蛋白的同源性高于TaRD21-2B和TaRD21-2D蛋白(圖5)。

括號中為RD21蛋白的 GenBank 登錄號,進化樹分支上的數字為Bootstrap值。

2.5 TaRD21基因的表達模式分析

2.5.1TaRD21基因在不同激素脅迫下的表達模式

從圖6可以看出,抗赤霉病小麥品種揚麥17和感赤霉病小麥品種揚麥15中,三個TaRD21基因均受SA和ETH誘導表達,且具有明顯差異。揚麥17中TaRD21-2B和TaRD21-2D的表達量總體高于揚麥15;而揚表15中TaRD21-2A基因的表達量總體上高于揚表17中該基因的表達量。在揚表17中,TaRD21-2B和TaRD21-2D基因對ETH的響應更為迅速,分別在誘導4和2 h后達到峰值;在揚麥15中,TaRD21-2A基因對SA的響應更為迅速,在誘導4 h后表達量達到峰值。表明TaRD21基因的表達受SA和ETH調控,但在抗、感赤霉病小麥品種中表現不同。

圖柱上不同字母表示在0.05水平差異顯著。下同。

2.5.2TaRD21基因在赤霉病菌誘導下的表達模式

從圖7可以看出,接種赤霉病菌后,揚麥17和揚麥15中三個TaRD21基因均上調表達,其中揚麥17中TaRD21-2B和TaRD21-2D基因對赤霉病菌響應迅速,均在接種12 h后表達量達到峰值,顯著高于揚麥15中這兩個基因的表達量;而TaRD21-2A基因的表達量在接種48 h后才達到峰值,對赤霉病菌的響應表現比較遲緩。在揚麥15中,TaRD21-2A基因的表達量在接種后逐漸升高,并在接種24 h后達到峰值,此后表達量雖然有所下降,但仍維持較高水平,并顯著高于對照(接種0 h)處理;TaRD21-2B和TaRD21-2D基因的表達量在接種12 h后無顯著變化,在接種24～72 h后均顯著高于對照(接種0 h)處理。

圖7 赤霉病菌誘導下TaRD21基因在不同抗性小麥品種中的表達模式

3 討論

本研究發(fā)現,3個TaRD21基因都存在信號肽、自抑制區(qū)、蛋白酶和顆粒蛋白結構域,具有典型的PLCPs家族特征。通過進化分析發(fā)現,3個TaRD21基因與禾本科植物RD21基因聚在一個大分支上,且與烏拉爾圖小麥、大麥RD21基因親緣關系最為接近,說明禾本科植物的RD21基因進化相對保守。TaRD21-2A與小麥A基因組祖先物種烏拉爾圖小麥的RD21基因序列同源性更高,進一步表明RD21基因在小麥進化過程中非常保守。

植物內源蛋白酶PLCPs在植物免疫調節(jié)中發(fā)揮重要作用,編碼PLCPs的基因缺失會削弱植物的免疫反應[8]。如:擬南芥缺失突變體rd21在接種灰霉菌(Botrytiscinerea)后更易感病[14];擬南芥缺失突變體rd19在接種茄科青枯勞爾氏菌(Ralstoniasolanacearum)后抗病性喪失[18];煙草中RD21同源基因C14沉默后,煙草對致病疫霉(Phytophtthorainfestans)的抗病性減弱[16]。另外,PLCPs也是依賴水楊酸(SA)的防御信號傳導的關鍵調控因子。Ziemann等[19]研究表明,PLCPs是SA調控植物免疫信號通路中的一個重要組分,發(fā)揮正向調節(jié)作用。一般認為,SA介導的系統(tǒng)獲得抗性(SAR)反應主要對活體營養(yǎng)型病原菌起作用,而JA、乙烯(ET)介導的抗病信號途徑對抵抗死體營養(yǎng)型真菌的侵染起重要作用[20]。引發(fā)小麥赤霉病的禾谷鐮刀菌是一種半活體營養(yǎng)型真菌,因而小麥赤霉病抗病機制較為復雜。本研究通過qRT-PCR技術分析了SA、ETH處理及接種赤霉病菌條件下3個小麥TaRD21基因的表達情況,發(fā)現SA和ETH均能顯著誘導TaRD21基因上調表達,但在抗、感赤霉病小麥品種中,3個基因的表達模式有差異。在抗病品種中,TaRD21-2B和TaRD21-2D基因對ETH的響應更迅速,同時也受赤霉病菌誘導表達,推測這兩個基因可能參與ETH介導的赤霉病抗性反應;而在感病品種中,TaRD21-2A基因對SA及赤霉病菌的響應更為快速,推測TaRD21-2A可能與感病性相關,即在小麥與赤霉病菌互作中發(fā)揮負調控作用。已有研究表明,RD21基因與細胞死亡的前體信號相關,而引發(fā)細胞死亡是促進死體營養(yǎng)型真菌迅速侵染的重要途徑。擬南芥通過RD21負調控霉菌毒素FB1,提高了擬南芥對死體營養(yǎng)型串珠鐮刀菌(Fusariummoniliforme)的抗性[13],表明RD21是擬南芥死體營養(yǎng)型串珠鐮刀菌的隱性感病基因。TaRD21-2A基因在小麥與赤霉病菌互作中是否行使類似的功能,有待通過基因編輯敲除該基因,深入研究該基因的功能。