孫 宇 張藝騰 成慧慧

（1.黑龍江生態(tài)工程職業(yè)學(xué)院，哈爾濱 150080；2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院耕作栽培研究所，哈爾濱 150028；3.東北鹽堿植被恢復(fù)與重建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150040）

植物所處的環(huán)境是多變的，但其能夠?qū)Νh(huán)境的刺激做出響應(yīng)，植物感知脅迫信號(hào)并通過(guò)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)生理和生化途徑來(lái)維持生長(zhǎng)發(fā)育，如ABA 的積累就是針對(duì)干旱或鹽堿脅迫信號(hào)的傳導(dǎo)反應(yīng)；H2O2、超氧陰離子等活性氧的增加同樣是鹽堿、干旱等逆境脅迫響應(yīng)途徑的信號(hào)分子［1-3］。非生物脅迫下信號(hào)傳導(dǎo)表達(dá)調(diào)控作用的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子（TFs），許多TFs家族的成員參與非生物脅迫反應(yīng)，包括NAC，擬南芥（Arabidopsis thaliana）轉(zhuǎn)錄激活因 子（ATAF）和 杯 形 子 葉（CUC），MYB，APETALA2/乙烯反應(yīng)因子（AP2/ERF），WRKY 和堿性亮氨酸拉鏈（bZIP）等轉(zhuǎn)錄因子［4-5］。植物轉(zhuǎn)錄因子的特有結(jié)構(gòu)在鹽脅迫中發(fā)揮重要作用從而改善其生長(zhǎng)發(fā)育。目前研究表明，轉(zhuǎn)錄因子既有抗逆性的正調(diào)節(jié)因子，如過(guò)表達(dá)SmyB2基因水稻（Oryza sativa）、SlWRKY28基因山新楊（Populus da?vidiana）等表現(xiàn)出對(duì)鹽、冷和干旱脅迫的耐受性增強(qiáng)［6-7］；也有少數(shù)轉(zhuǎn)錄因子為響應(yīng)鹽堿和干旱脅迫的 負(fù) 調(diào) 節(jié) 因 子［8-9］，如GmWRKY27 通 過(guò) 與Gm?MYB174 作用負(fù)調(diào)節(jié)GmNAC29 而提高大豆（Gly?cine max）植株的抗逆性［10］。WRKY 蛋白與受體調(diào)節(jié)蛋白相互作用形成轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)行使功能［11］。

WRKY 轉(zhuǎn)錄因子是植物應(yīng)激反應(yīng)中研究最廣泛的家族［12］。因此，它在抗旱耐鹽堿等脅迫中可能扮演非常重要的角色。WRKY 轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)差異決定其調(diào)節(jié)功能不同，明確植物的WRKY 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)是很必要的。近年來(lái)，研究表明WRKY 蛋白具有1 個(gè)或2 個(gè)WRKYGQK 基序和鋅指基序的保守DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域，并通過(guò)作用于啟動(dòng)子上的W-box 順式元件來(lái)調(diào)節(jié)基因表達(dá)［13］。根據(jù)WRKY 結(jié)構(gòu)域的數(shù)量及其鋅指基序的不同，WRKY 蛋白可分為3 組，第2 組是由5 個(gè)亞類(lèi)組成［14］。此外，WRKY 蛋白含有谷氨酸富集結(jié)構(gòu)域、脯氨酸富集結(jié)構(gòu)域和亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)。綜上，WRKY TFs 在植物應(yīng)激反應(yīng)以及植物生長(zhǎng)和發(fā)育過(guò)程中的作用已被廣泛研究。

紫穗槐（Amorpha fruticosa）為抗旱耐受鹽堿性極強(qiáng)的灌木樹(shù)種［15］，顏淑云等［16］研究紫穗槐響應(yīng)干旱脅迫對(duì)其生理生化指標(biāo)影響的結(jié)果，揭示了其幼苗抵御干旱脅迫的生理適應(yīng)性變化調(diào)節(jié)機(jī)制。紫穗槐逆境脅迫下的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究表明其AfWRKY42轉(zhuǎn)錄因子［17］上調(diào)表達(dá)，不過(guò)，AfWRKY42轉(zhuǎn)錄因子在耐鹽堿方面調(diào)節(jié)作用的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。為闡明AfWRKY42 轉(zhuǎn)錄因子的耐鹽堿功能，本研究分離AfWRKY42基因并加以生物信息學(xué)分析，進(jìn)一步檢測(cè)鹽堿脅迫下的表達(dá)特性，通過(guò)超表達(dá)本氏煙草（Nicotiana tabacum）植株的抗逆性表型和相關(guān)生理指標(biāo)的檢測(cè)，解析Af?WRKY42基因功能，為植物的分子編輯育種奠定基因資源基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

植物材料紫穗槐種子由延邊大學(xué)吳松權(quán)課題組饋贈(zèng)，本氏煙草種子由中國(guó)科學(xué)院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所卜慶云課題組饋贈(zèng)。

大腸桿菌（Escherichia coli）JM109、根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）EHA105 由東北鹽堿植被恢復(fù)與重建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

載體pMD18-T vector 購(gòu)自大連寶生物有限公司，植物表達(dá)載體（pBI121-35S-MCS-GFP）由本實(shí)驗(yàn)室保存。

胰蛋白胨及酵母提取物粉末購(gòu)自于默克化工技術(shù)（上海）有限公司，DNA凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒DNA 提取試劑盒和RNA 提取試劑盒等購(gòu)于康為世紀(jì)生物科技有限公司。

限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、HindⅢ、KpnⅠ和SpeⅠ，T4-DNA 連接酶購(gòu)自Fermentas 公司，高效率逆轉(zhuǎn)錄cDNA試劑盒和Blend-TaqDNA聚合酶購(gòu)自TOYOBO生物公司；氨芐青霉素和潮霉素試劑購(gòu)自Sigma公司，分別配制成50 g·L?1的儲(chǔ)備液，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純?cè)噭?/p>

1.2 方法

1.2.1 基因的克隆及生物信息學(xué)分析

以逆境脅迫下紫穗槐轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得Af?WRKY42（登錄號(hào)：MT859406）基因核苷酸序列為基礎(chǔ)［18］，設(shè)計(jì)特異性克隆引物AfWRKY42-F1 和R2（表1）。通過(guò)RT-PCR 的方法擴(kuò)增AfWRKY42基因，將F1/R2 引物與提取的紫穗槐幼苗RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA 模板混合，再加入Blend-TaqDNA 聚合酶組成PCR 反應(yīng)體體系，在9700 PCR 儀上擴(kuò)增雙鏈DNA，瓊脂糖凝膠電泳并純化DNA，連接插入pMD18-T載體上，轉(zhuǎn)化克隆到菌株JM109，以限制性內(nèi)切酶BamHⅠ/HindⅢ酶切pMD18-T-AfWRKY42質(zhì)粒DNA 鑒定，送樣至吉林省庫(kù)美生物科技有限公司測(cè)序。

以測(cè)序獲得的核苷酸序列為比較基準(zhǔn)，通過(guò)NCBI 在線網(wǎng)站分析該基因的ORF，并用ProtParam工具進(jìn)一步得到編碼蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)（https：//web.expasy.org/protparam/）；利用在線網(wǎng)站SMART：Main page（http：//smart.embl-heidelberg.de）分析預(yù)測(cè)其保守結(jié)構(gòu)域；在NCBI 上Blastp 在線分析軟件比對(duì)獲得同源性較高的序列，并使用在線網(wǎng)站Clustal Omega 進(jìn)行多序列比對(duì)，進(jìn)一步應(yīng)用MEGA6.0軟件最大鄰接法（NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)（bootstrap 值設(shè)為1 000）；以及在https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php？TMHMM-2.0 網(wǎng)站預(yù)測(cè)其跨膜結(jié)構(gòu)，采用在線工具紐普生物-NovoPro預(yù)測(cè)其蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)，NetPhos 3.1（https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php？NetPhos-3.1）分析其磷酸化位點(diǎn)。

1.2.2 AfWRKY42 基因的表達(dá)特性分析及蛋白亞細(xì)胞定位檢測(cè)

為了分析AfWRKY42基因在紫穗槐不同組織器官的差異表達(dá)特性，選取3年生紫穗槐在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的不同組織（根、嫩莖、嫩莖表皮、葉、花序），提取總RNA，并反轉(zhuǎn)錄cDNA。

選取水培法培養(yǎng)長(zhǎng)勢(shì)一致的4周紫穗槐幼苗，以150 mmol·L?1NaCl 和30 mmol·L?1NaHCO3分別處理0、6、12、24、48 h，提取其根和葉的RNA。取其總RNA 作為模板反轉(zhuǎn)錄成cDNA。將cDNA 稀釋100 倍作為實(shí)時(shí)熒光定量的PCR 檢測(cè)模板。內(nèi)參基因引物和AfWRKY42特異定量性引物（見(jiàn)表1），按Guan 等［19］方法在MxPro-Mx3000P 系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)量數(shù)據(jù)采集，應(yīng)用DPS 軟件的鄧肯法進(jìn)行數(shù)據(jù)差異性分析，以O(shè)rigin軟件作圖。

通過(guò)生物信息學(xué)網(wǎng)站http：//psort.hgc.jp/form.html 進(jìn)行亞細(xì)胞預(yù)測(cè)分析，確定AfWRKY42 蛋白發(fā)揮功能的場(chǎng)所。再加以試驗(yàn)研究驗(yàn)證，根據(jù)植物表達(dá)載體模型，增設(shè)KpnⅠ/SpeⅠ位點(diǎn)引物，PCR產(chǎn)物雙酶切電泳，回收DNA 片段，連接，構(gòu)建pBI121：：AfWRKY42：：GFP 重 組 質(zhì) 粒，并 以PEG6000為介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)化擬南芥葉肉原生質(zhì)體方法，轉(zhuǎn)基因瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)檢測(cè)35S-AfWRKY42-GFP 融合蛋白的熒光表達(dá)，驗(yàn)證AfWRKY42 蛋白的亞細(xì)胞表達(dá)發(fā)揮作用的位置。

1.2.3 過(guò)表達(dá)AfWRKY42 煙草對(duì)鹽堿脅迫的耐受性分析

以含有PBI121：：AfWRKY42：：GFP質(zhì)粒的農(nóng)桿菌EHA105 侵染四葉期的野生型本氏煙草的葉片，在50 mg·L?1的Kana 分化培養(yǎng)基上篩選再生抗性芽，進(jìn)一步分化培養(yǎng)獲得抗性轉(zhuǎn)化子，PCR 檢測(cè)基因的染色體整合，Kana抗性平板播種篩選，并收獲抗性的轉(zhuǎn)基因種子至T3代，對(duì)T3代的激素抗性植株進(jìn)行qRT-PCR 分析［20］，依據(jù)轉(zhuǎn)AfWRKY42基因植株的表達(dá)量，選擇T3 代株系作為后期脅迫試驗(yàn)材料。

將同期收獲的野生型（WT）和轉(zhuǎn)基因（T3 代#1，#4，#5）煙草種子點(diǎn)播在土中，煙草培養(yǎng)2 個(gè)月后，對(duì)WT 和過(guò)表達(dá)AfWRKY42的3 個(gè)不同株系分別 進(jìn) 行 不 同 濃 度 的NaCl（200、300 mmol·L?1），NaHCO3（300、400 mmol·L?1）灌根處理7 d，每天處理1 次，處理后土壤pH 分別約為8.4 和9.2。于光/暗為16 h/8 h、（25±1）℃培養(yǎng)，處理其表型有變化后，以Fluor Cam 熒光成像檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)最大光合效率（Fv/Fm）的分析，考察植物對(duì)逆境脅迫的抗性，自頂葉向下第3 片開(kāi)始取3 片葉檢測(cè)其葉綠素?zé)晒鈪?shù)、葉綠素含量［21］，設(shè)置n=3次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 AfWRKY42基因的克隆與生物信息學(xué)分析

2.1.1 AfWRKY42基因的克隆

以RT-PCR 擴(kuò)增雙鏈DNA 片段，反應(yīng)產(chǎn)物電泳顯示：在1 300 bp 左右處有DNA 條帶（圖1A），將其回收并與pMD-18-T 進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化，在Amp平板上篩選到陽(yáng)性克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)后提取重組質(zhì)粒DNA，以BamHⅠ/HindⅢ雙酶切電泳結(jié)果表明，有目的DNA 條帶（圖1B）。重組質(zhì)粒送樣測(cè)序結(jié)果表明與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的核苷酸序列相同，AfWRKY42登錄NCBI GenBank基因號(hào)為MT859406。

圖1 紫穗槐AfWRKY42基因的PCR克隆與酶切鑒定A.RT-PCR 產(chǎn)物（P）電泳；B.#1，pMD18-T-AfWRKY42的質(zhì)粒DNA 雙酶（BamHⅠ/HindⅢ）切電泳鑒定；M.DNA MarkerFig.1 PCR cloning and enzyme digestion of the AfWRKY42 gene A.Electrophoresis of RT-PCR product（P）；B.#1，electrophoresis of identification of plasmid DNA double enzyme（BamHⅠ/HindⅢ）di?gestion of pMD18-T-AfWRKY42；M.DNA Marker

2.1.2 AfWRKY42蛋白的生物信息

克隆到AfWRKY42基因開(kāi)放閱框1 356 bp，編碼451個(gè)氨基酸，其蛋白分子質(zhì)量為49.83 kDa；分子式為C4125H6896N1356O1679S330，理論等電點(diǎn)為4.99，該蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)為52.54，平均親水系數(shù)為0.947，為疏水蛋白。軟件預(yù)測(cè)到AfWRKY42 蛋白含有1 個(gè)WRKY 結(jié)構(gòu)域（210～270），2 個(gè)低復(fù)雜區(qū)域和1 個(gè)螺旋區(qū)域（圖2A）。對(duì)AfWRKY42 蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，有14 個(gè)α螺旋和9 個(gè)β轉(zhuǎn)角（圖2B）。NJ法構(gòu)建AfWRKY42的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖2C）發(fā)現(xiàn)：它和木豆（Cajanus cajan）的WRKY47、藜豆（Mucuna pruriens）的WRKY42 蛋白序列親緣關(guān)系最接近。同時(shí)軟件分析AfWRKY42蛋白與其他物種的Motif結(jié)構(gòu)圖顯示出含有1個(gè)WRKYGQK 結(jié)構(gòu)域（圖2D），磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)大于0.75的有20個(gè)。

圖2 AfWRKY42蛋白的生物信息A.AfWRKY42的結(jié)構(gòu)圖譜；B.蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)（α螺旋為藍(lán)色，β轉(zhuǎn)角為綠色，延伸鏈為紅色，無(wú)規(guī)則卷曲為紫色）；C.系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，木豆（CcWRKY47，CcWRKY42），刺毛黧豆（MpWRKY42），雞血藤（SsWRKY42），高粱蚜（GsWRKY42），大豆（GmWRKY42），菜豆（PvPHA?VU），豇豆（VuWRKY31），小豆（VaWRKY6），綠豆（VrWRKY6），相思子（ApWRKY42），藜豆（CaWRKY42）；D：（a）AfWRKY42 蛋白Motif 結(jié)構(gòu)圖，（b）Motif位置圖和共有基序圖Fig.2 Bioinformation of AfWRKY42 protein A.Structural mapping of AfWRKY42；B.Predicted secondary structure of AfWRKY42 proteinalpha helix is blue，beta corner is green，extended chain is red，and irregular curl is purple；C.AfWRKY42 phylogenetic tree，Cajanus cajan（CcWRKY47，CcWRKY42），Mucuna pruriens（Mp?WRKY42），Spatholobus suberectu（sSsWRKY42），Melanaphis sacchar（iGsWRKY42），Glycine max（GmWRKY42），Phaseolus vulgari（sPvPHA?VU），Vigna unguiculata（VuWRKY31），Vigna angulari（sVaWRKY6），Vigna radiata（VrWRKY6），Abrus precatoriu（sApWRKY42），Cicer arieti?num（CaWRKY42）；D（.a）Motif position map，（b）Motif shared motif map

2.2 AfWRKY42 基因的表達(dá)特性及蛋白亞細(xì)胞定位

2.2.1 AfWRKY42組織器官表達(dá)特性

通過(guò)熒光定量PCR 技術(shù)檢測(cè)紫穗槐Af?WRKY42基因在根、嫩莖、嫩莖表皮、葉、花序中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)AfWRKY42基因在上述各個(gè)組織器官中都有表達(dá)，該基因在嫩莖的表皮中表達(dá)量最高，而在根中的表達(dá)量最低（作為對(duì)照），葉中的表達(dá)量是根的5.1 倍，在嫩莖的表皮中表達(dá)量是根中的11.3倍（圖3）。

圖3 在根、嫩莖、嫩莖表皮、葉、花序組織中AfWRKY42基因的表達(dá)特征Fig.3 Pattern of AfWRKY42 gene expressed in root，stem，epidermal，leaf，and inflorescence respectively

2.2.2 鹽堿脅迫誘導(dǎo)AfWRKY42 基因的表達(dá)特性

本研究又檢測(cè)了紫穗槐分別在鹽（NaCl）、堿（NaHCO3）脅迫處理下，AfWRKY42在根和葉中不同脅迫時(shí)間的表達(dá)量。熒光定量PCR 檢測(cè)表明：在150 mmol·L?1NaCl 脅迫下，AfWRKY42在葉片中6 h 相對(duì)表達(dá)最低，隨后升高，在12 h 表達(dá)量為對(duì)照組的1.8 倍（圖4A～B）；在根中呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，在12 h 表達(dá)量是對(duì)照組的5.3 倍，達(dá)到表達(dá)峰值；紫穗槐在30 mmol·L?1NaHCO3處理下，AfWRKY42基因在葉片中，處理12、24 h 分別為0 h表達(dá)量的3.1、1.5倍，在脅迫處理48 h之后，表達(dá)量雖有下降，但不顯著；在根中同樣是12 h 表達(dá)量最高，是0 h 時(shí)表達(dá)量的4.5 倍，之后隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，表達(dá)量下降（圖4C～D）。總之，鹽堿脅迫誘導(dǎo)AfWRKY42基因在根和葉中表達(dá)升高，表明該基因響應(yīng)鹽堿逆境。

圖4 AfWRKY42基因鹽堿脅迫的表達(dá)特性A.在150 mmol·L?1 NaCl 脅迫處理下AfWRKY42 基因紫穗槐葉的相對(duì)表達(dá)模式；B.葉的相對(duì)表達(dá)模式；C.在30 mmol·L?1 NaHCO3脅迫處理下AfWRKY42 基因紫穗槐根的相對(duì)表達(dá)模式；D.葉的相對(duì)表達(dá)模式；*和**分別表示不同脅迫時(shí)間的相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組之間在P<0.05和P<0.01水平上差異顯著；數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差，下同F(xiàn)ig.4 Expression characteristics of AfWRKY42 gene under saline stress A.Relative expression pattern of AfWRKY42 gene in Sophora japonica leaves under 150 mmol·L?1 NaCl stress treatment；B.Relative expression of AfWRKY42 in leaves；C.Relative expression pattern of AfWRKY42 gene in roots of Sophora japonica under 30 mmol·L?1 NaHCO3 stress treatment；D.Relative expression patterns of leaves* and ** indicate significant differences in relative expression between different stress times and the control at the P<0.05 and P<0.01 levels，respectively；Data are mean±standard error，the same as below

2.2.3 AfWRKY42蛋白的亞細(xì)胞定位驗(yàn)證

以克隆AfWRKY42基因編碼蛋白的氨基酸為基礎(chǔ)，在線選擇植物蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)，初步預(yù)測(cè)結(jié)果：定位在細(xì)胞核中為主，其概率為65.0%，在微體中的概率為10.0%，在線粒體基質(zhì)中概率為10.0%，在細(xì)胞膜中的概率為0。在Olympus 熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)化的擬南芥原生質(zhì)體細(xì)胞的壓片，檢測(cè)到35S：：AfWRKY42：：GFP 融合后綠色熒光蛋白在細(xì)胞核中呈現(xiàn)綠色熒光表達(dá)（圖5），展示其融合蛋白的細(xì)胞核定位，表明AfWRKY42 是定位在細(xì)胞核的轉(zhuǎn)錄因子，其發(fā)揮功能的場(chǎng)所在細(xì)胞核。這與上述PSORT軟件預(yù)測(cè)的亞細(xì)胞位置為細(xì)胞核的高概率相一致，表明AfWRKY42 轉(zhuǎn)錄蛋白在細(xì)胞核中發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的作用。

圖5 AfWRKY42蛋白在擬南芥原生質(zhì)體中的亞細(xì)胞定位A.35S：：GFP的綠色熒光蛋白；B.明場(chǎng)；C.合并圖；D.35S：：AfWRKY42：：GFP的綠色熒光蛋白；E.明場(chǎng)；F.合并圖Fig.5 Subcellular localization of AfWRKY42 protein in Arabidopsis protoplasts A.Green fluorescent protein；B.Bright field；C.Merge of 35S：：GFP；D.Green fluorescent protein；E.Bright field；F.Merge of 35S：：GFP Of 35S：：Af?WRKY42：：GFP

2.3 過(guò)表達(dá)AfWRKY42基因煙草的鑒定

為了鑒定目的基因的功能而轉(zhuǎn)化本氏煙草，將野生型煙草（WT）作為陰性對(duì)照，PBI121：：Af?WRKY42：：GFP質(zhì)粒作為陽(yáng)性對(duì)照，PCR 檢測(cè)Kana抗性的再生植株的基因組整合結(jié)果（圖6A），只有陰性對(duì)照沒(méi)有擴(kuò)增出條帶，轉(zhuǎn)基因煙草條帶大小與質(zhì)粒的一致，說(shuō)明AfWRKY42整合到煙草基因組DNA 上。轉(zhuǎn)AfWRKY42基因植株有與陽(yáng)性對(duì)照相同的DNA，表明獲轉(zhuǎn)基因株系。在經(jīng)過(guò)2 代篩選后獲得T3 代的陽(yáng)性植株，qRT-PCR 分析表明，轉(zhuǎn)AfWRKY42的T3#1，#4，#5 植株表現(xiàn)出更高的表達(dá)量（圖6B），獲得過(guò)表達(dá)的#1，#4，#5 株系作為后期脅迫的試驗(yàn)材料。

圖6 轉(zhuǎn)AfWRKY42基因煙草的鑒定A.AfWRKY42基因整合的PCR 檢測(cè)（M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)；CK+.陽(yáng)性對(duì)照；CK－.陰性對(duì)照；1～4.T0代不同轉(zhuǎn)基因株系）；B.AfWRKY42轉(zhuǎn)基因煙草相對(duì)表達(dá)量（WT.野生型植株；#1～#5.轉(zhuǎn)基因植株）；*和**分別表示轉(zhuǎn)基因株系與WT之間在P<0.05和P<0.01水平上差異顯著；下同F(xiàn)ig.6 Identification of transgenic tobacco with AfWRKY42 gene A.PCR identification of AfWRKY42 transgenic tobacco（M.Marker；CK+.Positive control；CK－.Negative control；1?4.T0 generations of different trans?genic lines）；B.AfWRKY42 transgenic tobacco relative expression analysis（WT.Wild-type plants；#1～#5.Transgenic plants）；The relative expres?sions are at the **P<0.01 level；The standard error of three biological replicates；* and ** indicate significant differences between transgenic strains and WT at the P<0.05 and P<0.01 levels，respectively，as follows；the same as below

2.4 過(guò)表達(dá)AfWRKY42煙草對(duì)鹽堿脅迫的耐性

對(duì)轉(zhuǎn)AfWRKY42基因煙草進(jìn)行200、300 mmol·L?1NaCl的鹽脅迫處理后，從植物表型上看，植株葉片明顯萎蔫變黃，野生型更為嚴(yán)重（圖7A）；取3片葉進(jìn)行葉綠素?zé)晒鈾z測(cè)（圖7B），對(duì)最大光量子效率（Fv/Fm）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，葉片從上到下Fv/Fm逐漸升高，而且轉(zhuǎn)基因株系的明顯高于對(duì)照組WT葉片的Fv/Fm（圖7D）；對(duì)其葉綠素含量測(cè)定的結(jié)果同樣也呈現(xiàn)比對(duì)照升高的趨勢(shì)（圖7C）。轉(zhuǎn)AfWRKY42基因煙草的Fv/Fm和葉綠素含量顯著高于WT，表明轉(zhuǎn)化AfWRKY42煙草對(duì)鹽脅迫的耐性高于WT。

圖7 鹽（NaCl）脅迫對(duì)轉(zhuǎn)AfWRKY42基因煙草影響A.植株表型；B.葉綠素?zé)晒?；C.葉綠素含量；D.最大光量子效率（Fv/Fm）Fig.7 Effect of salt（NaCl）stress on transgenic tobacco with AfWRKY42 gene A.Plant phenotype；B.Chlorophyll fluorescence；C.Chlorophyll content；D.Maximum light quantum efficiency（Fv/Fm）

轉(zhuǎn)AfWRKY42基因煙草分別在300、400 mmol·L?1NaHCO3處理第7天時(shí)，表型出現(xiàn)明顯差異（圖8A），野生型植株明顯枯萎，熒光檢測(cè)同樣可以看出轉(zhuǎn)基因植株與WT 之間的差異（圖8B）。檢測(cè)到轉(zhuǎn)基因植株葉綠素和最大光量子效率（Fv/Fm）高于WT（圖8C～D），表明過(guò)表達(dá)植株的光合作用強(qiáng)于WT，WT受NaHCO3脅迫的傷害比轉(zhuǎn)基因的大，轉(zhuǎn)基因#4株系抗性最為明顯，表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐堿性鹽的特性。

圖8 轉(zhuǎn)AfWRKY42基因煙草對(duì)NaHCO3脅迫的耐性A.植株表型；B.葉綠素?zé)晒?；C.葉綠素含量；D.最大光量子效率（Fv/Fm）Fig.8 Tolerance of transgenic tobacco with AfWRKY42 to NaHCO3 stress A.Plant phenotype；B.Chlorophyll fluorescence；C.Chlorophyll content；D.Maximum light quantum efficienc（yFv/Fm）

3 討論

紫穗槐作為公路和斜坡保護(hù)的重要樹(shù)種，在中國(guó)東北廣泛種植。研究表明紫穗槐幼苗以生理調(diào)節(jié)的適應(yīng)性機(jī)制來(lái)抵御逆境脅迫，是抗鹽性較強(qiáng)的物種。此外，WRKY 轉(zhuǎn)錄因子是植物在非生物逆境脅迫的抗逆調(diào)節(jié)蛋白。WRKY TFs 廣泛參與植物發(fā)育及各種生物/非生物脅迫反應(yīng)［22］，本研究檢測(cè)紫穗槐中AfWRKY42基因在嫩莖的表皮中表達(dá)量最高，隨著鹽（NaCl）脅迫的時(shí)間延長(zhǎng)而表達(dá)量呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)，堿性鹽（NaHCO3）脅迫誘導(dǎo)增加更加顯著，與AtWRKY11和AtWRKY17基因受鹽脅迫處理影響，表達(dá)量上調(diào)相同，表現(xiàn)出抗逆性基因的特點(diǎn)［23］，推測(cè)AfWRKY42基因可能是抗鹽堿性的調(diào)節(jié)基因。

為了進(jìn)一步研究AfWRKY42 轉(zhuǎn)錄因子的抗鹽堿性調(diào)節(jié)功能，本研究克隆了AfWRKY42基因，生物信息分析印證它在210～270 氨基酸處有1 個(gè)WRKY 結(jié)構(gòu)域，屬于WRKY 蛋白家族IIb 亞家族［24］的疏水蛋白，而且是與木豆的WRKY47、藜豆的WRKY42 蛋白序列親緣關(guān)系最接近的轉(zhuǎn)錄因子。亞細(xì)胞定位與蛋白質(zhì)的功能有著非常重要的聯(lián)系，蛋白質(zhì)在細(xì)胞中的正確定位是細(xì)胞系統(tǒng)高度有序運(yùn)轉(zhuǎn)的前提保證。通過(guò)AfWRKY42蛋白氨基酸的組成預(yù)測(cè)在細(xì)胞核的概率最大；本研究還通過(guò)轉(zhuǎn)化的擬南芥原生質(zhì)體細(xì)胞檢測(cè)，觀察到Af?WRKY42-GFP 融合綠色熒光蛋白在細(xì)胞核，表明AfWRKY42 在細(xì)胞核發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子功能，與前人研究的轉(zhuǎn)錄因子在細(xì)胞核行使作用位置［25］相同。為了在植物中探究AfWRKY42響應(yīng)鹽堿脅迫的功能作用，本研究在異源植物本氏煙草過(guò)表達(dá)Af?WRKY42基因（圖6），鹽（NaCl）堿（NaHCO3）的脅迫處理后，植株葉片明顯萎蔫變黃，而野生型更為嚴(yán)重，并且檢測(cè)到葉片的葉綠素?zé)晒獾腇v/Fm和生理上的葉綠素含量都是轉(zhuǎn)基因株系明顯高于對(duì)照組WT。目前，研究植物響應(yīng)鹽脅迫的生長(zhǎng)、形態(tài)和光合作用，顯示在鹽脅迫的耐鹽性與Fv/Fm相關(guān)，反應(yīng)光合作用調(diào)節(jié)而體現(xiàn)耐鹽堿生理特性。過(guò)表達(dá)AfWRKY42植株的光合作用強(qiáng)于WT，受鹽堿處理引起的傷害比WT株系的小，表現(xiàn)較強(qiáng)的耐鹽堿的特性，對(duì)響應(yīng)鹽堿脅迫能夠發(fā)揮重要抵御性調(diào)節(jié)作用。總而言之，本研究揭示AfWRKY42基因響應(yīng)鹽堿脅迫提高植物的耐受性，可能是調(diào)節(jié)紫穗槐的葉綠素合成，從而影響光合作用以賦予對(duì)鹽堿或其他非生物脅迫抗性的基因。