鄭 偉，康連和，劉鵬斌，特日格勒，李子健，李星云，王莉梅，張園園，劉秀麗，史 培，喬健敏

（1.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031；2.阿拉善盟農(nóng)畜產(chǎn)品質(zhì)量綜合檢驗(yàn)檢測(cè)中心，內(nèi)蒙古 阿拉善左旗 750300）

牛乳是居民日常飲食中重要的組成部分，是人體優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)來(lái)源之一，具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。酪蛋白和乳清蛋白是牛乳中的主要蛋白質(zhì)。牛乳相關(guān)乳制品由于具有令人愉悅的口感和極高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值而受到大眾的喜愛(ài)［1］。利用乳酸菌發(fā)酵的乳制品還能改善牛乳可能導(dǎo)致人體出現(xiàn)乳糖不耐癥的缺點(diǎn)［2］。發(fā)酵乳制品由微生物發(fā)酵制得，產(chǎn)品有Kefir、馬奶酒、奶酪和奶皮子等，相關(guān)乳制品中的微生物環(huán)境被廣泛研究［3］。

內(nèi)蒙古錫林郭勒盟擁有豐富的自然資源，是優(yōu)質(zhì)奶源生產(chǎn)基地，該地區(qū)的傳統(tǒng)乳制品及發(fā)酵乳制品具有獨(dú)特的風(fēng)味和極高的品質(zhì)［4］，其中，奶酪是最常見(jiàn)的發(fā)酵乳制品之一。乳清是一種在奶酪生產(chǎn)過(guò)程中剩下的稀薄乳液［5-6］，富含乳糖、乳酸、乳清蛋白、多種水溶性維生素和礦物質(zhì)［7］，其營(yíng)養(yǎng)成分占牛乳總營(yíng)養(yǎng)成分的55%左右，具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和一定的功能特性［8-10］。按照生產(chǎn)工藝的不同，乳清可以分為甜乳清、酸乳清和含鹽乳清［11］。內(nèi)蒙古自治區(qū)生產(chǎn)的乳清多為牛乳經(jīng)自然發(fā)酵，通過(guò)酸化作用凝固成奶酪時(shí)所產(chǎn)生的酸乳清，其pH 值在4.6 左右。實(shí)踐證明，每生產(chǎn)1 kg 干酪，有9～12 kg 乳清排出。2019 年，內(nèi)蒙古自治區(qū)加工奶酪近7 000 t，占全國(guó)自產(chǎn)干奶酪類(lèi)產(chǎn)量7成以上［12］，約有上萬(wàn)噸乳清需要處理。而目前加工奶酪產(chǎn)生的酸乳清絕大部分作為廢棄物被直接排放或被污水處理廠處理，未體現(xiàn)出其加工利用價(jià)值以及經(jīng)濟(jì)價(jià)值。乳清利用率低的主要原因是其具有的特殊風(fēng)味不受大眾喜愛(ài)。對(duì)酸乳清中微生物資源的研究是進(jìn)一步探索發(fā)酵菌株對(duì)酸乳清風(fēng)味影響的基礎(chǔ)，有利于從微生物的角度優(yōu)化、改良酸乳清的風(fēng)味和口感［13-17］。

該研究對(duì)內(nèi)蒙古錫林郭勒盟傳統(tǒng)奶酪加工過(guò)程中產(chǎn)生的酸乳清進(jìn)行酵母菌的分離純化培養(yǎng)，通過(guò)ITS 基因序列分析方法對(duì)分離出的酵母菌進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，并通過(guò)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)研究菌株的親緣關(guān)系，以期為酸乳清中微生物多樣性的研究以及酸乳清的綜合利用和產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 樣品來(lái)源

2 份酸乳清樣品采集自內(nèi)蒙古錫林郭勒盟，為牧民用自然發(fā)酵方式制得。用無(wú)菌移液槍吸取酸乳清樣品5 mL，移入無(wú)酶無(wú)菌的采樣管中并編號(hào)。冷藏保存并盡快運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.1.2 主要試劑與儀器

麥芽汁固體培養(yǎng)基和麥芽汁液體培養(yǎng)基均購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；酵母菌基因組DNA 提取試劑盒（DP307）為天根生化科技（北京）有限公司產(chǎn)品；Taq PCR Master Mix 和擴(kuò)增引物等PCR 試劑由生工生物工程（上海）股份有限公司提供。Applied Biosystems 基因擴(kuò)增儀、凝膠成像分析系統(tǒng)為Bio-rad 公司產(chǎn)品；NanoDropTMOne 微量紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)為T(mén)hermoFisher Scientific 公司產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 酸乳清樣品中酵母菌的分離純化及保存

使用麥芽汁固體培養(yǎng)基進(jìn)行樣品中酵母菌的分離純化。吸取1 mL 酸乳清樣品用無(wú)菌生理鹽水梯度稀釋至合適稀釋度后傾注于麥芽汁固體培養(yǎng)基平板，倒置于恒溫培養(yǎng)箱中30 ℃培養(yǎng)24～48 h后，觀察、選取不同形態(tài)的菌落。將選取的菌落接種于麥芽汁液體培養(yǎng)基，30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h，通過(guò)美藍(lán)染色和鏡檢的方法檢驗(yàn)挑取菌落的純度，通過(guò)反復(fù)劃線純化的方法得到純菌株。菌株保存方法為菌液經(jīng)離心后去掉上清液，得到的菌泥經(jīng)無(wú)菌生理鹽水清洗3 次后，與20%的滅菌甘油按一定比例混勻，封口、編號(hào)，于-80 ℃保存［18-19］。

1.2.2 酵母菌的分子生物學(xué)鑒定

1.2.2.1 酵母菌基因組DNA 的提取和質(zhì)量檢驗(yàn)

使用酵母菌基因組DNA 提取試劑盒提取菌株基因組DNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)提取到的基因組DNA 片段大小進(jìn)行檢測(cè)，使用微量紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)對(duì)DNA 的濃度和純度進(jìn)行檢測(cè)，選取合格的基因組DNA 用于后續(xù)研究［18］。

1.2.2.2 目的基因的PCR 擴(kuò)增

對(duì)rDNA 編碼的ITS 基因序列進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，引物序列為ITS 基因序列通用引物ITS1（5＇-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3＇）和ITS2（5＇-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3＇），目的基因片段預(yù)期擴(kuò)增大小為600 bp。擴(kuò)增體系設(shè)定參考試劑盒說(shuō)明書(shū)，具體為T(mén)aq PCR Master Mix 25 μL，ITS1、ITS2 引物各2 μL，基因組DNA 模板100 ng/μL，超純水補(bǔ)足至50 μL。擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)30 次；72 ℃延伸7 min［20-23］。

1.2.2.3 PCR 產(chǎn)物測(cè)序、同源性比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建

PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行質(zhì)檢，質(zhì)檢合格的PCR 產(chǎn)物送往生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行純化測(cè)序。測(cè)序結(jié)果首先經(jīng)DNAStar 5.0 軟件中的Seqman 模塊進(jìn)行拼接，拼接后的序列與NCBI Blast 數(shù)據(jù)庫(kù)中已知的酵母菌ITS 基因序列進(jìn)行同源性比對(duì)，以確定菌株種屬。使用MEGA 6.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，解析分離鑒定的菌株與參考菌株間的進(jìn)化距離［18］。構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)用到的參考菌株及其N(xiāo)CBI 登錄號(hào)分別為：馬克斯克魯維酵母菌（Kluyveromyces marxianus）CBS 712（NR_111251.1）、發(fā)酵畢赤酵母菌（Pichia fermentans）ATCC 10651（NR_130688.1）、庫(kù)德里阿茲威氏畢赤酵母菌 （Pichia kudriavzevii）ATCC 6258（NR_131315.1）、釀酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）CBS 1171（NR_111007.1）。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品中酵母菌的分離純化

使用麥芽汁固體培養(yǎng)基進(jìn)行酵母菌的分離純化，通過(guò)單一劃線純化的方法，選擇不同菌落形態(tài)、美藍(lán)染色為無(wú)色的菌落進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。從2 份酸乳清樣本中共分離出18 株酵母菌。

2.2 分離菌株的分子生物學(xué)鑒定

使用ITS 基因序列分析方法對(duì)分離菌株進(jìn)行種屬鑒定。提取的分離菌株基因組DNA 濃度和純度經(jīng)檢測(cè)后均滿足后續(xù)試驗(yàn)要求。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果顯示，經(jīng)ITS 基因序列通用引物擴(kuò)增后獲得的PCR 產(chǎn)物在約600 bp 的位置處條帶清晰、明亮，且凝膠上無(wú)彌散和非特異性擴(kuò)增現(xiàn)象出現(xiàn)（見(jiàn)圖1）。

圖1 部分分離菌株ITS 基因PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果

將測(cè)序后分離菌株的ITS 基因序列拼接后，與NCBI Blast 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源性比對(duì)。由表1 可知，18 株菌與參考菌株的同源性均大于95%。經(jīng)鑒定，18 株菌歸屬為酵母菌屬的4 個(gè)種，包括2株釀酒酵母菌 （Saccharomyces cerevisiae）、2 株發(fā)酵畢赤酵母菌 （Pichia fermentans）、2 株庫(kù)德里阿茲威氏畢赤酵母菌 （Pichia kudriavzevii）、12 株馬克斯克魯維酵母菌（Kluyveromyces marxianus）。

表1 分離菌株美藍(lán)染色試驗(yàn)結(jié)果以及ITS 基因序列比對(duì)結(jié)果

將分離菌株的ITS 基因序列通過(guò)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)與參考菌株進(jìn)行比對(duì)，探究分離菌株與參考菌株之間的進(jìn)化關(guān)系，系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)如圖2 所示。SR-7～SR-9、SR-11～SR-14、SR-16～SR-19 以及SR-21 與參考菌株Kluyveromyces marxianus CBS 712 聚為一類(lèi)，說(shuō)明這12 株菌與Kluyveromyces marxianus CBS 712 的 親 緣 關(guān) 系 最 近；SR-10 和SR-24 與Saccharomyces cerevisiae CBS 1171 聚為一類(lèi)，說(shuō)明這2 株菌與Saccharomyces cerevisiae CBS 1171 的 親 緣 關(guān) 系 最 近；SR-15 和SR-20 與Pichia fermentans ATCC 10651 聚為一類(lèi)，說(shuō)明這2株菌與Pichia fermentans ATCC 10651 的親緣關(guān)系最近；SR-22 和SR-23 與Pichia kudriavzevii ATCC 6258 聚為一類(lèi)，說(shuō)明這2 株菌與Pichia kudriavzevii ATCC 6258 的親緣關(guān)系最近。

圖2 基于酵母菌ITS 基因序列的分離菌株系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)結(jié)果與NCBI Blast 比對(duì)結(jié)果表明，可以將分離菌株SR-7、SR-8、SR-9、SR-11、SR-12、SR-13、SR-14、SR-16、SR-17、SR-18、SR-19 及SR-21 鑒定為Kluyveromyces marxianus，SR-10 和SR-24 鑒定為Saccharomyces cerevisiae，SR-15 和SR-20 鑒 定 為Pichia fermentans，SR-22 和SR-23 鑒定為Pichia kudriavzevii。

3 討論

近些年，隨著人民生活水平的提高和對(duì)營(yíng)養(yǎng)健康生活需求的提升，內(nèi)蒙古傳統(tǒng)奶酪的消費(fèi)量和關(guān)注度隨之攀升，關(guān)于傳統(tǒng)奶酪中乳酸菌的研究和報(bào)道也較多。洋洋等［24］在內(nèi)蒙古錫林郭勒盟正藍(lán)旗的奶豆腐中分離出33 株乳酸菌，歸屬為6個(gè)種，優(yōu)勢(shì)菌種為德氏乳桿菌（Lactobacillus delbrueckii）和乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）。李華等［25］從科爾沁地區(qū)的5 份奶豆腐樣品中分離出12 株乳酸菌，其中，優(yōu)勢(shì)菌群為乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）和植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）。袁曉霞等［26］在對(duì)內(nèi)蒙古地區(qū)奶豆腐的研究中報(bào)道，屎腸球菌（Enterococcus faecium）和副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）分別為奶豆腐中的第一、第二優(yōu)勢(shì)菌種。張春林等［27］報(bào)道了新疆塔城地區(qū)和內(nèi)蒙古錫林郭勒盟奶豆腐中的優(yōu)勢(shì)菌屬是乳球菌屬 （Lactococcus）、乳桿菌屬（Lactobacillus）和鏈球菌屬（Streptococcus）。

酸乳清作為傳統(tǒng)奶酪的副產(chǎn)物，其產(chǎn)量很大，但是鮮有酸乳清中微生物多樣性研究的報(bào)道，關(guān)于酸乳清中酵母菌的相關(guān)研究報(bào)道更是少之又少。該研究以采集自內(nèi)蒙古錫林郭勒盟的2 份酸乳清樣本為研究對(duì)象，進(jìn)行了樣本中酵母菌的分離鑒定，共分離到18 株酵母菌，來(lái)自4 個(gè)種，馬克斯克魯維酵母菌（Kluyveromyces marxianus）是酸乳清中的優(yōu)勢(shì)酵母菌種。滕香旭［28］對(duì)收集自內(nèi)蒙古的奶豆腐、嚼克等共59 份傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品進(jìn)行了真菌的分離鑒定，結(jié)果顯示克魯維酵母菌屬（Kluyveromyces）為樣本中的優(yōu)勢(shì)菌屬，這一結(jié)果與本研究結(jié)果相同。酸乳清作為奶酪加工的副產(chǎn)物，其優(yōu)勢(shì)酵母菌菌群與奶酪中的優(yōu)勢(shì)酵母菌菌群相似。在后續(xù)研究中，可以參考奶酪微生物菌群結(jié)構(gòu)開(kāi)展酸乳清的綜合利用。

據(jù)報(bào)道，酵母菌和乳酸菌混菌發(fā)酵過(guò)程中，酵母菌可以促進(jìn)乳酸菌的生長(zhǎng)，乳酸菌可以促進(jìn)非乳糖利用型單孢釀酒酵母菌的繁殖，但是馬克斯克魯維酵母菌（Kluyveromyces marxianus）的生長(zhǎng)被抑制［29-31］。然而，不同于Starmerella davenportii、異常假絲酵母菌（Candida incommunis）及瑟氏哈薩克斯坦酵母菌（Kazachstania servazzii），馬克斯克魯維酵母菌（Kluyveromyces marxianus）可以發(fā)酵利用乳糖，且產(chǎn)乙醇能力較弱［32］，這可能與該菌在含乳糖的酸乳清中是優(yōu)勢(shì)菌種有關(guān)。進(jìn)一步對(duì)乳酸菌和酵母菌協(xié)同發(fā)酵的機(jī)制進(jìn)行研究，可能是解決酸乳清綜合利用中酸乳清后發(fā)酵產(chǎn)酒精問(wèn)題的途徑之一。

4 結(jié)論

該研究揭示了內(nèi)蒙古錫林郭勒盟牧區(qū)傳統(tǒng)奶酪加工副產(chǎn)物酸乳清中酵母菌的生物多樣性，為酸乳清的綜合利用和產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供了參考。