徐 磊 胥 曉 劉沁松

（西華師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，西南野生動(dòng)植物資源保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南充 637009）

土壤鹽漬化是制約現(xiàn)代農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)的主要脅迫因子之一，鹽漬土在我國(guó)分布廣泛，且其面積仍在不斷擴(kuò)大［1］。高鹽環(huán)境會(huì)對(duì)植物產(chǎn)生離子毒害和滲透脅迫，造成植物體內(nèi)活性氧過度積累、光合效率下降、水分虧缺、蛋白質(zhì)和細(xì)胞器受到損傷，導(dǎo)致植物生長(zhǎng)受到抑制并加速衰老，嚴(yán)重影響了植物的生存［1-2］。因此，提高植物的耐鹽性，有效利用鹽漬荒地并發(fā)掘其巨大潛力具有重要意義。

珙桐（Davidia involucrata）是我國(guó)特有的第三紀(jì)孑遺珍稀樹種，有植物界的“活化石”之稱，屬國(guó)家一級(jí)保護(hù)植物。此外，珙桐具有極高的觀賞價(jià)值，在國(guó)際上享有“中國(guó)鴿子樹”的美譽(yù)，可作為園林綠化珍貴樹種［3-4］。目前關(guān)于珙桐的研究主要集中于群落學(xué)、繁殖技術(shù)、生物學(xué)特性等方面［5-7］，在引種馴化方面的研究并不多。研究表明，珙桐不耐鹽脅迫［8］，因此土壤鹽漬化制約了珙桐資源的有效保護(hù)及在園林綠化等領(lǐng)域中的廣泛應(yīng)用。

水楊酸（SA）是一種簡(jiǎn)單酚類物質(zhì)，它作為植物激素信號(hào)分子在調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育和脅迫抗性中起關(guān)鍵作用。近年來大量證據(jù)表明，外源SA 可緩解鹽脅迫對(duì)植物造成的危害，其機(jī)制主要包括誘導(dǎo)逆境相關(guān)基因的表達(dá)、激活抗氧化防御系統(tǒng)、提高光合能力、調(diào)節(jié)離子吸收與分布及同其他激素或信號(hào)分子交互作用等［9-10］。在誘導(dǎo)逆境抗性方面，SA 具有高效、綠色環(huán)保和低成本等諸多優(yōu)點(diǎn)，因此在農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)中具有廣闊的應(yīng)用前景。然而外源SA 對(duì)鹽脅迫下珙桐抗逆生理及基因表達(dá)的影響目前尚未見報(bào)道。本研究以1 年生珙桐幼苗為材料，進(jìn)行外源SA 和NaCl 脅迫處理，從葉片膜脂過氧化、抗氧化系統(tǒng)及轉(zhuǎn)錄組變化等角度，探討SA 調(diào)控珙桐耐鹽性的生理及分子機(jī)制，以期為珙桐作為園林綠化樹種在城市鹽漬化土壤中種植提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料及處理

1年生珙桐幼苗種植于裝有沙、蛭石和營(yíng)養(yǎng)土（體積比1∶1∶1）的圓柱形塑料花盆中。前期珙桐幼苗鹽脅迫預(yù)試驗(yàn)結(jié)果表明，150 mmol·L?1的NaCl溶液既可顯著抑制珙桐幼苗生長(zhǎng)，又不會(huì)造成幼苗死亡，故選取該濃度的NaCl 溶液用于鹽脅迫處理。將2 mmol·L?1的SA 均勻噴施在珙桐葉片上、下表面，以相同劑量的蒸餾水作為對(duì)照。第1 次SA 處理結(jié)束2 d 后，開始澆施NaCl 溶液并同時(shí)進(jìn)行SA噴施處理（當(dāng)天為鹽脅迫第1天），每2 d處理1 次。最終形成4 組試驗(yàn)處理：（1）CK，對(duì)照組（蒸餾水+無鹽脅迫）；（2）T1，SA 處理組（SA+無鹽脅迫）；（3）T2，NaCl 處理組（蒸餾水+鹽脅迫）；（4）T3，SA+NaCl 處理組（SA+鹽脅迫），每組3 次重復(fù)。在鹽脅迫第14 天，T2 組植株生長(zhǎng)較差，T3 組植株生長(zhǎng)得到緩解，T2 組與T3 組植株生長(zhǎng)狀態(tài)有明顯差異，故在鹽脅迫第14 天采樣用于各項(xiàng)生理指標(biāo)測(cè)定及轉(zhuǎn)錄組分析。

1.2 珙桐葉片生理生化指標(biāo)的測(cè)定

通過打孔器打取10個(gè)葉圓片，放入試管中，加入10 mL去離子水，在室溫條件下浸泡4 h，期間搖動(dòng)3～5次，使用電導(dǎo)率儀（雷磁DDS-307A，上海）測(cè)定電導(dǎo)率L1。將試管在沸水浴中放置20 min，待冷卻至室溫后測(cè)定電導(dǎo)率L2。相對(duì)電導(dǎo)率按以下公式（L0為去離子水的電導(dǎo)率）進(jìn)行計(jì)算：相對(duì)電導(dǎo)率=（L1?L0）/（L2?L0）×100%。珙桐葉片相對(duì)含水量的測(cè)定采用高俊鳳的方法［11］。丙二醛（MDA）含量、超氧陰離子（O??2）產(chǎn)生速率、H2O2含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性、過氧化物酶（POD）活性、抗壞血酸過氧化物酶（APX）活性和谷胱甘肽（GSH）含量均采用試劑盒（蘇州科銘生物技術(shù)有限公司）進(jìn)行測(cè)定。

1.3 珙桐葉片的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

總RNA 的提取與檢測(cè)參照Liu 等［4］的方法。由北京諾禾致源生物信息科技有限公司完成cD?NA 文庫(kù)構(gòu)建和Illumina 測(cè)序。對(duì)得到的原始測(cè)序數(shù)據(jù)（raw reads）進(jìn)行質(zhì)控，獲得高質(zhì)量有效測(cè)序數(shù)據(jù)（clean reads）。使用HiSat2軟件將clean reads 比對(duì)到珙桐參考基因組上［12］。利用DESeq2 進(jìn)行基因表達(dá)差異分析，將T3 組（SA+NaCl 處理組）與T2組（NaCl 處 理 組）進(jìn) 行 比 較，以padj<0.05 且|log2FoldChange|>1 為閾值篩選差異表達(dá)基因（DEGs）。使用clusterProfiler 軟件對(duì)獲得的DEGs進(jìn)行KEGG通路富集分析。

1.4 基因表達(dá)的qRT-PCR驗(yàn)證

以分別提取的T2 組（NaCl 處理組）和T3 組（SA+NaCl 處理組）葉片RNA 為模板，使用Prime?ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser 試劑盒（TaKaRa）合成cDNA。qRT-PCR 在實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（Bio-Rad CFX96，USA）上進(jìn)行，采用TB Green?Premix Ex TaqTMⅡ（Tli RNaseH Plus）試劑盒（TaKaRa）檢測(cè)基因表達(dá)水平，所用引物見表1。以DiUBQ為內(nèi)參基因?；虻南鄬?duì)表達(dá)量采用2?ΔΔCt方法計(jì)算。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物Table 1 Primer sequences for qRT-PCR

1.5 數(shù)據(jù)分析

圖中數(shù)值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。采用IBM SPSS Statistics 22 分別對(duì)各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行單因素方差分析，檢驗(yàn)鹽脅迫和外源SA 處理對(duì)相對(duì)電導(dǎo)率、相對(duì)含水量、抗氧化酶（SOD、POD、APX）活性、GSH含量、MDA 含量和ROS（H2O2、O??2）積累的影響。采用Duncan’s 多重比較檢驗(yàn)不同處理間的差異（P<0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 SA緩解珙桐幼苗鹽脅迫的最適濃度

相對(duì)電導(dǎo)率是反映植物細(xì)胞膜透性的關(guān)鍵指標(biāo)。如圖1 所示，NaCl 處理導(dǎo)致珙桐幼苗葉片的相對(duì)電導(dǎo)率大幅上升，達(dá)到40.02%。不同濃度（0.5、1.0、2.0、3.0 mmol·L?1）SA 處理均顯著抑制了相對(duì)電導(dǎo)率的升高（P<0.05），特別是SA 濃度為2.0 mmol·L?1時(shí)珙桐葉片在鹽脅迫下的相對(duì)電導(dǎo)率最低，為33.95%。這些結(jié)果表明，噴施SA 能在鹽脅迫下保護(hù)細(xì)胞膜的完整性，其中2.0 mmol·L?1SA 保護(hù)效果最佳，能誘導(dǎo)較高的耐鹽性，因此在后續(xù)試驗(yàn)中使用該濃度。

圖1 不同濃度的SA 對(duì)鹽脅迫條件下珙桐葉片相對(duì)電導(dǎo)率的影響CK.噴施蒸餾水+無鹽脅迫；N.噴施蒸餾水+鹽脅迫；N0.5.噴施0.5 mmol·L?1 SA+鹽脅迫；N1.噴施1.0 mmol·L?1 SA+鹽脅迫；N2.噴施2.0 mmol·L?1 SA+鹽脅迫；N3.噴施3.0 mmol·L?1 SA+鹽脅迫；字母不同表示差異顯著（P<0.05）；下同F(xiàn)ig.1 Effects of SA at different concentrations on relative electrolyte leakage of D. involucrata leaves under salt stress.CK.Water with no salt；N.Water with salt；N0.5.0.5 mmol·L?1 SA with salt；N1.1.0 mmol·L?1 SA with salt；N2.2.0 mmol·L?1 SA with salt；N3.3.0 mmol·L?1 SA with salt；Different letters indicated significant difference（sP<0.05）；the same as below

2.2 鹽脅迫下SA 對(duì)珙桐幼苗葉片相對(duì)含水量和膜脂過氧化程度的影響

與對(duì)照（CK）相比，NaCl 處理（T2）導(dǎo)致珙桐幼苗葉片相對(duì)含水量減少29.00%。施用SA 提高了鹽脅迫條件下珙桐幼苗葉片的相對(duì)含水量，SA+NaCl 處理（T3）下相對(duì)含水量較NaCl 處理（T2）增加17.17%（圖2A）。

圖2 SA 對(duì)鹽脅迫條件下珙桐葉片相對(duì)含水量（A）、丙二醛質(zhì)量摩爾濃度（B）、H2O2質(zhì)量摩爾濃度（C）和O·?2產(chǎn)生速率（D）的影響Fig.2 Effects of SA on relative water content（A），MDA content（B），H2O2 content（C），and O·?2 production rate（D）of D. involucrata leaves under salt stress

MDA 是膜脂過氧化的主要產(chǎn)物，NaCl 處理（T2）導(dǎo)致珙桐幼苗葉片中MDA 含量較CK 大幅增加，是CK 的2.26 倍。SA+NaCl 處理（T3）下MDA含量比T2減少了46.56%（圖2B）。噴施SA抑制了鹽脅迫下活性氧（ROS）的積累，SA+NaCl 處理組（T3）中H2O2含量和超氧陰離子（O??2）產(chǎn)生速率較NaCl處理組（T2）分別減少了16.67%和38.43%（圖2C～D）。

2.3 鹽脅迫下SA 對(duì)珙桐葉片抗氧化酶活性和抗氧化劑含量的影響

SOD、POD 和APX 是植物活性氧清除系統(tǒng)的重要酶類。與對(duì)照（CK）相比，SA 處理（T1）下珙桐葉片SOD 活性無顯著變化，POD 和APX 活性則顯著增加（圖3A～C）。NaCl 處理組（T2）的SOD、POD和APX 活性比CK 分別升高了51.13%、126.88%和29.22%。SA+NaCl 處 理組（T3）中SOD、POD 和APX活性進(jìn)一步升高，分別是T2的1.63倍、1.45倍和1.19倍。GSH是植物細(xì)胞重要的抗氧化劑，SA+NaCl 處理組（T3）中GSH 含量比NaCl 處理組（T2）增加了13.35%（圖3D）。

圖3 SA對(duì)鹽脅迫條件下珙桐葉片SOD活性（A）、POD活性（B）、APX活性（C）和GSH含量（D）的影響Fig.3 Effects of SA on SOD activity（A），POD activity（B），APX activity（C）and GSH content（D）of D.involucrata leaves under salt stress

2.4 SA誘導(dǎo)珙桐葉片響應(yīng)鹽脅迫的轉(zhuǎn)錄組變化

對(duì)NaCl 處理組（T2）和SA+NaCl 處理組（T3）進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，獲得了43 032 288～48 470 032的clean reads，GC 含量在43.91%～44.77%，Q30堿基比例均大于91%（表2），測(cè)序質(zhì)量較高可用于基因表達(dá)分析。對(duì)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)一步分析，共篩選得到2 581 個(gè)DEGs（圖4A）。與NaCl 處理組（T2）相比，SA+NaCl 處理組（T3）導(dǎo)致了珙桐葉片中1 516個(gè)基因上調(diào)表達(dá)，1 065 個(gè)基因下調(diào)表達(dá)（圖4A）。已有研究表明，外源SA 可通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)來增強(qiáng)植物耐鹽性［13］。因此利用qRT-PCR 對(duì)4個(gè)差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子DiWRKY40（Dinv11674）、DiNAC25（Dinv14675）、DiMYB4（Dinv27051）和Di?MYB86（Dinv38547）進(jìn)行表達(dá)量檢測(cè)。如圖4B 所示，這4 個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)特征與測(cè)序結(jié)果一致。

圖4 差異表達(dá)基因數(shù)量和qRT-PCR驗(yàn)證Fig.4 Number of DEGs and verification by qRT-PCR

表2 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序質(zhì)量Table 2 Evaluation of transcriptome sequencing data

差異表達(dá)基因的KEGG 分析表明，苯丙烷類生物合成、氰基氨基酸代謝、二萜生物合成、α-亞麻酸代謝、苯丙氨酸代謝、油菜素甾醇生物合成、光合作用?天線蛋白、類黃酮生物合成、玉米素生物合成9 條代謝通路發(fā)生顯著變化（表3）。其中，注釋到苯丙烷類生物合成途徑的DEGs 最多（43 個(gè)），包 括34 個(gè) 上 調(diào)DEGs 和9 個(gè) 下 調(diào)DEGs（表4）。

表3 差異表達(dá)基因的KEGG分析Table 3 KEGG analysis of DEGs

表4 注釋到苯丙烷類生物合成途徑的差異表達(dá)基因Table 4 DEGs annotated to phenylpropanoid biosynthetic pathways

此外，對(duì)上調(diào)和下調(diào)表達(dá)基因分別進(jìn)行KEGG通路富集分析。上調(diào)基因顯著富集于10條代謝通路，包括苯丙烷類生物合成、二萜生物合成、氰基氨基酸代謝、光合作用?天線蛋白、α-亞麻酸代謝、淀粉和蔗糖代謝、油菜素甾醇生物合成、苯丙氨酸代謝、角質(zhì)、木栓質(zhì)和蠟生物合成以及植物?病原互作（表5）。在本研究中，下調(diào)基因沒有顯著富集到KEGG通路。

表5 上調(diào)表達(dá)基因的KEGG分析Table 5 KEGG analysis of up-regulated DEGs

3 討論

在植物體內(nèi)，ROS 的產(chǎn)生和消除在正常條件下處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)；鹽脅迫下，該平衡被打破，ROS 過量積累，引起膜脂過氧化作用，膜結(jié)構(gòu)遭到破壞，導(dǎo)致膜內(nèi)電解質(zhì)外滲［14］。劉慶等［15］研究發(fā)現(xiàn)，NaCl 處理導(dǎo)致棉花（Gossypium hirsutum）幼苗葉片中O??2產(chǎn)生速率和H2O2含量顯著增加，外源施加SA 可有效抑制鹽脅迫下ROS 的積累。與這一結(jié)果類似，本研究發(fā)現(xiàn)珙桐葉片中H2O2含量和O??2產(chǎn)生速率在鹽脅迫下大幅增加，施用SA 顯著降低了鹽脅迫下H2O2含量和O??2產(chǎn)生速率。同時(shí)，外源SA 使鹽脅迫下珙桐葉片相對(duì)電導(dǎo)率和MDA 含量顯著降低，這一結(jié)果與付乃鑫等［16］對(duì)冬小麥（Triti?cum aestivum）幼苗的研究相符。這些結(jié)果表明，施用SA 能使ROS 處于相對(duì)較低的水平，并抑制膜脂過氧化，維系膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，進(jìn)而緩解鹽脅迫對(duì)珙桐幼苗的傷害。SOD 是植物抗氧化防御系統(tǒng)的第一道防線，可催化歧化反應(yīng)使O??2轉(zhuǎn)化為H2O2和O2，而H2O2又可被POD 和APX 等酶分解為H2O 和O2［17］。除了抗氧化酶以外，植物還利用GSH 等抗氧化劑保護(hù)細(xì)胞免遭氧化損傷［14］。本試驗(yàn)中，鹽脅迫導(dǎo)致SOD、POD 和APX 活性以及GSH 含量升高，推測(cè)鹽脅迫下ROS 的積累誘導(dǎo)了這些抗氧化酶和抗氧化劑的合成。施用SA 進(jìn)一步提高了鹽脅迫下這3 種酶活性以及GSH 含量，使其協(xié)同作用清除ROS，從而緩解了高鹽環(huán)境導(dǎo)致的氧化損傷。與本試驗(yàn)結(jié)果一致，趙寶泉等［18］研究發(fā)現(xiàn)噴施SA 提高了鹽脅迫下杭白菊（Chrysanthemum morifolium）幼苗SOD、POD 和APX 活性，Li 等［19］研究表明在鹽脅迫下外源SA 處理使小麥幼苗GSH含量增加。綜上，外源SA 可通過提高珙桐幼苗抗氧化酶活性和GSH 含量，抑制MDA 和ROS 的積累，進(jìn)而增強(qiáng)珙桐幼苗的耐鹽性。

本研究進(jìn)一步利用比較轉(zhuǎn)錄組分析了施用SA 對(duì)鹽脅迫下珙桐幼苗葉片基因表達(dá)的影響，在轉(zhuǎn)錄水平上探討了外源SA 的作用機(jī)制。結(jié)果表明，在鹽脅迫條件下，大量珙桐基因的表達(dá)受到SA 的調(diào)控。植物轉(zhuǎn)錄因子在逆境信號(hào)傳遞中起關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用，能調(diào)控一系列抗逆相關(guān)基因的表達(dá)，從而影響植物的逆境生理［20］。在本研究中，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和qRT-PCR 分析表明，外源SA 顯著提高了鹽脅迫下DiWRKY40、DiNAC25、DiMYB4和Di?MYB86等轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)。這些轉(zhuǎn)錄因子的同源基因已，報(bào)道可正向調(diào)控植物耐鹽性：過表達(dá)金桔（Fortunella crassifolia）FcWRKY40增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因煙草（Nicotiana nudicaulis）和檸檬（Citrus lemon）的耐鹽性，而沉默F(xiàn)cWRKY40導(dǎo)致金桔植株對(duì)鹽脅迫更敏感［21］；過表達(dá)山定子（Malus baccata）MbNAC25的擬南芥（Arabidopsis thaliana）表現(xiàn)為更強(qiáng)的耐鹽性［22］；過表達(dá)蘋果（Malus domestica）MdMYB4可提高蘋果愈傷組織的耐鹽性［23］；過表達(dá)TaMYB86B的轉(zhuǎn)基因小麥的耐鹽性得到提高［24］。因此，外源SA 可能通過調(diào)控這些珙桐轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)來緩解鹽脅迫。

苯丙烷代謝是植物主要的次生代謝途徑之一，在植物生長(zhǎng)發(fā)育以及抵御各種脅迫時(shí)發(fā)揮重要作用［25］。在本研究中，外源SA 激活了鹽脅迫下珙桐苯丙烷類生物合成途徑。與這一結(jié)果類似，施用褪黑素提高了珙桐幼苗的耐旱性，同時(shí)苯丙烷類生物合成被激活［4］。苯丙氨酸解氨酶（PAL）是苯丙烷類代謝的關(guān)鍵酶，在植物木質(zhì)化過程和抗逆境脅迫等方面至關(guān)重要［25］。在本研究中，3個(gè)PAL基因表達(dá)量均升高。其余與木質(zhì)素合成相關(guān)的基因大部分都上調(diào)表達(dá)，如4CL（4-coumarate-CoA ligase 2）、HCT（Shikimate O-hydroxycinnamoyl?transferase）、CCoAOMT（Caffeoyl-CoA O-methyltrans?ferase）、COMT（Caffeic acid 3-O-methyltransferase）和POD（Peroxidase）。已有研究表明，木質(zhì)化是植物抵御鹽脅迫的重要機(jī)制［26-27］，因此外源SA 可能通過上調(diào)木質(zhì)素合成基因的表達(dá)來促進(jìn)木質(zhì)素合成，從而增強(qiáng)珙桐幼苗的耐鹽性。此外，在苯丙烷類生物合成途徑中，檢測(cè)到15 個(gè)BGlu（Beta-gluco?sidase）基因差異表達(dá)，并且大部分BGlu基因都上調(diào)表達(dá)。BGlu基因被證明能通過積累具有抗氧化活性的黃酮醇類化合物進(jìn)而正向調(diào)控植物對(duì)高鹽、UV-B、脫水等多個(gè)脅迫的耐受性［28］，因此推測(cè)BGlu基因可能在SA 介導(dǎo)的耐鹽性中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

4 結(jié)論

施用2.0 mmol·L?1的SA 可顯著降低鹽脅迫下珙桐幼苗葉片的相對(duì)電導(dǎo)率，提高相對(duì)含水量，減小膜脂過氧化程度，抑制ROS積累，提高抗氧化酶SOD、POD、APX 活性和抗氧化劑GSH 含量；通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)噴施SA 導(dǎo)致鹽脅迫下2 581 個(gè)珙桐基因表達(dá)發(fā)生變化，其中1 516 個(gè)上調(diào)表達(dá)，1 065 個(gè)下調(diào)表達(dá)；在鹽脅迫下，外源SA 能激活苯丙烷類生物合成途徑，并誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子基因DiWRKY40、DiNAC25、DiMYB4和DiMYB86的表達(dá)。