劉凱強(qiáng)，俞 進(jìn)，段真真，金 敏，李 佳，巴音查汗·蓋力克

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052；2.新疆維吾爾自治區(qū)阿克蘇市動物疫病控制診斷中心，新疆阿克蘇 843000）

蜱是一種常見的專性吸血的體外寄生生物，寄生在宿主的體表能夠引起嚴(yán)重的自然疫源性疾病，攜帶和傳播無漿體、立克次體等多種病原，部分病原具有人畜共患特點，對畜牧業(yè)生產(chǎn)和公共衛(wèi)生安全造成了極大的危害［1-2］。

無漿體病 （anaplasmosis）是由立克次體目（Rickettsiales）無漿體科（Anaplasmataceae）無漿體屬（Ananlasma）成員引起的一類常見的血液性寄生蟲病，該屬病原在脊椎動物的血細(xì)胞內(nèi)廣泛存在，羊比較常見的病原有綿羊無漿體（Ananlasma ovis，A.ovis）和 嗜 吞 噬 細(xì) 胞 無 漿 體（Ananlasma phagocytophilum，A.phagocytophilum）等［3-5］。羊感染無漿體后臨床癥狀為食欲減退、消瘦、高熱、黃疸，嚴(yán)重時可導(dǎo)致感染動物的死亡［6-8］。為了解新疆阿克蘇地區(qū)蜱蟲與羊感染無漿體的情況，筆者在該地區(qū)采集了蜱和羊抗凝血樣品，首先對蜱蟲進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，再利用分子生物學(xué)方法進(jìn)行種類鑒定，同時，使用PCR 方法檢測媒介蜱和羊感染無漿體的情況，以期為該地區(qū)科學(xué)防控?zé)o漿體病提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

在新疆阿克蘇地區(qū)各縣（市）采集羊抗凝血樣品477 份，蜱蟲192 只。

1.2 主要試劑

TIANamp Genomic DNA Kit 血液/細(xì)胞/組織基因組DNA 提取試劑盒，GeneGreen 核酸染料等，購自天根生化科技（北京）有限公司；Agarose、DL 2 000 DNA Marker 等，購自美國Genview 公司；Premix Taq，購自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；25X TAE Premixed Powder，購自生工生物工程（上海）股份有限公司；PBS 磷酸鹽緩沖液（干粉），購自Biosharp 公司。

1.3 主要儀器

冷凍混合球磨儀（型號：MM400），購自德國Retsch 公司；電泳儀、凝膠成像儀、梯度PCR 儀（型號：PowerPac Basic，Gel Doc XR+，C1000 Thermal Cycler），購自美國Bio-Rad 公司；高速冷凍離心機(jī)（型號：FRESCO 21），購自美國賽默飛公司；變焦體視顯微鏡（型號：SZ-51），購自日本OLYMPUS 公司。

1.4 蜱蟲的形態(tài)學(xué)鑒定

參照《新疆蜱類志》［9］，將蜱置于體視顯微鏡下觀察，主要包括蜱蟲的假頭基、盾板、氣門板、生殖孔、肛側(cè)板等具有形態(tài)學(xué)鑒定意義的部位，然后將所有的蜱按照雌、雄進(jìn)行分類編號備用。

1.5 蜱和羊抗凝血樣品基因組DNA 提取

用PBS 溶液清洗蜱蟲3 遍，逐個放入2 mL 離心管，在離心管內(nèi)加入合適的鋼珠和500 μL PBS溶液，用冷凍混合球磨儀破碎組織后取200 μL 上清液，按照組織DNA 提取試劑盒說明書進(jìn)行提?。蝗⊙蚩鼓獦悠?00 μL，按照DNA 提取試劑盒說明書進(jìn)行提取。提取好的蜱蟲和羊抗凝血基因組DNA 在-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 PCR 擴(kuò)增

1.6.1 蜱蟲的分子生物學(xué)鑒定

參照已報道的蜱蟲鑒別引物16S rDNA 和ITS-2［10-11］，采用PCR 法對經(jīng)過形態(tài)學(xué)鑒定的蜱蟲進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。引物序列信息見表1，委托生工生物工程（上海）有限公司合成。PCR 擴(kuò)增體系為25 μL：12.5 μL Premix Taq，上、下游引物各1 μL，模板DNA 2 μL，加ddH2O 補(bǔ)至25 μL。16S rDNA 的PCR 反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30 個循環(huán)；72 ℃最后延伸5 min。ITS-2 基因的PCR 反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，60℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35 個循環(huán)；72 ℃最后延伸5 min。

表1 蜱蟲分子生物學(xué)鑒定所用引物序列信息 單位：bp

PCR 反應(yīng)結(jié)束前30 min 制備1.5%瓊脂糖凝膠，取5 μL PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳，工作電壓和時間分別設(shè)置為100 V 和50 min，電泳結(jié)束后立刻用凝膠成像儀進(jìn)行拍照，將PCR 陽性產(chǎn)物送至北京新時代眾合科技有限公司進(jìn)行測序，分析測得的基因序列。

1.6.2 蜱和羊抗凝血樣品中A.ovis 和A.phagocytophilum 的檢測

利用文獻(xiàn)［12-14］報道的A.ovis GroEL 基因PCR引物以及A.phagocytophilum 的16S rDNA 巢式PCR 引物，分別對蜱和羊抗凝血樣品中的A.ovis和A.phagocytophilum 的攜帶情況進(jìn)行檢測。引物序列信息見表2，委托生工生物工程（上海）有限公司合成。PCR 擴(kuò)增體系同“1.6.1 蜱蟲的分子生物學(xué)鑒定”項下。每次擴(kuò)增均設(shè)置陽性和陰性對照，A.ovis 和A.phagocytophilum 陽性對照為阿克蘇市動物疫病控制診斷中心保存的經(jīng)測序確認(rèn)的陽 性DNA，DEPC 水 作 為 陰 性 對 照。A.ovis 的GroEL 基因PCR 反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個循環(huán)；72 ℃最后延伸5 min。A.phagocytophilum的16S rRNA 巢式PCR 第1 步反應(yīng)所用引物為16SEE1 引物對，PCR 反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35 個循環(huán)；72 ℃最后延伸5 min。第2 步反應(yīng)所用引物為SSAP2 引物對，取第1 步PCR 擴(kuò)增反應(yīng)的產(chǎn)物2 μL 作為第2 步PCR 擴(kuò)增反應(yīng)的模板，PCR 反應(yīng)條件同第1 步。上述PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測及測序方法同“1.6.1 蜱蟲的分子生物學(xué)鑒定”項下。

表2 A.ovis 和A.phagocytophilum 檢測所用引物序列信息 單位：bp

1.7 數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用SPSS 22.0 分析軟件對不同種類蜱蟲和不同區(qū)域、不同飼養(yǎng)模式下羊感染無漿體的情況進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，采用χ2檢驗比較檢測數(shù)據(jù)的差異，當(dāng)P＜0.05 時，表示差異顯著，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 蜱蟲鑒定結(jié)果

經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察，采集的192 只蜱蟲包括雄蜱79 只、雌蜱113 只，屬于2 屬3 種，分別是扇頭蜱屬的圖蘭扇頭蜱 （Rhipicephalus turanicus，R.turanicus）以及璃眼蜱屬的亞洲璃眼蜱（Hyalomma asiaticm，H.asiaticm）和 小 亞 璃 眼 蜱（Hyalomma anatolicm，H.anatolicm），所占比例分別為52.60%、45.83%、1.56%（見表3）。不同種屬蜱蟲的性別分布情況見表3。

表3 蜱蟲形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果

使用普通PCR 法擴(kuò)增蜱蟲的線粒體16S rDNA 和ITS-2 基因，分別在460 bp 和821 bp 擴(kuò)增出目的條帶，與預(yù)期條帶大小相符。對PCR 得到的陽性產(chǎn)物進(jìn)行測序，獲得了3 種基因序列，將測得的基因序列進(jìn)行同源性分析，確認(rèn)采集的蜱蟲分別為R.turanicus、H.asiaticm、H.anatolicm，與形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果一致。

2.2 蜱蟲感染無漿體情況

使用普通PCR 方法擴(kuò)增蜱樣品中A.ovis 的GroEL 基因，使用巢式PCR 方法擴(kuò)增A.phagocytophilum 的16S rDNA，分別在977 bp 處和641 bp處擴(kuò)增出陽性條帶，片段大小與預(yù)期一致 （見圖1）。對192 只蜱感染無漿體情況進(jìn)行統(tǒng)計，結(jié)果顯示，蜱感染無漿體的總體陽性率為7.29%，其中，A.ovis 陽性率為2.60%，A.phagocytophilum 陽性率為4.69%，二者差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=1.26，P＞0.05），未檢測到A.ovis 和A.phagocytophilum 混合感染（見表4）。

圖1 蜱樣品中A.ovis 的GroEL 基因和A.phagocytophilum 的16S rDNA PCR 擴(kuò)增結(jié)果

表4 不同種屬蜱攜帶無漿體情況

從不同種屬蜱蟲感染無漿體情況來看，R.turanicus、H.asiaticm、H.anatolicm 感染無漿體陽性率分別為8.91%、5.68%、0，三者差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=3.20，P＜0.05）（見表4）。雄蜱整體的陽性率6.33%，雌蜱整體的陽性率為7.96%，二者差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=0.30，P＞0.05）（見表5）。

表5 不同性別蜱攜帶無漿體情況

2.3 羊感染無漿體情況

使用普通PCR 方法擴(kuò)增羊抗凝血樣品中A.ovis 的GroEL 基因，使用巢式PCR 方法擴(kuò)增A.phagocytophilum 的16S rDNA，結(jié)果顯示，分別在977 bp 和641 bp 處擴(kuò)增出陽性條帶，片段大小與預(yù)期一致（見圖2）。對477 份羊抗凝血樣品進(jìn)行檢測統(tǒng)計，結(jié)果顯示，在羊的抗凝血樣品中檢出無漿體的陽性率為51.15%，與蜱樣品中無漿體的陽性率差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=111.35，P＜0.05）；A.ovis 的陽性率為32.91%，A.phagocytophilum 的陽性率為34.80%，二者差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=0.38，P＞0.05），A.ovis 與A.phagocytophilum 混合感染率為16.56%。

圖2 羊抗凝血樣品中A.ovis 的GroEL 基因和A.phagocytophilum 的16S rDNA PCR 擴(kuò)增結(jié)果

2.3.1 不同區(qū)域羊感染無漿體情況

對不同縣（市）的477 份羊抗凝血樣品感染無漿體情況進(jìn)行統(tǒng)計，結(jié)果顯示，各縣（市）均有無漿體感染，感染率最高的是溫宿縣，為64.83%，最低的是庫車市和沙雅縣，均為5.00%，二者差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=27.72，P＜0.05）（見表6）。

表6 不同縣市無漿體感染情況

2.3.2 不同飼養(yǎng)模式羊感染無漿體情況

統(tǒng)計不同飼養(yǎng)模式下477 份羊抗凝血樣品感染情況，結(jié)果顯示，無漿體的陽性率在舍飼和散養(yǎng)模式下分別是28.16%和83.00%，二者差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=139.81，P＜0.05）（見表7）。

表7 不同飼養(yǎng)模式無漿體感染情況

3 討論

該研究的蜱蟲采集自烏什縣邊境山區(qū)，發(fā)現(xiàn)了3 種蜱蟲，其中R.turanicus 和H.asiaticm 的數(shù)量最多，H.anatolicm 的數(shù)量較少，未發(fā)現(xiàn)其他種屬的蜱蟲。

該次采集的蜱蟲攜帶A.ovis 和A.phagocytophilum 的陽性率低于李飛［15］報道的南疆部分地區(qū)羊體表蜱蟲攜帶A.ovis 和A.phagocytophilum的陽性率；不同性別蜱蟲攜帶A.ovis 和A.phagocytophilum 的陽性率也有差異，該文中雄蜱攜帶無漿體的陽性率低于雌蜱攜帶無漿體陽性率，雄蜱攜帶A.ovis 和A.phagocytophilum 陽性率均低于雌蜱，王坤輪［16］的調(diào)查結(jié)果顯示：雄蜱和雌蜱攜帶A.ovis 陽性率高于該文結(jié)果，而攜帶A.phagocytophilum 陽性率低于該文結(jié)果。這些差異可能與采樣地理環(huán)境、動物飼養(yǎng)條件以及蜱蟲活躍周期有關(guān)。

在該次采集的羊抗凝血樣品中檢出了陽性，與李佳等［7］在阿克蘇市羊抗凝血樣品中檢出的A.ovis 和A.phagocytophilum 陽性率基本一致。林留霞等［17］調(diào)查了阿克蘇市綿羊感染A.ovis 的情況，有23.00%的綿羊感染了A.ovis，寧曉冬等［18］在河南部分地區(qū)湖羊血液無漿體感染情況調(diào)查中發(fā)現(xiàn)A.ovis 和A.phagocytophilum 的陽性率分別為24.85%和1.21%。這說明無漿體病在我國各地普遍流行且不同地區(qū)存在較大的差異，這可能與當(dāng)?shù)氐膬?yōu)勢蜱種、采樣環(huán)境、地理環(huán)境和地域差別以及實驗人員的操作差異有關(guān)；舍飼模式下無漿體的陽性率為28.16%，要遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于散養(yǎng)模式下83.00%陽性率，這可能是規(guī)模養(yǎng)殖場基礎(chǔ)設(shè)施比較完善，防疫措施落實相比較散養(yǎng)要好一些，使羊群與蜱蟲接觸的機(jī)會減少；同時，季節(jié)性驅(qū)蟲以及消毒措施相對到位，這也是降低羊群感染無漿體的措施之一。該次調(diào)查結(jié)果低于金紫薇等［19］在舍飼模式下的調(diào)查結(jié)果，而在散養(yǎng)模式下高于其調(diào)查結(jié)果。

阿克蘇地區(qū)因為有著獨(dú)特的地理環(huán)境和復(fù)雜多樣的生態(tài)環(huán)境，是很多蜱傳疾病的自然疫源地，因此蜱傳疾病是不能忽視的疾病之一。目前防控?zé)o漿體病的重點在于控制媒介蜱的活動，從而切斷無漿體病的傳播途徑。由于蜱的種類較多，活動范圍較廣泛，攜帶的不同病原感染同一宿主可以引起混合感染，以及羊的飼養(yǎng)方式不同、養(yǎng)殖條件差異等原因，蜱蟲的防治效果也不相同［20］。所以，要清楚地了解蜱與無漿體病之間的關(guān)系，有針對性地采取措施是十分重要的，該研究為該地區(qū)蜱種的鑒定和無漿體病的綜合防治提供了一定的參考依據(jù)。

4 結(jié)論

該次試驗總共采集到了R.turanicus、H.asiaticm 和H.anatolicm 3 種蜱蟲，在蜱蟲和羊抗凝血樣品中均檢測到A.ovis 和A.phagocytophilum 陽性，說明阿克蘇部分地區(qū)的蜱和羊普遍感染無漿體，應(yīng)該加強(qiáng)對無漿體病的防治工作，該試驗為該地區(qū)做好無漿體病的防控提供一定的依據(jù)。