李 明，吳佩澤

(中國計量科學(xué)研究院，北京 100029)

二硫鍵是由多肽鏈內(nèi)或鏈間的2個半胱氨酸側(cè)鏈巰基(-SH)共價交聯(lián)形成的一種非常重要的翻譯后修飾。在生物醫(yī)藥領(lǐng)域，大多數(shù)激素、生長因子和單克隆抗體等蛋白質(zhì)分子含有二硫鍵，其對于穩(wěn)定這些蛋白質(zhì)分子的空間結(jié)構(gòu)、維持正確的折疊構(gòu)象、保持及調(diào)節(jié)生物活性和行使生理學(xué)功能等具有重要作用。這類含二硫鍵的藥物在合成過程中容易發(fā)生二硫鍵的還原和重排，這些副反應(yīng)可導(dǎo)致非原生二硫鍵(nonnative disulfide bond)的形成、蛋白質(zhì)的聚集，進(jìn)而可能誘發(fā)免疫原性，使藥物失活。因此，對多肽和蛋白質(zhì)類藥物中二硫鍵的定位和分析是生物醫(yī)藥領(lǐng)域的研究重點之一[1]。鑒于全球肽類和蛋白質(zhì)類藥物的迅速發(fā)展，二硫鍵的表征已成為生物制藥安全性和有效性質(zhì)量審評[2-3]中不可或缺的重要環(huán)節(jié)。

二硫鍵的表征主要包括構(gòu)型構(gòu)象(與空間結(jié)構(gòu)相關(guān)的三維參數(shù))[4]、位置或配對方式(與化學(xué)鍵鍵合相關(guān)的二維參數(shù))的識別定位和數(shù)目的確定(一維參數(shù))等3方面[3,5-6]。二硫鍵的S—S伸縮振動頻率對其所處的構(gòu)象非常敏感，因此可以采用拉曼光譜探測肽和蛋白質(zhì)的構(gòu)象特征。處于550～500 cm-1區(qū)域內(nèi)的拉曼光譜吸收歸因于二硫鍵的伸展運動，即v(S—S)，所以一般對該區(qū)域內(nèi)的拉曼譜帶進(jìn)行構(gòu)象確認(rèn)。確定二硫鍵的數(shù)目相對簡單，通過比較加入還原劑完全還原前后，多肽或蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量之差即可獲得。對二硫鍵位置或配對方式的識別是最具挑戰(zhàn)性的，二硫鍵的定位對進(jìn)一步揭示蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)、指導(dǎo)評估化學(xué)和生物學(xué)合成[6-7]都具有重要意義。

二硫鍵的定位方法主要包括X射線衍射晶體法[8-9]、核磁共振波譜法[8,10]、Edman降解法、質(zhì)譜法等。X射線衍射晶體法利用蛋白質(zhì)晶體衍射圖中的二硫鍵間連續(xù)的電子密度情況，實現(xiàn)蛋白質(zhì)中的二硫鍵定位[8]；核磁共振波譜法依據(jù)形成二硫鍵的2個半胱氨酸間的Hα和Hβ在空間上因二硫鍵的存在而產(chǎn)生奧弗豪塞爾核效應(yīng)(nuclear overhauser effect, NOE)。上述兩種方法可在分子水平上提供二硫鍵的信息，但要求樣品量很大，純度很高。另外，X射線衍射晶體法還需依賴于高度有序的蛋白結(jié)晶。Edman降解法無法直接對含有鏈內(nèi)二硫鍵和N端被封閉的多肽和蛋白質(zhì)進(jìn)行測序。

質(zhì)譜法相對簡單，對二硫鍵組成簡單的小肽或蛋白質(zhì)，如多肽序列中含有4個半胱氨酸且相鄰半胱氨酸以鄰接的形式兩兩形成二硫鍵的情況，可采用質(zhì)譜法在保留完整二硫鍵的情況下直接分析，利用串聯(lián)質(zhì)譜的碰撞誘導(dǎo)解離(CID)模式在保留二硫鍵的情況下斷裂肽骨架，通過識別特征碎片，對產(chǎn)物離子進(jìn)行分析歸屬，實現(xiàn)二硫鍵的定位。但對于二硫鍵組成更復(fù)雜的多肽或蛋白質(zhì)(如半胱氨酸結(jié)Cys knots等)，大多數(shù)質(zhì)譜法采用斷裂二硫鍵的方式實現(xiàn)定位。根據(jù)這些方法中斷裂二硫鍵時所處的介質(zhì)可分為溶液中斷裂和氣相中斷裂兩類。在溶液斷裂過程中，主要通過“濕”化學(xué)反應(yīng)手段進(jìn)行斷裂，如基于化學(xué)試劑的氧化/還原反應(yīng)斷裂和基于電極反應(yīng)的電化學(xué)還原斷裂等，質(zhì)譜在這類斷裂定位方式中通常作為檢測終端；而氣相斷裂則包括基于分子間碰撞的斷裂、基于獲得電子的斷裂、基于吸收光子的光催化斷裂和基于離子-離子反應(yīng)的氧化斷裂等，質(zhì)譜在這類斷裂定位方式中通常既作為斷裂二硫鍵的手段和“容器”，也作為檢測定位的終端。本文將根據(jù)上述不同斷裂機(jī)理的分類方式和對基于質(zhì)譜技術(shù)二硫鍵的分析方法進(jìn)行綜述。

1 液相中斷裂

1.1 基于化學(xué)試劑的還原反應(yīng)斷裂定位方法

基于化學(xué)試劑的還原是指通過化學(xué)試劑還原二硫鍵，主要涉及反應(yīng)條件、還原劑以及還原后產(chǎn)生的自由巰基封端試劑的選擇等問題。首先，堿性或中性條件下，還原反應(yīng)產(chǎn)生的自由巰基易與原生二硫鍵發(fā)生交換反應(yīng)形成非原生二硫鍵和自由巰基，導(dǎo)致二硫鍵錯配，這類副反應(yīng)稱為二硫鍵交換反應(yīng)，示于圖1。在堿性或中性條件下，R1SH和R3SH以硫醇陰離子形式存在，當(dāng)離去基團(tuán)R3S-的pKa值比R1S-低時，會發(fā)生交換反應(yīng)；當(dāng)R3S-的pH值低于pKa值時，巰基-二硫鍵的交換率則隨pH值降低而降低。因此，溶液pH值對巰基與二硫鍵交換的副反應(yīng)影響較大。在堿性或中性條件下，含有自由巰基的半胱氨酸易形成巰基陰離子，從而發(fā)生二硫鍵交換，所以還原反應(yīng)需在酸性條件下進(jìn)行。傳統(tǒng)的生化還原試劑(如β-巰基乙醇和二硫蘇糖醇(DTT))能有效地還原二硫鍵，但不能在酸性條件下進(jìn)行。這是因為β-巰基乙醇和二硫蘇糖醇分子內(nèi)含有自由巰基，依據(jù)巰基與二硫鍵間的交換反應(yīng)機(jī)理，還原劑分子中的自由巰基與樣品中的二硫鍵發(fā)生交換反應(yīng)，使樣品分子中的二硫鍵斷裂而被還原，而酸性條件會抑制這類反應(yīng)的發(fā)生，因此這2種還原劑只能在堿性或中性條件下使用。由于DTT一般用于二硫鍵完全還原的實驗，無需獲得二硫鍵成鍵模式，無需考慮二硫鍵的交換反應(yīng)，因此，DTT在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中應(yīng)用較多。三(2-羧乙基)膦(TCEP)[6,11]對二硫鍵還原反應(yīng)活性強(qiáng)，而且?guī)缀鯖]有副反應(yīng)。與其他還原劑相比，TCEP[3,6]和其他生化試劑有更好的兼容性，并且能在更寬的pH值范圍(包括酸性條件)下使用，從而減少二硫鍵交換的發(fā)生。雖然TCEP不易揮發(fā)，但由于進(jìn)行二硫鍵還原所需的濃度較低，不影響后續(xù)的質(zhì)譜分析。有研究采用TCEP作為還原劑，實現(xiàn)了降鈣素、加壓素等多肽藥物中結(jié)構(gòu)類似物雜質(zhì)的分析[12-13]。

圖1 巰基-二硫鍵交換反應(yīng)機(jī)理Fig.1 Mechanism of thiol-disulfide bond exchange reaction

由于還原反應(yīng)產(chǎn)生的自由巰基易與二硫鍵發(fā)生交換反應(yīng)，所以要迅速用封端試劑對自由巰基進(jìn)行修飾。這樣既可以保護(hù)部分還原中間體，防止上述副反應(yīng)的發(fā)生，又可作為衍生化標(biāo)記物，以確定多肽中半胱氨酸的存在形式。目前通常采用烷基化試劑或氰基化試劑，通過親核取代反應(yīng)產(chǎn)生巰基修飾產(chǎn)物而實現(xiàn)封端。在封端反應(yīng)后會伴隨二級質(zhì)譜碎裂，根據(jù)產(chǎn)生的子離子來推斷修飾產(chǎn)物的位置，進(jìn)而推斷二硫鍵的位置。

對于烷基化封端，常用的烷基化試劑[3,14]有碘乙酸(IAA)、碘代乙酰胺(IAM)和N-乙基馬來酰亞胺(NEM)。研究表明[15]，NEM與IAM、IAA相比，反應(yīng)更快、單位摩爾自由巰基所需的試劑更少，并且在酸性條件下(pH 4.3～7.0)非常有效，更適合用作蛋白質(zhì)巰基的烷化劑。基于烷基化封端的常用定位方法主要可分為輪廓比較法和部分還原法。輪廓比較法通過對2份蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行酶切，將其中1份酶切產(chǎn)物加入還原劑進(jìn)行還原(通常是完全還原)，再對未還原的和已還原的樣品分別進(jìn)行高效液相色譜(常用紫外檢測器)分離，對比總離子流圖(TIC)，尋找含二硫鍵的肽段，當(dāng)還原后總離子流圖上的色譜峰消失，即該色譜峰所代表的肽段含有二硫鍵，隨后對其進(jìn)行烷基化封端和MS/MS分析，即可定位肽段中的二硫鍵[3,5]。這種方法可簡單直觀地確定含二硫鍵的肽段，但存在樣品處理和實驗步驟較繁瑣，樣品需要量較大等問題。部分還原法是部分還原蛋白質(zhì)或多肽中的二硫鍵并烷基化，獲得不同還原程度的產(chǎn)物，隨后用質(zhì)譜法分析定位二硫鍵。Klapoetke等[16]使用蛋白質(zhì)水平上的部分還原法，完成了對人類因子Xa中12個二硫鍵的定位。

與二硫鍵的還原-烷基化方法不同，氰基化試劑在堿性條件下會發(fā)生獨特的自發(fā)性化學(xué)裂解反應(yīng)，這一現(xiàn)象可以代替二級質(zhì)譜碎裂進(jìn)行定位，以此發(fā)展了基于氰基化裂解的二硫鍵定位方法。早在1996年，Wu等[17]利用2-硝基-5-硫氰苯甲酸(NTCB)在不破壞分子中二硫鍵的條件下選擇性地氰基化游離巰基，然后在堿性條件下，被化學(xué)修飾的半胱氨酸殘基的N端肽鍵斷裂，形成一個氨基端肽以及系列2-亞氨基噻唑-4-羧肽(ITC)，再經(jīng)還原劑TCEP還原后進(jìn)行MALDI-TOF/TOF分析。實驗成功地確定了木瓜蛋白酶、卵白蛋白等蛋白中含有自由巰基的半胱氨酸和形成二硫鍵的半胱氨酸的數(shù)目和位置。該方法的優(yōu)勢在于可以確定蛋白質(zhì)分子內(nèi)含自由巰基的半胱氨酸的數(shù)目和位置。因為分子內(nèi)的自由巰基會與還原生成的巰基結(jié)合產(chǎn)生非原生二硫鍵，對二硫鍵的定位造成干擾。使用NTCB的氰基化方法可在不破壞蛋白質(zhì)分子中二硫鍵的條件下，將自由巰基特異性封閉，有助于后續(xù)的二硫鍵定位分析。但由于NTCB氰基化反應(yīng)以及后續(xù)的化學(xué)裂解反應(yīng)是在堿性條件下進(jìn)行，容易發(fā)生二硫鍵的交換重排，從而干擾正確的二硫鍵定位識別。并且，堿性環(huán)境雖有利于自由巰基作為親核試劑進(jìn)攻NTCB的氰酸酯基團(tuán)產(chǎn)生氰基化產(chǎn)物，但也提高了β-消除副反應(yīng)發(fā)生的概率。β-消除反應(yīng)和化學(xué)裂解是競爭反應(yīng)，會導(dǎo)致裂解碎片減少，關(guān)鍵碎片丟失。因此，Wu等[18]將氰基化試劑改為1-氰基-4-二甲基氨基-吡啶四氟硼酸鹽(CDAP)，其可在酸性緩沖液中進(jìn)行衍生反應(yīng)，減少二硫鍵交換反應(yīng)和β-消除反應(yīng)的發(fā)生。通過優(yōu)化氰基化條件、增強(qiáng)斷裂產(chǎn)物檢測，該方法逐漸完善[18-19]，更加簡單、高效、靈敏，尤其適用于含緊密間隔或相鄰半胱氨酸的蛋白質(zhì)檢測[6,14]。為提高對含有超過4個二硫鍵蛋白質(zhì)的數(shù)據(jù)處理能力，Qi等[20]開發(fā)了“負(fù)標(biāo)志質(zhì)量算法”，通過輸入氨基酸序列和質(zhì)譜數(shù)據(jù)消除理論上可能存在的不合理配對方式，從而構(gòu)建一種最合理的二硫鍵配對方式。

基于化學(xué)試劑的還原反應(yīng)斷裂定位分析方法是最常用的，適合分析含有相鄰半胱氨酸、復(fù)雜二硫鍵連接方式的多肽，如半胱氨酸結(jié)(Cys knots)或半胱氨酸之間無合適酶解位點的多肽。對于二硫鍵數(shù)量較少的多肽，該方法具有準(zhǔn)確可靠、分析直觀方便等優(yōu)點，但存在反應(yīng)步驟相對繁瑣，分析時間較長等問題。

1.2 基于化學(xué)試劑的氧化反應(yīng)斷裂定位方法

硫的多價態(tài)決定了二硫鍵既可以被還原，也可以被氧化，相對于二硫鍵還原，其更易被氧化。通常采用過甲酸氧化斷裂二硫鍵[21]，過甲酸可使二硫鍵斷裂，并進(jìn)一步將半胱氨酸中的硫醇基團(tuán)氧化成磺酸基(—SO3H)。該反應(yīng)使半胱氨酸殘基發(fā)生48 u的質(zhì)量位移，在氧化斷裂二硫鍵的同時，完成了對半胱氨酸標(biāo)記衍生化，為后續(xù)的質(zhì)譜檢測定位二硫鍵提供了理論依據(jù)。相比于傳統(tǒng)的還原-烷基化方法，二硫鍵的氧化具有高效、可顯著增加序列覆蓋率等優(yōu)勢[14]。Willams等[22]在過甲酸蒸氣中氧化完整牛胰島素和牛核糖核酸酶，并利用MALDI靶向分析實現(xiàn)二硫鍵定位。

1.3 基于電極反應(yīng)的電化學(xué)還原斷裂

除了使用化學(xué)試劑還原二硫鍵之外，電化學(xué)中的電極反應(yīng)也可以提供還原反應(yīng)所需的電子與氫離子，因此可用于定位二硫鍵。Cramer等[23]直接使用電化學(xué)部分還原人胰島素和溶菌酶，隨后進(jìn)行MS/MS(CID模式)分析，成功實現(xiàn)了分子中的二硫鍵定位，同時確定了蛋白質(zhì)的序列覆蓋率。此外，還建立了LC-EC-MS平臺進(jìn)行在線電化學(xué)還原蛋白酶切產(chǎn)物，有利于表征含復(fù)雜二硫鍵的蛋白質(zhì)。相比于傳統(tǒng)的柱前還原法，該方法可節(jié)省樣品處理時間，但還原條件有待優(yōu)化。

為提高二硫鍵的還原效率，本課題組研制了一種成本低廉的新型電極材料——鉛[24]。鉛電極具有較高析氫電位、免維護(hù)(只需拋光)、操作簡便、可重復(fù)使用等優(yōu)勢。通過對溶劑配比、流速、電壓的優(yōu)化，鉛電極可使奧曲肽的在線還原效率達(dá)到82%。利用該方法實現(xiàn)了網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)蜂毒明肽和重組人生長激素中2對二硫鍵的定位。

1.4 柱后還原

柱后還原對二硫鍵定位分析的實驗步驟與上述幾種方法存在明顯差異。一般來說，前幾種方法的定位步驟是先將樣品水解，對含二硫鍵的肽段進(jìn)行還原后封端衍生化，隨后進(jìn)入LC-MS/MS分析。而柱后還原是將蛋白樣品酶切后，直接進(jìn)入液相色譜柱分離后再還原，隨后進(jìn)行質(zhì)譜分析，即還原反應(yīng)在LC與MS之間進(jìn)行。這種方法可以簡化定位二硫鍵的分析流程，通過具有相同保留時間的含二硫鍵的肽即可進(jìn)行確認(rèn)。

柱后化學(xué)還原法中，在液相色譜分離后僅發(fā)生二硫鍵的部分還原，未還原二硫鍵連接的肽和還原產(chǎn)物具有相同的保留時間，并且均能在質(zhì)譜全掃描模式下被檢測。比較所有含Cys的肽段提取離子流圖(EIC)，同一二硫鍵所鍵連的肽段在EIC圖上具有相同的保留時間[25-26]，據(jù)此可快速確定二硫鍵的配對方式。Liu等[27]加入DTT進(jìn)行在線柱后還原，實現(xiàn)了IgG2的二硫鍵定位。

2 氣相中斷裂

2.1 基于分子間碰撞的斷裂

基于分子間碰撞導(dǎo)致二硫鍵斷裂的質(zhì)譜碎裂方式主要有碰撞誘導(dǎo)解離(CID)和高能碰撞解離(HCD)，二者都屬于“慢熱技術(shù)”。基于振動激發(fā)模型，通過碰撞或高能碰撞吸收能量，發(fā)生分子內(nèi)振動能量重新分布，經(jīng)歷多態(tài)過程發(fā)生斷裂解離。

碰撞誘導(dǎo)解離是一種經(jīng)歷多態(tài)的過程，當(dāng)分子內(nèi)能在各自由度重新分布之后發(fā)生解離。在碰撞池或離子阱中，母離子和惰性氣體(如He、N2等)發(fā)生中性碰撞使振動能量活化，從而斷裂化學(xué)鍵。這種通過振動激發(fā)導(dǎo)致鍵斷裂的方式，一般優(yōu)先引起蛋白質(zhì)或肽骨架斷裂，而不會導(dǎo)致二硫鍵斷裂。在正、負(fù)離子模式下，碰撞能較大或富含精氨酸的多肽的CID譜圖中可以觀察到由二硫鍵斷裂產(chǎn)生的離子，如S—S或C—S鍵斷裂產(chǎn)生的含半胱氨酸殘基、半胱氨酸硫代醛(-2 u)、半胱氨酸二硫化物(+32 u)或脫氫丙氨酸(-34 u)的b/y離子[5,28]。對于二硫鍵成鍵模式較簡單的、分子質(zhì)量較小的肽，尤其是其氨基酸序列中含有近鄰的脯氨酸難以產(chǎn)生c/z離子，也可使用CID來定位二硫鍵[29]。此外，引入金離子可促進(jìn)二硫鍵在CID中的斷裂，進(jìn)而產(chǎn)生更豐富的序列信息[30]。向多肽溶液中加入甲醇，在紫外光照射下甲醇與二硫鍵反應(yīng)產(chǎn)生甲氧基加合物特征離子，隨后采用CID碎裂，也可實現(xiàn)二硫鍵的定位[31]。

高能碰撞解離(HCD)也可用于表征二硫鍵[32]，其碎裂方式與CID相似，會產(chǎn)生b/y離子，并且可以使二硫鍵斷裂產(chǎn)生系列特征離子，提供定位二硫鍵的有效信息。董夢秋等[32]利用HCD碎裂二硫鍵產(chǎn)生的特征離子，通過pLink-SS軟件分析了HCD的肽譜圖，精確定位了單克隆抗體IgG2b和10個標(biāo)準(zhǔn)蛋白中的所有二硫鍵。

2.2 基于獲得電子的斷裂

基于獲得電子導(dǎo)致二硫鍵斷裂的質(zhì)譜碎裂方式主要有電子捕獲解離(ECD)和電子轉(zhuǎn)移解離(ETD)，這兩種方式為非遍歷性過程，即斷裂發(fā)生在分子內(nèi)能在各自由度的重新分布之前。

ECD是由多電荷多肽正離子與低能電子發(fā)生反應(yīng)產(chǎn)生奇電子多肽正離子，隨后在飛秒內(nèi)進(jìn)行重排和碎裂產(chǎn)生c和z離子。ETD是ECD進(jìn)一步的發(fā)展，是由電子親和力足夠低的負(fù)離子作為電子供體，通過將電子轉(zhuǎn)移給多肽離子從而觸發(fā)氫自由基的釋放。釋放的氫自由基可以結(jié)合到多肽骨架的羧基基團(tuán)，導(dǎo)致肽鏈N-Cα鍵發(fā)生斷裂產(chǎn)生c和z離子。對于二硫鍵分析，在ECD和ETD中會同時發(fā)生二硫鍵和多肽骨架的斷裂，其中二硫鍵斷裂為主要裂解途徑，這是因為二硫鍵對氫自由基的親和能較大，在含二硫鍵的多肽中，氫自由基會優(yōu)先加成在二硫鍵上，使二硫鍵還原斷裂，其次引起骨架斷裂[33]?；谶@一特點，ECD和ETD不僅可得到豐富的序列信息，也可提供二硫鍵斷裂信息以實現(xiàn)二硫鍵定位。Clark等[34]將含有半胱氨酸肽段的提取離子色譜圖與ETD結(jié)合，實現(xiàn)了重組HIV包膜蛋白gp120中的二硫鍵定位。Massonnet等[35]將離子淌度與CID結(jié)合，表征ETD斷裂后的產(chǎn)物，實現(xiàn)了多肽中2個二硫鍵的定位。

此外，基于ETD和HCD綜合技術(shù)的電子轉(zhuǎn)移高能碰撞解離(EThcD)在表征二硫鍵領(lǐng)域取得了一些進(jìn)展[36]。作為新興的雙重質(zhì)譜碎裂技術(shù)，EThcD先進(jìn)行ETD使多肽離子中的二硫鍵斷裂并產(chǎn)生c/z離子，然后將所得離子進(jìn)行HCD，從而獲得b/y和c/z離子的混合物。EThcD技術(shù)可以通過支持ETD技術(shù)的LTQ線性離子阱串聯(lián)軌道阱質(zhì)譜儀實現(xiàn)，其所產(chǎn)生的離子結(jié)合了ETD和CID中的碎片離子，比ETD效果好[5]。Liu等[36]通過胃蛋白酶酶切結(jié)合SlinkS搜索引擎，可直接鑒定EThcD斷裂產(chǎn)物，含二硫鍵的多肽在EThcD裂解中優(yōu)先斷裂S—S鍵，隨后誘導(dǎo)肽骨架斷裂。SlinkS通過將EThcD產(chǎn)物離子與線性肽數(shù)據(jù)庫比對，提供二硫鍵斷裂產(chǎn)生的肽段的精確單同位素質(zhì)量和序列，從而實現(xiàn)二硫鍵分析。

有報道表明[37]，在負(fù)離子模式下，基于電子脫離機(jī)理的電子脫離解離(EDD)技術(shù)分析含二硫鍵的肽時，優(yōu)先斷裂C—S和S—S鍵，是一種二硫鍵定位新方法。在EDD中，前體離子被大于10 eV的電子輻照，導(dǎo)致電子脫離并碎裂。

2.3 基于吸收光子的光催化斷裂

基于吸收光子能量導(dǎo)致二硫鍵斷裂的質(zhì)譜碎裂方式主要有基質(zhì)輔助激光解吸電離源內(nèi)衰變(MALDI-ISD)、紫外光解離(UVPD)，需要指出的是，MALDI-ISD導(dǎo)致的二硫鍵斷裂實際發(fā)生在固相基質(zhì)結(jié)晶處。

MALDI-ISD具有樣品用量少、檢測快速、耐較高濃度緩沖液和鹽等雜質(zhì)的優(yōu)點[6]，對定位二硫鍵具有非常大的應(yīng)用價值。MALDI-ISD在激光照射后幾百納秒內(nèi)發(fā)生，其發(fā)生過程受激光能量密度和基質(zhì)的影響[14,38]。MALDI-ISD可由氧化性基質(zhì)和還原性基質(zhì)引發(fā)，但通常用于二硫鍵定位的為還原性基質(zhì)，因為氧化性基質(zhì)在正離子模式下一般不會引起二硫鍵的斷裂。當(dāng)采用還原性基質(zhì)時，由基質(zhì)向肽段轉(zhuǎn)移氫自由基引發(fā)[38-40]，類似ECD/ETD中的熱氫自由基附著機(jī)理，氫自由基結(jié)合到多肽骨架的羰基基團(tuán)，導(dǎo)致肽鏈N—Cα鍵發(fā)生斷裂，產(chǎn)生c和z離子。此過程發(fā)生在基質(zhì)結(jié)晶處，為整個ISD的速控步[41]。在含二硫鍵的多肽和蛋白質(zhì)的ISD譜圖中，可以發(fā)現(xiàn)二硫鍵還原的產(chǎn)物離子，這是由于二硫鍵對氫自由基的親和能較大，氫自由基會優(yōu)先加在二硫鍵上，發(fā)生二硫鍵的還原斷裂，其次引起骨架斷裂[40-41]。同時，在MALDI氣相卷流中，會產(chǎn)生基質(zhì)與還原肽段的加合物離子峰[42-43]，且信號較強(qiáng)?；诠羌軘嗔押投蜴I還原產(chǎn)生的特征離子(包括加合物離子)，MALDI-ISD在二硫鍵的定位表征中發(fā)揮著重要作用?；|(zhì)對MALDI-ISD還原影響顯著，有研究表明[44]，常用基質(zhì)的供氫能力順序為：1,5-二氨基萘(1,5-DAN)>5-氨基水楊酸(5-ASA)>2,5-二羥基苯甲酸(2,5-DHB)>水楊酸(SA)≈α-氰基-4-羥基肉桂酸(CHCA)。

為避免有機(jī)基質(zhì)對譜圖的干擾，可以使用還原性無機(jī)基質(zhì)還原二硫鍵。Qiao等[45]采用TiO2修飾的不銹鋼靶板，以葡萄糖作為空穴清除劑和質(zhì)子供體，在激光解吸電離過程中發(fā)生光催化反應(yīng)，實現(xiàn)了二硫鍵的源內(nèi)還原。在激光作用下，納米TiO2顆粒吸收光子使價帶的電子受激躍遷至導(dǎo)帶而產(chǎn)生電子-空穴對。葡萄糖提供質(zhì)子，二硫鍵捕獲被激發(fā)到導(dǎo)帶的電子和葡萄糖氧化產(chǎn)生的質(zhì)子被還原。由于TiO2層與樣品的共晶是分離的，使樣品不能獲得較好的分散，因此該方法的分辨率有待提高。雖然該體系目前應(yīng)用較少，但隨著新基質(zhì)材料的開發(fā)，將有助于二硫鍵分析甚至蛋白質(zhì)組學(xué)研究。

近年來，發(fā)展了一種光致斷裂二硫鍵的新方式，即紫外光解離(UVPD)[46]。通過選擇適當(dāng)激光波長使樣品本身含有的官能團(tuán)或化學(xué)鍵吸收相應(yīng)波數(shù)的激光能量，使得樣品分子躍遷到激發(fā)態(tài)，并發(fā)生不同特定斷裂途徑的解離。該方式需要一種能夠使來自激光束或高強(qiáng)度光源的光子束與所選離子交叉的裝置，一般需要光源和可以裝載所選離子的“容器”2個要素。光源一般采用Nd：YAG激光器、準(zhǔn)分子(excimer)和光學(xué)參量振蕩器(OPO)：YAG激光器[46]；選擇質(zhì)譜的質(zhì)量分析器(如傅里葉變換離子回旋共振、三維四極離子阱、二維線性離子阱)就可以滿足裝載所選離子的“容器”。使用UVPD分析多肽或蛋白質(zhì)時，可產(chǎn)生a/x、b/y、c/z系列離子，同時可直接斷裂S—S和C—S鍵。這不僅有利于增加序列覆蓋率，而且可以實現(xiàn)二硫鍵定位。Agarwal等[47]首次將UVPD應(yīng)用于生物大分子分析，蛋白質(zhì)酶切產(chǎn)物經(jīng)HPLC分離后進(jìn)入MS，采用4次諧波激光脈沖(266 nm)照射線性離子阱中多肽離子，發(fā)現(xiàn)UVPD可在保留磷酸化修飾的同時，選擇性地僅斷裂酶切產(chǎn)物中的二硫鍵。Montana等[48]利用193 nm的UVPD表征了溶菌酶中的4個二硫鍵和血清轉(zhuǎn)鐵蛋白中的19個二硫鍵。另外，UVPD也可通過電噴霧離子源實現(xiàn)，即采用ESI電噴霧離子化時，使用低壓汞燈(LP-Hg lamp)產(chǎn)生紫外光，對噴霧進(jìn)行照射。這里的紫外光照射發(fā)生在離子源中而非質(zhì)量分析器。Durand等[31]在多肽溶液中加入甲醇，通過此方法，在低壓汞燈產(chǎn)生254 nm紫外光照射激發(fā)下，二硫鍵因甲醇的親核進(jìn)攻發(fā)生選擇性斷裂。在其中一個半胱氨酸殘基上形成亞磺酸甲酯(—SOCH3)標(biāo)記，在另一個半胱氨酸殘基上形成硫醇(—SH)。

紅外多光子解離(IRMPD)也是一種潛在的二硫鍵分析手段，同樣屬于“慢熱技術(shù)”?；谡駝蛹ぐl(fā)模型，通過紅外光照射被分析物(如離子化的多肽等)，多肽中的肽鍵、二硫鍵等化學(xué)鍵吸收多個紅外光子的能量發(fā)生分子內(nèi)振動，能量重新分布，經(jīng)歷多態(tài)過程后發(fā)生斷裂解離，產(chǎn)生類似CID的b/y系列離子。但I(xiàn)RMPD并沒有CID的低質(zhì)量端質(zhì)量截止效應(yīng)，因此可產(chǎn)生較豐富的序列信息。Kalli等[37]對含有3個二硫鍵的胰島素進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)IRMPD可特異性斷裂肽陰離子中的S—S和C—S鍵。

不同質(zhì)譜碎裂技術(shù)斷裂二硫鍵產(chǎn)生的特征離子列于表1。

表1 不同質(zhì)譜碎裂技術(shù)斷裂二硫鍵產(chǎn)生的特征離子Table 1 Characteristic ions produced by different mass spectrometry fragmentation techniques by breaking disulfide bonds

2.4 基于離子-離子反應(yīng)的氧化斷裂

氣相離子/離子反應(yīng)也可以被用于二硫鍵的定位分析[49]。本課題組采用自主研發(fā)的離子/離子反應(yīng)裝置，利用高碘酸根負(fù)離子與多肽正離子的氣相反應(yīng)，實現(xiàn)了分子內(nèi)和分子間二硫鍵的氧化斷裂及定位分析[50]。

3 挑戰(zhàn)與展望

本文總結(jié)了基于質(zhì)譜技術(shù)對蛋白質(zhì)中二硫鍵的分析方法，根據(jù)斷裂二硫鍵所處介質(zhì)和斷裂機(jī)理進(jìn)行定位方法的綜述。對于定位二硫鍵研究領(lǐng)域，仍然存在諸多挑戰(zhàn)：對含多個二硫鍵的短肽，很難準(zhǔn)確測量二硫鍵的配對方式。例如，對于含有4個二硫鍵，8個半胱氨酸的鐵調(diào)素，其理論所產(chǎn)生的可能二硫鍵配對方式多達(dá)105種[51]。此外，即使對僅含2個二硫鍵的多肽，但二硫鍵成鍵順序的不同，也將影響多肽的空間結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響其功能。對二硫鍵成鍵順序的研究是該領(lǐng)域面臨的另一重要挑戰(zhàn)。另外，UVPD和離子-離子反應(yīng)質(zhì)譜儀等仍處于實驗室方法開發(fā)階段，有待進(jìn)一步完善，尚不能廣泛服務(wù)于制藥、蛋白質(zhì)組學(xué)等領(lǐng)域。在方法學(xué)研究方面，未來發(fā)展方向?qū)⒁再|(zhì)譜結(jié)合強(qiáng)大的數(shù)據(jù)處理工具進(jìn)行“自上而下”的分析策略為主流。同時，“自下而上”的分析策略中，隨著新的電離方式和碎裂方式的開發(fā)，可能出現(xiàn)新的特征離子以及相應(yīng)的數(shù)據(jù)處理工具，必將對這一領(lǐng)域產(chǎn)生重要影響。