陰禹舟，王 勃，夏方山，王聰聰，陳奕霖，趙 萍

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，山西 太谷 030801）

硒元素是人和動物的必需微量元素，硒缺乏與克山病和大骨節(jié)病的易感性有著密切關(guān)系［1］。硒可促進(jìn)植物新陳代謝，在植物生長發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用，硒的合理使用有助于提高種子質(zhì)量［2-3］。人類和動物體內(nèi)無法合成硒且易于代謝，人類和動物攝取硒的重要來源是通過膳食攝入植物富集的土壤無機(jī)態(tài)硒，因此，土壤中的有效硒含量對人和動物的健康具有至關(guān)重要的作用［4］。土壤中硒的有效性在世界上大多數(shù)地區(qū)都處于較低水平，容易導(dǎo)致人體硒缺乏［5-6］。我國有近72%的區(qū)域存在著不同程度的缺硒現(xiàn)象，黃土高原中北部缺硒尤為嚴(yán)重，其土壤硒含量低于0.1 μg/g，致使該地區(qū)的人和動物易患缺硒疾?。?-9］。

生物富硒不僅可以有效提高植物的產(chǎn)量和品質(zhì)，還能滿足人體對硒的營養(yǎng)需求［10］。人體對硒需求水平的安全范圍非常窄，攝入量低于需求水平的1/10 就會引起硒缺乏疾病，而攝入量超過需求水平的10 倍則會引起硒中毒，因此，在富硒農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)中需謹(jǐn)慎控制硒濃度和處理時(shí)間［11］。目前，硒元素在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的主要施用方法有土壤施肥和葉面噴施，而種子引發(fā)的方式相對少見［12］。傳統(tǒng)的土壤施肥方式使用的微肥量較低且難以撒施均勻，植物根系對所缺乏微肥的需求無法通過葉面施肥的方法快速緩解。上述2 種施肥方式人力以及物力投入較大，使得微肥綜合施用的效益大幅降低，而種子引發(fā)可以避免這些方法的限制［13］。種子引發(fā)是通過控制種子緩慢吸水和后期回干，使種子胚根達(dá)到即將突破種皮時(shí)的早期萌發(fā)狀態(tài)，為萌發(fā)提前進(jìn)行生理準(zhǔn)備的一種播前種子處理技術(shù)，因其簡單安全，在微量元素施用中具有廣泛的應(yīng)用前景，已發(fā)展為一種經(jīng)濟(jì)有效、操作簡單的施肥替代方法，成為富硒農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)中基本的生物策略［14-15］。硒引發(fā)可以促進(jìn)植物尤其是幼苗的生長，大幅增強(qiáng)植物的抗氧化能力以及抗逆性等，從而提高植物的產(chǎn)量和品質(zhì)［16］。然而硒引發(fā)對植物影響的研究仍然較少，嚴(yán)重制約著其在生產(chǎn)實(shí)踐中的推廣應(yīng)用。

紫花苜蓿（Medicago sativa L.）不僅具有產(chǎn)量高、再生能力強(qiáng)、營養(yǎng)價(jià)值高和良好的生態(tài)價(jià)值等特點(diǎn)，而且具有良好的適口性和高消化率，是優(yōu)質(zhì)牧草品種和飼料作物［17-18］。硒作為動植物生長發(fā)育的必需微量元素，不僅可以預(yù)防某些疾病的發(fā)生，而且在生產(chǎn)中發(fā)揮著極其重要的作用［19-20］，因此，大規(guī)模生產(chǎn)高品質(zhì)富硒紫花苜蓿也越來越受到關(guān)注。在傳統(tǒng)植物生產(chǎn)中直接添加硒往往會出現(xiàn)不可避免的不良現(xiàn)象，如高毒性、攝入不均勻及生物利用率低等［21-22］。目前，富硒苜蓿產(chǎn)品以土壤施肥、葉面噴施等方式為主，紫花苜蓿幼苗的抗氧化能力可通過土壤施硒肥的方式得以提高，從而促進(jìn)紫花苜蓿的生長［21］。研究發(fā)現(xiàn)，硒引發(fā)可以提高紫花苜蓿種子的抗氧化能力［23］。然而關(guān)于外源硒引發(fā)對紫花苜蓿幼苗不同部位抗氧化能力的影響尚不清楚，所以利用種子引發(fā)技術(shù)進(jìn)行富硒紫花苜蓿生產(chǎn)有待進(jìn)一步研究。該研究旨在通過評價(jià)0.5 mmol/L 的亞硒酸鈉溶液引發(fā)條件下，不同引發(fā)時(shí)間對紫花苜蓿幼苗各部位抗氧化能力的影響，以期為發(fā)展高效富硒紫花苜蓿生產(chǎn)和進(jìn)一步提高紫花苜蓿栽培管理水平提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料來源

紫花苜蓿種子由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)草類植物育種與種子科學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。供試的紫花苜蓿品種為偏關(guān)苜蓿，2018 年在山西農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)科學(xué)校內(nèi)試驗(yàn)站收獲，密封保存于-20 ℃環(huán)境中，試驗(yàn)于2021 年3 月進(jìn)行。

1.2 引發(fā)處理

挑選均勻飽滿的紫花苜蓿種子，浸入濃度為0.5 mmol/L 的亞硒酸鈉溶液中，于20 ℃的環(huán)境中分別處理0、3、6、9、12 h，確保種子完全浸入溶液。引發(fā)結(jié)束后用蒸餾水沖洗種子3 次，并快速將其表面水分用濾紙吸干，移至黑暗環(huán)境（溫度為25℃、空氣相對濕度為45%）中自然風(fēng)干，待含水量約為鮮重基礎(chǔ)的10%時(shí)，4 ℃密封保存，備用。每個(gè)處理挑選均勻飽滿的種子100 粒，放入鋪有2 層濾紙的培養(yǎng)皿中，于20 ℃恒溫光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 d，每個(gè)處理重復(fù)4 次。

1.3 抗氧化性能指標(biāo)測定

取紫花苜蓿整株幼苗、子葉及胚根各0.1 g，參照Kibinza 等［24］報(bào)道的方法進(jìn)行粗酶液提取，上清液于4 ℃保存?zhèn)溆谩⒄誖ao 等［25］報(bào)道的方法測定超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性，參照Nakano 等［26］報(bào)道的方法測定抗壞血酸過氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）活性，參照Aebi［27］報(bào) 道 的 方 法 測 定 過 氧 化 氫 酶（catalase，CAT）活性，參照Madamanchi 等［28］報(bào)道的方法測定谷胱甘肽還原酶 （glutathione reductase，GR）活性，參照Bailly 等［29］報(bào)道的方法測定丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用Excel 2016 軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行初步整理，用SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行單因素方差分析，組間均數(shù)多重比較使用Duncan＇s 法，P＜0.05表示差異顯著，P＞0.05 表示差異不顯著。試驗(yàn)結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”的形式表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 硒引發(fā)時(shí)間對紫花苜蓿幼苗不同部位SOD活性的影響

由圖1 可知，在不同引發(fā)時(shí)間處理下，紫花苜蓿幼苗整株、子葉及胚根的SOD 活性均隨引發(fā)時(shí)間的增加呈升高趨勢；整株、子葉及胚根的SOD活性均在引發(fā)0 h 時(shí)最低，在引發(fā)12 h 時(shí)最高，且整株、子葉及胚根的SOD 活性在不同引發(fā)時(shí)間差異顯著（P＜0.05）。在相同引發(fā)時(shí)間處理下，紫花苜蓿幼苗各部位的SOD 活性存在差異，5 個(gè)引發(fā)時(shí)間下胚根的SOD 活性均顯著（P＜0.05）高于子葉和整株，其大小順序?yàn)榕吒菊辏咀尤~。

圖1 硒引發(fā)時(shí)間對紫花苜蓿幼苗不同部位SOD 活性的影響

2.2 硒引發(fā)時(shí)間對紫花苜蓿幼苗不同部位CAT活性的影響

由圖2 可知，在不同引發(fā)時(shí)間處理下，紫花苜蓿幼苗整株、子葉及胚根的CAT 活性均隨引發(fā)時(shí)間的增加呈升高趨勢；整株、子葉及胚根的CAT活性均在引發(fā)0 h 時(shí)最低，在引發(fā)12 h 時(shí)最高，且整株、子葉及胚根的CAT 活性在不同引發(fā)時(shí)間差異顯著（P＜0.05）。在相同引發(fā)時(shí)間處理下，紫花苜蓿幼苗各部位的CAT 活性存在差異，5 個(gè)引發(fā)時(shí)間下胚根的CAT 活性均顯著（P＜0.05）高于子葉和整株，其大小順序?yàn)榕吒菊辏咀尤~。

圖2 硒引發(fā)時(shí)間對紫花苜蓿幼苗不同部位CAT 活性的影響

2.3 硒引發(fā)時(shí)間對紫花苜蓿幼苗不同部位APX活性的影響

由圖3 可知，在不同引發(fā)時(shí)間處理下，紫花苜蓿幼苗整株、子葉及胚根的APX 活性均隨引發(fā)時(shí)間的增加呈升高趨勢；子葉的APX 活性在引發(fā)0、3 h 時(shí)顯著（P＜0.05）低于其他引發(fā)時(shí)間，在引發(fā)12 h 時(shí)顯著（P＜0.05）高于其他引發(fā)時(shí)間；胚根和整株的APX 活性在引發(fā)0 h 時(shí)最低，在引發(fā)12 h時(shí)最高，且胚根和整株的APX 活性在不同引發(fā)時(shí)間差異顯著（P＜0.05）。在相同引發(fā)時(shí)間處理下，紫花苜蓿幼苗各部位的APX 活性存在差異，5 個(gè)引發(fā)時(shí)間下胚根的APX 活性均顯著（P＜0.05）高于子葉和整株，其大小順序?yàn)榕吒菊辏咀尤~。

圖3 硒引發(fā)時(shí)間對紫花苜蓿幼苗不同部位APX 活性的影響

2.4 硒引發(fā)時(shí)間對紫花苜蓿幼苗不同部位GR活性的影響

由圖4 可知，在不同引發(fā)時(shí)間處理下，紫花苜蓿幼苗整株、子葉及胚根的GR 活性均隨引發(fā)時(shí)間的增加呈升高趨勢；子葉的GR 活性在引發(fā)0 h時(shí)顯著（P＜0.05）低于其他引發(fā)時(shí)間，在引發(fā)12 h時(shí)最高；胚根和整株的GR 活性均在引發(fā)0 h 時(shí)顯著（P＜0.05）低于其他引發(fā)時(shí)間，在引發(fā)12 h 時(shí)最高，其中，整株的GR 活性在引發(fā)12 h 時(shí)顯著（P＜0.05）高于其他引發(fā)時(shí)間。在相同引發(fā)時(shí)間處理下，紫花苜蓿幼苗各部位的GR 活性存在差異，5個(gè)引發(fā)時(shí)間下胚根的GR 活性均顯著（P＜0.05）高于子葉和整株，其大小順序?yàn)榕吒菊辏咀尤~。

圖4 硒引發(fā)時(shí)間對紫花苜蓿幼苗不同部位GR 活性的影響

2.5 硒引發(fā)時(shí)間對紫花苜蓿幼苗不同部位MDA含量的影響

由圖5 可知，在不同引發(fā)時(shí)間處理下，紫花苜蓿幼苗整株、子葉及胚根的MDA 含量均隨引發(fā)時(shí)間的增加呈先升高后下降趨勢；子葉的MDA 含量在引發(fā)12 h 時(shí)最低，顯著（P＜0.05）低于引發(fā)0、3 h處理；整株的MDA 含量在引發(fā)3 h 時(shí)升至最高，在引發(fā)6 h 時(shí)MDA 含量出現(xiàn)下降，在引發(fā)12 h 時(shí)MDA 含量降至最低，顯著（P＜0.05）低于引發(fā)0、3、6 h 處理；胚根的MDA 含量在引發(fā)3 h 時(shí)升至最高，在引發(fā)6 h 時(shí)MDA 含量出現(xiàn)下降，在引發(fā)12 h時(shí)MDA 含量降至最低，顯著（P＜0.05）低于其他引發(fā)時(shí)間。在相同引發(fā)時(shí)間處理下，紫花苜蓿幼苗各部位的MDA 含量存在差異，5 個(gè)引發(fā)時(shí)間下胚根的MDA 含量顯著（P＜0.05）高于子葉和整株，其大小順序?yàn)榕吒菊辏咀尤~。

圖5 硒引發(fā)時(shí)間對紫花苜蓿幼苗不同部位MDA 含量的影響

3 討論

抗氧化酶系統(tǒng)對脅迫的響應(yīng)是植物抵御逆境傷害的關(guān)鍵機(jī)制之一，由SOD、CAT、APX 和GR等協(xié)同作用，清除細(xì)胞內(nèi)過量積累的活性氧［30-31］。硒是植物體內(nèi)重要的微量元素，主要作用是作為抗氧化物質(zhì)的成分參與抗氧化作用［32-33］。在沒有SOD 催化時(shí)，硒能夠刺激O2-自發(fā)歧化成H2O2，并且硒化合物對O2-具有直接清除作用［34］。硒對植物幼苗各部位的作用主要表現(xiàn)在提升其抗氧化能力方面［35］。該研究中，在濃度為0.5 mmol/L 的亞硒酸鈉溶液引發(fā)處理下，紫花苜蓿幼苗各部位的抗氧化酶活性表現(xiàn)出隨著引發(fā)時(shí)間的延長而上升的趨勢，在引發(fā)處理12 h 時(shí)達(dá)到最高，這與夏方山等［23］報(bào)道的硒引發(fā)對紫花苜蓿種子抗氧化性能影響的研究結(jié)果相似，說明紫花苜蓿種子及幼苗的抗氧化酶活性隨著硒引發(fā)時(shí)間的增加而提高。外源硒通過增加植物各部位抗氧化酶的活性，使得幼苗對活性氧的清除能力提高［36］。SOD 是植物體內(nèi)參與活性氧清除的一種重要酶，在抗氧化酶系統(tǒng)中占據(jù)核心地位［37］。該研究中，隨著硒引發(fā)時(shí)間的增加，紫花苜蓿幼苗不同部位的SOD 酶活性逐漸增加，這與硒處理下SOD 基因轉(zhuǎn)錄水平增加密切相關(guān)［38］。SOD 將有害的O2-轉(zhuǎn)化成H2O2以減輕對植物的傷害，同時(shí)，APX、GR 與CAT 等組成抗氧化酶系統(tǒng)發(fā)揮協(xié)同作用，清除H2O2［39］。MDA 是植物體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的標(biāo)志性產(chǎn)物，膜結(jié)構(gòu)受損狀況可通過MDA 含量反映。細(xì)胞中活性氧的大量積累會引起脂質(zhì)過氧化，從而造成MDA 含量上升；細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶系統(tǒng)被激活是因?yàn)榧?xì)胞膜結(jié)構(gòu)受到MDA 脅迫，從而增強(qiáng)細(xì)胞的抗氧化能力［40-42］。該研究中，在硒引發(fā)0～3 h 時(shí)，隨著硒引發(fā)時(shí)間的延長，紫花苜蓿幼苗各部位細(xì)胞內(nèi)O2-不斷積累，加劇了脂質(zhì)過氧化，各部位細(xì)胞中MDA 含量逐漸增加，刺激抗氧化酶活性不斷升高，清除活性氧的能力加強(qiáng)；在引發(fā)3 h 后，抗氧化酶系統(tǒng)及時(shí)清除過量的O2-，緩解脂質(zhì)過氧化，MDA 含量降低，在引發(fā)12 h 后紫花苜蓿幼苗不同部位的MDA 含量降至最低，說明硒引發(fā)可在一定程度上緩解紫花苜蓿幼苗不同部位細(xì)胞的脂質(zhì)過氧化，保護(hù)生物膜系統(tǒng)，有利于紫花苜蓿種子的萌發(fā)。研究表明，硒引發(fā)能夠降低油菜（Brassica campestris）幼苗根系中MDA 含量，有利于幼苗根系的生長，而基施少量的硒肥也能使紫花苜蓿葉片的MDA 含量降低，這可能與抗氧化酶活性的升高有關(guān)［43］。

硒引發(fā)可以提高紫花苜蓿幼苗各部位的抗氧化能力。該研究中，在相同的硒引發(fā)時(shí)間下，紫花苜蓿幼苗胚根的SOD、CAT、GR 及APX 活性顯著（P＜0.05）高于其他部位，表明硒引發(fā)可以提高幼苗胚根的抗氧化能力，這有利于紫花苜蓿胚根生長，并促進(jìn)其萌發(fā)。胚根是種子萌發(fā)時(shí)最先生長的部位，最容易受到環(huán)境的影響。隨著硒引發(fā)時(shí)間的增加，紫花苜蓿幼苗胚根抗氧化酶的活性始終高于其他部位，說明硒引發(fā)可以提高幼苗胚根的抗氧化能力，有利于幼苗胚根保持活力從而應(yīng)對外界環(huán)境的變化。此外，在相同的硒引發(fā)時(shí)間下，紫花苜蓿幼苗胚根的MDA 含量也顯著 （P＜0.05）高于其他部位，這說明幼苗在生長過程中，最先長出的胚根較容易受到損傷。與其他引發(fā)時(shí)間相比，在引發(fā)12 h 時(shí)紫花苜蓿幼苗胚根的MDA 含量最低，說明幼苗胚根細(xì)胞的脂質(zhì)過氧化水平由于硒引發(fā)而降低，有利于紫花苜蓿幼苗的生長。

4 結(jié)論

硒引發(fā)對紫花苜蓿幼苗抗氧化能力的影響與其部位和引發(fā)時(shí)間有關(guān)。紫花苜蓿幼苗整株、子葉及胚根的SOD、CAT、GR 及APX 活性隨著硒引發(fā)時(shí)間的增加而上升，而MDA 含量的變化趨勢相反。硒引發(fā)對紫花苜蓿幼苗子葉的影響最小，對幼苗胚根的影響最大。硒引發(fā)濃度為0.5 mmol/L、引發(fā)時(shí)間為12 h 時(shí)效果最佳。