鄭 晟 高海霞 蘇 敏 盧尚歡 張騰國 武國凡

（1.西北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，蘭州 730070；2.青海師范大學(xué)高原科學(xué)與可持續(xù)發(fā)展研究院，西寧 810016）

K+/H+反向轉(zhuǎn)運蛋白（KEAs）是H+耦合的協(xié)同轉(zhuǎn)運蛋白，其功能是通過膜轉(zhuǎn)移K+以交換質(zhì)子（H+）［1-4］。擬南芥（Arabidopsis thaliana）中KEA 基因家族包括6 個成員，即AtKEA1（At1g01790）、At?KEA2（At4g00630）、AtKEA3（At4g04850）、AtKEA4（At2g19600）、AtKEA5（At5g51710）和AtKEA6（At5g11800）［5-6］。根據(jù)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，At?KEAs基因家族分為2 個分支，第1 個分支是At?KEA1～3，第2 個分支是AtKEA4～6。擬南芥KEA1和KEA2定位于葉綠體內(nèi)膜，它們具有很高的氨基酸序列相似度（84.5%）［2］，其中N-端結(jié)構(gòu)域決定其亞細胞定位，并且正確的亞細胞定位對于AtKEA1和AtKEA2 生物學(xué)功能的執(zhí)行非常重要［7］。當(dāng)KEA1 和KEA2 功能缺失時，其突變體葉片的葉綠體結(jié)構(gòu)腫脹，包膜受損，類囊體密度降低，從而導(dǎo)致光合作用效率降低［8］。這表明AtKEA1 和At?KEA2在調(diào)節(jié)葉綠體內(nèi)K+動態(tài)平衡和pH 平衡中發(fā)揮重要功能［8-9］。

葉綠體中光合作用產(chǎn)生的蔗糖是植物重要的能量來源。蔗糖既是營養(yǎng)物質(zhì)，也是信號分子。內(nèi)源蔗糖通過激活或抑制光合作用來調(diào)節(jié)體內(nèi)的蔗糖水平。低濃度的蔗糖激活光合作用和光合產(chǎn)物的運輸，而高濃度的蔗糖促進光合產(chǎn)物的儲藏［10］。此外，在外源添加蔗糖的條件下，植物選擇性地激活或者抑制相關(guān)基因的表達以更有效和精細的方式進行生長發(fā)育和代謝。有研究發(fā)現(xiàn)，外源施加50 g·L?1蔗糖可以增加桃子（Prunus persica）根系的總體積和總表面積，促進側(cè)根的數(shù)量和生長，并促進SnRK1的活性；外源海藻糖的施用會抑制植物的根系生長，蔗糖處理可以逆轉(zhuǎn)海藻糖對SnRK1 酶活性和根系生長的抑制作用［11］。另外，蔗糖與植物激素信號途徑具有交聯(lián)作用，如蔗糖與ABA 參與種子或者果實的成熟過程［12］；植物的根尖是生長素合成的主要器官，蔗糖的含量水平與生長素的合成轉(zhuǎn)運密切相關(guān)［13］；蔗糖和乙烯含量或信號途徑存在負調(diào)控［5］；細胞分裂素能夠調(diào)節(jié)蔗糖的代謝等［14］。

目前，定位于葉綠體的鉀離子轉(zhuǎn)運蛋白參與植物根系生長發(fā)育的研究鮮有報道；鉀離子反向轉(zhuǎn)運體介導(dǎo)蔗糖代謝及信號網(wǎng)的功能也未見相關(guān)研究。此外，對于KEA 基因家族生物學(xué)功能及其分子機制的探究還處于起步階段，因此，進一步挖掘KEA 基因家族各成員的生物學(xué)功能，將有助于深入了解鉀離子及pH 平衡在光合作用乃至生長發(fā)育中的生理與分子機制。

本研究采用植物生理學(xué)、生物化學(xué)以及分子生物學(xué)等技術(shù)方法，利用擬南芥KEA 功能缺失突變體，研究擬南芥KEA1 與KEA2 在外源蔗糖應(yīng)答中的生理作用及其相關(guān)機制，進一步揭示植物KEA 轉(zhuǎn)運蛋白的生物學(xué)功能，闡明外源蔗糖對植物離子轉(zhuǎn)運蛋白的作用機理，為植物抵御逆境以及揭示植物生長發(fā)育規(guī)律奠定新的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料和生長條件

擬南芥野生型（Col-0）由西北師范大學(xué)生理生化與分子生物學(xué)實驗室保存，kea1（SAIL_586_D02）和kea2（SALK_096774）的T-DNA 插入突變體從擬南芥生物資源中心（ABRC）訂購。kea1kea2雙敲除突變體是通過將kea1與kea2遺傳雜交產(chǎn)生。利用SIGnAL 網(wǎng)站設(shè)計的等位基因特異性引物進行PCR 篩選，確定純合突變株系（http：//signal.salk.edu）。

培養(yǎng)皿中生長的幼苗，種子在體積分數(shù)20%次氯酸鈉中消毒10 min，然后用無菌去離子水沖洗5 次。將無菌種子種在pH 為5.7～5.8 的Murashige-Skoog（MS）培養(yǎng)基上，在4 ℃黑暗中春化3 d 后，將幼苗放置于培養(yǎng)箱中22 ℃、光照16 h/黑暗8 h 的周期下垂直生長10 d，光照強度為100 μmol·m?2·s?1。

1.2 碘化丙啶（PI）染色

PI 染料可以使細胞壁著色而凸顯根的結(jié)構(gòu)。取培養(yǎng)10 d 的擬南芥幼苗根系浸入10 μg·mL?1PI染液，孵育3 min，用ddH2O 清洗3 次，制片后在激光共聚焦顯微鏡（Leica SP8，德國）下觀察。

1.3 組織化學(xué)染色

用硝基藍四氮唑（NBT）染色法檢測植物葉片中超氧陰離子（O·?2）的分布。將幼苗放入0.5 mg·mL?1的NBT 溶液浸泡1 h，然后將幼苗在煮沸的混合液（V（乳酸）∶V（甘油）∶V（乙醇）=1∶1∶3）中脫色1 min。每個處理至少使用3株幼苗。

1.4 內(nèi)源糖含量測定

采用高效液相色譜法（HPLC-ELSD）檢測，測定樣品中糖組分含量，采用高效液相色譜儀（Wa?ters e2695，美國），配置Waters2998 檢測器。稱取0.5 g 樣品，加入80%乙腈溶液1 mL；低溫水浴超聲30 min，4 ℃ 12 000g離心5 min，取上清液，重復(fù)提取2 次合并上清液；過0.22 μm 有機相濾膜，放入?20 ℃冰箱待上機檢測。檢測條件：CNW氨基柱（150.0 mm×4.6 mm，3.5 μm），流動相為V（乙腈）∶V（水）=3∶1，進樣量5 μL，柱溫30 ℃，流速1 mL·min?1，漂移管溫度85 ℃，霧化溫度70 ℃，增益值10。在該色譜條件下，葡萄糖保留時間約為10.5 min，果糖保留時間約為8.9 min，鼠李糖保留時間約為6.2 min。

1.5 轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-seq）

RNA-seq 由上海歐易生物科技（中國）有限公司測序。使用mirVana? miRNA ISOlation Kit（Am?bion）提取擬南芥總RNA，用帶有Oligo（dT）的磁珠富集mRNA。使用TruSeq Stranded mRNA LTSam?ple Prep Kit（Illumina）構(gòu)建文庫，然后在Illumina測序平臺（Illumina HiSeq X Ten，美國）測序。利用NGS QC Toolkit 軟件質(zhì)控并去除接頭，得到高質(zhì)量的clean reads。將clean reads 使用hisat2 比對到擬南芥的參考基因組。基因FPKM 表達量值使用cufflinks 軟件定量。挑選出P值小于0.05 的差異基因，利用熱圖的形式展示差異基因在不同樣本間的表達模式。文中轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)制作的韋恩圖、箱線圖和火山圖等基于上海歐易云平臺軟件繪制（https：//cloud.oebiotech.com/task/）。

1.6 實時熒光定量PCR分析

稱取適量生長10 d的野生型Col-0和kea1kea2雙突變體材料，使用Plant RNA Extraction Kit（艾科瑞生物，中國）提取擬南芥幼苗總RNA。按照艾科瑞生物公司的Evo M-MLV 反轉(zhuǎn)錄試劑盒及其操作說明完成模板cDNA 的合成。根據(jù)基因的CDS 序列，利用NCBI 引物設(shè)計網(wǎng)頁及軟件Primer Pre?mier 5 設(shè)計熒光定量PCR 引物對（表1），以擬南芥ACTIN7為內(nèi)參基因。使用艾科瑞生物公司SYBR Green Premix Pro Taq HS 預(yù)混型qPCR 試劑盒，在ABI QuantStudio 5 實時定量PCR 儀上設(shè)計反應(yīng)程序進行反應(yīng)，每個樣品設(shè)3次生物學(xué)重復(fù)。PCR反應(yīng)體系（20.0 μL）：10.0 μL 2×SYBR Green Pro Taq HS Premix，cDNA 模板2.0 μL，10 μmol·L?1上下游引物各0.5 μL，RNase free ddH2O 7.0 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火30s，40個循環(huán)；溫度提升至95℃獲得熔解曲線，數(shù)據(jù)結(jié)果采用2?ΔΔCt法進行定量分析。

表1 試驗中使用的引物Table 1 Primers sequence used in this study

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用GraphPad Prism 8.0 和SPSS 26.0 進行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析。根長及內(nèi)源糖含量統(tǒng)計分析方法為t檢驗（Student’st-test）；qRT-PCR 結(jié)果進行單因素方差分析（one-way ANOVA），采用圖基（Tukey）檢驗法在α=0.05 水平上進行不同處理組之間的差異性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 KEA1和KEA2功能缺失對擬南芥根生長的影響

如圖1A 所示，在不含蔗糖的MS 培養(yǎng)基中，kea1kea2功能缺失突變體的根長明顯短于野生型Col-0。與野生型植株相比，kea1kea2突變體的主根長度在不添加蔗糖的MS 培養(yǎng)基中減少了65%（圖1B），表明KEA1和KEA2參與了擬南芥幼苗根的生長。

2.2 KEA1和KEA2功能缺失對擬南芥根尖分生組織的影響

為了了解KEA1 和KEA2 功能缺失影響了擬南芥根尖細胞的大小還是數(shù)量，采用PI 染色的方法對生長10 d 的擬南芥Col-0 和kea1kea2突變體幼苗根部進行組織染色。結(jié)果如圖2 所示，發(fā)現(xiàn)kea1kea2突變體的根尖分生組織區(qū)域與野生型Col-0 相比較短，說明kea1kea2突變體根尖分生組織可能受到了影響從而抑制了根的生長。

圖2 kea1kea2突變體幼苗根尖細胞結(jié)構(gòu)A，C.PI染色熒光圖像；B，D.DIC圖像；圖中箭頭標(biāo)示根尖分生區(qū)Fig.2 The root tip cell structure of kea1kea2 mutant seedlings A，C.Fluorescence images of PI staining；B，D.DIC images；The arrows marked the apical meristematic zone

2.3 外源糖對kea1kea2突變體幼苗根生長的影響

為了研究不同種類的糖對Col-0 和kea1kea2突變體根生長的影響，用等濃度的蔗糖、葡萄糖、果糖、鼠李糖和海藻糖處理擬南芥幼苗。結(jié)果顯示，與Col-0 相比，當(dāng)MS 培養(yǎng)基中分別加入88 mmol·L?1的葡萄糖、果糖、鼠李糖和海藻糖時，kea1kea2突變體的根長分別減少20%、40%、43%和24%（圖3B～F），而加入88 mmol·L?1（30 g·L?1）的蔗糖，兩者根長間無顯著性差異（圖3A，F(xiàn)）。這個結(jié)果表明，30 g·L?1的外源蔗糖能夠基本恢復(fù)由于KEA1 和KEA2 功能缺失引起的根長變短，而其他種類的糖只能使其在一定程度上恢復(fù)。暗示KEA1 和KEA2 功能缺失引起的根長變短，可能是由于影響了擬南芥幼苗體內(nèi)的糖含量。

圖3 在含有不同糖的培養(yǎng)基中生長的kea1kea2突變體幼苗的表型A～E.生長10 d的幼苗表型；F.幼苗根長度統(tǒng)計（ns.無顯著性差異）Fig.3 Phenotype and root length of kea1kea2 mutant seedlings grown under different types of sugars A?E.Phenotypic picture showed seedlings growing for 10 d；F.Root length of seedlings from A to E，nonsignificant comparison（sP>0.05）marked in the figure as ns

2.4 擬南芥幼苗部分內(nèi)源糖含量

如圖4所示，與不添加蔗糖的MS培養(yǎng)基相比，在添加30 g·L-1蔗糖處理后，擬南芥幼苗中的蔗糖、葡萄糖、果糖和鼠李糖含量均顯著增加，說明外源蔗糖促進了擬南芥蔗糖、葡萄糖、果糖和鼠李糖的積累。其中，在不添加蔗糖條件下，野生型Col-0中蔗糖和鼠李糖含量比突變體kea1kea2高（圖4A，D）；當(dāng)添加30 g·L?1蔗糖處理后，野生型Col-0 和突變體kea1kea2中蔗糖、葡萄糖和果糖的含量均無顯著性差異（圖4A～C），鼠李糖有一定的變化（圖4D）。這些結(jié)果進一步說明KEA1 和KEA2 可能通過影響擬南芥幼苗體內(nèi)糖含量來調(diào)節(jié)根的生長。

2.5 轉(zhuǎn)錄組差異表達基因分析

為了進一步了解KEA1和KEA2功能缺失對擬南芥幼苗轉(zhuǎn)錄水平基因表達的影響，進行了轉(zhuǎn)錄組測序分析。箱線圖結(jié)果顯示（圖5B），相同處理下3個重復(fù)樣本基因表達分布一致性高，Col-0 和kea1kea2突變體在有無蔗糖條件下基因表達分布差異明顯。韋恩圖結(jié)果顯示（圖5A），有28個基因在4種比較組中均呈現(xiàn)差異表達，Col-0和kea1kea2突變體在蔗糖存在條件下（C+S_vs_k1k2+S），有63個差異表達基因不同于其他3個比較組；Col-0在有無蔗糖條件下（C_vs_C+S），有812個差異表達基因不同于其他3 個比較組；在無蔗糖條件下（C_vs_k1k2），Col-0和kea1kea2突變體有67個差異表達基因不同于其他3 個比較組；kea1kea2突變體在有無蔗糖條件下（k1k2_vs_k1k2+S），有1 970個差異表達基因不同于其他3個比較組?；鹕綀D進一步分析顯示（圖5C～F），在無蔗糖條件下（C_vs_k1k2），與Col-0相比，kea1kea2突變體中下調(diào)基因的數(shù)量多于上調(diào)基因的數(shù)量；在C_vs_C+S和k1k2_vs_k1k2+S組中，上調(diào)基因的數(shù)量多于下調(diào)基因的數(shù)量；在C+S_vs_k1k2+S中，下調(diào)基因的數(shù)量與上調(diào)基因的數(shù)量基本相等。以上結(jié)果表明，KEA1和KEA2功能缺失會影響擬南芥幼苗轉(zhuǎn)錄水平上許多基因表達下調(diào)，而蔗糖會在一定程度上彌補這種影響。

圖5 轉(zhuǎn)錄組測序差異表達基因分析A.韋恩圖；B.箱線圖；C～F.火山圖（綠色表示下調(diào)基因，紅色表示上調(diào)基因）；C.野生型Col-0；C+S.Col-0+蔗糖；k1k2. kea1kea2突變體；k1k2+S.kea1kea2+蔗糖Fig.5 Analysis of differentially expressed genes by transcriptome sequencing A.Venn Plot；B.Box-whisker Plot；C?F.Volcano Plo（tGreen indicated down-regulated genes，and red indicated up-regulated genes）；C.Col-0；C+S.Col-0+Sucrose；k1k2. kea1kea2；k1k2+S.kea1kea2+Sucrose

2.6 外源蔗糖對擬南芥幼苗蔗糖信號通路相關(guān)基因表達的影響

對轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果篩選分析發(fā)現(xiàn)，在不添加蔗糖的情況下，與野生型Col-0相比，kea1kea2突變體中的蔗糖生物合成基因（SPS1、2、3、4和SPP1、2）、蔗糖代謝基因（SUS、CINV2、CWINV4等）和參與蔗糖轉(zhuǎn)運基因（SUC2、SUC7、SWEET12等）的表達水平相對較低（圖6A～C），表明KEA1 和KEA2的功能缺失可能會降低蔗糖的合成、代謝及轉(zhuǎn)運過程。除此之外，與不添加蔗糖的情況相比，在加入30 g·L?1蔗糖后，Col-0和kea1kea2突變體的蔗糖生物合成基因（SPS1、2、3和SPP1）和蔗糖分解基因（SUS1-6和CINV2、CWINV4、CWINV5、SnRK1.1）以及一些蔗糖轉(zhuǎn)運基因（SUC2、4、7和SWEET12、13、14、15）表達水平升高（圖6A～C）。同時，本研究挑選了與蔗糖信號通路相關(guān)的部分基因進行了qRT-PCR 驗證，蔗糖生物合成基因（SPS2、3、4）和蔗糖代謝基因（SUS4、5、6）的表達與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果趨勢一致（圖6D～I）?；谝陨辖Y(jié)果，推測KEA1 和KEA2 可能間接參與調(diào)節(jié)與蔗糖相關(guān)的信號通路。

圖6 蔗糖信號通路中相關(guān)基因表達的熱圖和qRT-PCR驗證A～C.轉(zhuǎn)錄組測序蔗糖信號通路相關(guān)基因變化熱圖（顏色表示基因表達強度，紅色表示高表達水平，藍色表示低表達水平）；D～I.qRT-PCR分析6個蔗糖信號通路相關(guān)基因的表達；不同小寫字母表示差異顯著（P<0.05）Fig.6 Heatmap and qRT-PCR test of related gene expression in sucrose signaling pathway A?C.Heatmap of the changes in genes related to sucrose signaling pathway determined through RNA-seq（The colors in the heatmap represented the intensity of the gene expression changes；Red meant high expression levels；Blue meant low expression levels）；D?I.The expression of six sucrose signaling pathway related genes were analyzed through qRT-PCR；Different lowercase letters above the bars indicated significant difference（sP<0.05）

2.7 外源蔗糖對擬南芥幼苗根生長發(fā)育相關(guān)基因表達的影響

另一方面，通過對轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果分析，鑒定出與根生長發(fā)育相關(guān)的差異表達基因49 個，其中與根生長相關(guān)的有6 個，與根發(fā)育相關(guān)的有43 個。對這些差異表達基因做熱圖分析，結(jié)果如圖7 所示，在無蔗糖的培養(yǎng)基中，與根生長發(fā)育相關(guān)的絕大多數(shù)基因的表達水平顯著下調(diào)，而在添加30 g·L?1蔗糖處理以后，與根發(fā)育相關(guān)基因的表達普遍上調(diào)。這些結(jié)果表明，蔗糖可以明顯影響擬南芥幼苗根生長的基因表達譜，并且KEA1 和KEA2 功能缺失會進一步引起與根生長相關(guān)基因的下調(diào)（圖7）。

圖7 根生長發(fā)育相關(guān)基因表達的熱圖Fig.7 Heatmap of related gene expression during root growth and development

2.8 KEA1和KEA2功能缺失使擬南芥幼苗活性氧積累增多

超氧陰離子（O·?2）是活性氧（ROS）的重要組成部分，ROS 的含量在一定的程度上能反映植物中氧化還原的穩(wěn)態(tài)。NBT 染色可以用來檢測植物體內(nèi)O·?2的分布，筆者對是否有蔗糖處理的擬南芥葉片進行染色。如圖8所示，突變體kea1kea2葉片上的NBT染色強度明顯高于野生型Col-0，加30 g·L?1蔗糖處理后，野生型Col-0 和突變體kea1kea2葉片上的NBT染色強度減弱。這些結(jié)果表明，KEA1和KEA2功能缺失使活性氧積累增多，蔗糖可以適當(dāng)緩解活性氧的積累。

圖8 KEA1和KEA2功能缺失對葉片中O·?2 積累的影響Fig.8 Effect of KEA1 and KEA2 knock-down on O·?2 accumulation in leaves

3 討論

此前的研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥KEA1 和KEA2 蛋白定位于葉綠體的內(nèi)膜［8］。在正常生長條件下，kea1kea2雙功能缺失突變體的幼葉小并且呈淡綠色，光合作用的效率顯著降低，生長發(fā)育遲緩［8-9，15］。本研究進一步發(fā)現(xiàn)，在無蔗糖的MS 培養(yǎng)基中，與野生型Col-0相比，kea1kea2雙突變體的根長明顯變短，說明KEA1 和KEA2 參與調(diào)節(jié)擬南芥幼苗根的伸長，Sánchez-McSweeney 等［16］在添加1%蔗糖的MS培養(yǎng)基中也觀察到相似的表型。

在大多數(shù)高等植物中，蔗糖是光合作用的最終產(chǎn)物。蔗糖代謝通過產(chǎn)生糖信號分子（例如蔗糖本身、葡萄糖、果糖和海藻糖-6-磷酸），或通過代謝過程本身發(fā)揮的信號作用介導(dǎo)植物的生長發(fā)育。Kircher 等［17］研究表明，擬南芥幼苗將光合作用產(chǎn)生的糖運輸?shù)礁馐枪庹{(diào)節(jié)根生長所必需的，說明蔗糖能促進植物生根發(fā)芽。因此，當(dāng)光合作用受到破壞時，在沒有蔗糖的培養(yǎng)基中，擬南芥的生長發(fā)育可能受到抑制。而KEA1 和KEA2 功能缺失會影響質(zhì)體發(fā)育，導(dǎo)致葉綠體結(jié)構(gòu)損傷，從而引起光合作用降低［8-9］，進而影響根的生長。此外，有研究表明光合作用產(chǎn)物蔗糖作為細胞壁合成的能量源、碳源和細胞伸長的相容溶質(zhì)，有助于根的形成［14］。在植物中，蔗糖合酶（SUS）分解蔗糖為果糖和UDP-葡萄糖，轉(zhuǎn)化酶（INV）分解蔗糖為葡萄糖和果糖，這兩類酶是催化蔗糖分解的關(guān)鍵酶［18］。已有研究發(fā)現(xiàn)，部分擬南芥細胞質(zhì)轉(zhuǎn)化酶（CINV）參與調(diào)節(jié)根的生長［19］，并且一些蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白（SUC 和SWEET）也會影響根的生長［20-21］。本研究中，不添加蔗糖的培養(yǎng)基中，蔗糖、葡萄糖、果糖、鼠李糖含量均較低，同時，RNA-seq 結(jié)果顯示降解蔗糖的細胞質(zhì)轉(zhuǎn)化酶基因CINV2，細胞壁轉(zhuǎn)化酶基因CWINV4、5，以及蔗糖合酶基因SUS1-6表達水平均較低；而在添加30 g·L?1蔗糖后，蔗糖、葡萄糖、果糖含量增加，CINV2，CWINV4、5，以及SUS1-6表達水平也上調(diào)，這些結(jié)果表明葡萄糖和果糖含量的升高可能是由于分解蔗糖的酶表達量上升導(dǎo)致的結(jié)果。此外，無蔗糖條件下，與野生型Col-0 相比，kea1kea2雙突變體中的SPS1、SPS2、SPS3、SPP1、SnRK1.1、SUC2、SUC4、SUC7、SWEET12等基因的表達水平相對較低，在添加30 g·L?1蔗糖后，它們的表達水平均升高。綜上研究表明KEA1和KEA2可能間接影響蔗糖的合成與轉(zhuǎn)運，而外源添加蔗糖可以緩解KEA1 和KEA2 對蔗糖代謝通路的影響。之前的研究表明，甜菜（Beta vulgaris）根系中SPS、SUS和INV活性與蔗糖含量呈正相關(guān)［22］。Chen 等［21］發(fā)現(xiàn)，干旱和脫落酸激活的SnRK2 蛋白激酶能夠磷酸化SWEET11 和SWEET12 的羧基末端，這種磷酸化增強了SWEET 的蔗糖轉(zhuǎn)運活性，從而提高根系中蔗糖含量，改善干旱脅迫下的根系生長，從而提高根冠比和抗旱性。此外，Last?drager等［23］同樣發(fā)現(xiàn)，蔗糖能夠調(diào)節(jié)TOR和SnRK1活性，從而調(diào)整了植物的生長和發(fā)育。這些結(jié)果暗示KEA1 和KEA2 可能通過影響糖信號通路介導(dǎo)擬南芥幼苗根的生長。

另一方面，Zhong 等［24］研究表明，缺鉀可能導(dǎo)致細胞氧化應(yīng)激，表明K+和活性氧代謝之間存在密切關(guān)系。KEA 是K+/H+反向轉(zhuǎn)運蛋白，其功能缺失會影響細胞K+穩(wěn)態(tài)和pH 平衡。本研究中，在無蔗糖條件下與野生型Col-0 相比，kea1kea2雙突變體的葉片分布大量O·?2，在添加蔗糖之后，kea1kea2突變體的葉片中的O·?2含量相對變少。Sánchez-McSweeney 等［16］的研究也發(fā)現(xiàn)，與野生型相比，kea1kea2雙突變體的根中O·?2顯著減少，而葉片中O·?2明顯增加，這與本研究結(jié)果一致。推測kea1kea2雙突變體中可能由于影響鉀離子穩(wěn)態(tài)從而導(dǎo)致ROS 水平的變化，而本結(jié)果顯示蔗糖可以部分緩解ROS的積累。

綜上，本研究結(jié)果表明，外源蔗糖影響At?KEA1 和AtKEA2 參與調(diào)節(jié)擬南芥幼苗根的生長。然而，對于AtKEA1 和AtKEA2 在調(diào)控根生長中分子機制還需要進一步研究。