常二梅 董 遙 劉建鋒 賈子瑞 李 香 趙秀蓮 郭 偉，4*

（1.林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家林業(yè)和草原局林木培育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所，北京 100091；2.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院森林生態(tài)環(huán)境與自然保護(hù)研究所，國(guó)家林業(yè)和草原局森林生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100091；3.北京市綠地養(yǎng)護(hù)管理事務(wù)中心，北京 102211；4.泰安市泰山林業(yè)科學(xué)研究院，泰安 271000）

古樹(shù)能夠保持旺盛的生命力通常具有抗逆或長(zhǎng)壽等特性，可以作為林木抗逆的候選基因材料。但隨著樹(shù)齡的增長(zhǎng)古樹(shù)長(zhǎng)勢(shì)漸弱，甚至死亡［1］，因此保存古樹(shù)的優(yōu)良種質(zhì)資源已迫在眉睫。扦插操作簡(jiǎn)單、效率高是古樹(shù)無(wú)性繁殖的主要方式，但是部分古樹(shù)如側(cè)柏（Platycladus orientalis）等扦插生根率極低［2］。研究古樹(shù)的扦插不定根形成過(guò)程中的生理機(jī)制對(duì)提高扦插生根率有重要作用。

碳水化合物、含氮化合物、激素等為插穗的生根提供能量和營(yíng)養(yǎng)［3-4］。銀杏（Ginkgo biloba）母樹(shù)的樹(shù)齡越大，總糖含量和生根率越低［5］。日本落葉松（Larix kaempferi）難生根的無(wú)性系總氮含量少［6］，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和分化中有重要功能，其含量在不定根發(fā)生過(guò)程中調(diào)節(jié)植物的形態(tài)建成［7］。因此研究古樹(shù)插穗總糖、可溶性蛋白等物質(zhì)并針對(duì)性地補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)為古樹(shù)插穗生根提供能量保障。

環(huán)境脅迫產(chǎn)生過(guò)量的活性氧（ROS），而過(guò)氧化物酶能清除有害的ROS，保證植物組織正常生長(zhǎng)［8-9］。其中超氧化物歧化酶（SOD）是一種與衰老有密切關(guān)系的抗氧化劑，SOD 活性上升誘導(dǎo)糙葉杜鵑（Rhododendron scabrifolium）的插穗愈傷組織形成［10］。酚氧化酶（PPO）是促進(jìn)形成生根輔助因子“IAA-酚酸復(fù)合物”的氧化還原酶，也是不定根形態(tài)建成的重要影響因子［11］。過(guò)氧化物酶（POD）是木質(zhì)素合成過(guò)程中的關(guān)鍵酶，并且是不定根發(fā)生和伸長(zhǎng)的重要影響因子［12］。懸鈴木（Platanus orientalis）和柚木（Tectona grandis）的插穗POD 活性隨著母樹(shù)樹(shù)齡增加而下降［8，13］，因此氧化酶活性能清除插穗基部過(guò)量ROS促進(jìn)古樹(shù)扦插生根。

內(nèi)源吲哚乙酸（IAA）對(duì)根原基誘導(dǎo)、愈傷組織形成及根伸長(zhǎng)均起著重要作用［14］。隨著白皮松（Pinus bungeana）樹(shù)齡的增加，扦插生根率顯著降低，插穗的內(nèi)源脫落酸（ABA）含量升高，而IAA、玉米素核苷（ZR）、赤霉素（GA）含量降低［15］。白樺插穗中的ω（IAA）/ω（ABA）的比值隨著母樹(shù)樹(shù)齡的增加而降低［16］，而麻楝（Chukrasia tabularis）、菲油果（Acca sellowiana）的ABA 含量過(guò)高抑制了根原基發(fā)育和不定根的伸長(zhǎng)［17-18］。創(chuàng)傷脅迫引起的GA含量變化可觸發(fā)局部細(xì)胞變化啟動(dòng)再生［19-20］。因此了解古樹(shù)在扦插過(guò)程中的激素含量變化有助于提高古樹(shù)扦插生根率。

側(cè)柏的壽命長(zhǎng)達(dá)幾百甚至幾千年，蘊(yùn)藏著長(zhǎng)壽等優(yōu)良基因。因此保存?zhèn)劝毓艠?shù)的種質(zhì)資源能極大地發(fā)揮古樹(shù)的生態(tài)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值［2］。然而側(cè)柏古樹(shù)樹(shù)齡越大，扦插過(guò)程中插穗越容易出現(xiàn)腐爛、愈傷組織形成困難、生根率低等問(wèn)題［21］。因此側(cè)柏古樹(shù)扦插過(guò)程中插穗的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、抗氧化酶、內(nèi)源激素含量對(duì)生根率影響的機(jī)制急需研究。本研究通過(guò)樹(shù)齡為5、100、300、700 年側(cè)柏母樹(shù)插穗扦插過(guò)程中的關(guān)鍵時(shí)間點(diǎn)取材，分析插穗的生理生化變化從而探討生根機(jī)制，為提高側(cè)柏古樹(shù)扦插生根率提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料采自位于中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院和北京植物園內(nèi)的側(cè)柏母樹(shù)，樹(shù)齡分別為5、100、300、700 年左右（根據(jù)古樹(shù)樹(shù)齡記載），每個(gè)年齡選擇9 株進(jìn)行采樣。其中5 年生側(cè)柏插穗作為對(duì)照試驗(yàn)材料。6月份采集生長(zhǎng)健壯、無(wú)病蟲(chóng)害的距地面3～5 m 的側(cè)枝上1～3 年生新梢。截成10～15 cm 插穗，在離芽1.0～1.5 cm的基部斜切，備用。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及取樣方法

插穗用m（NAA）∶m（IBA）=1∶1 質(zhì)量濃度為1 000 mg·L?1浸泡處理1 min。采用完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，每個(gè)處理25 個(gè)插穗、3 次重復(fù)。扦插試驗(yàn)在中國(guó)林科院內(nèi)的全光照噴霧下進(jìn)行，管理參照杜常健等［22］進(jìn)行操作?；|(zhì)選用體積比是2∶8 的泥炭和珍珠巖的混合物的輕基質(zhì)網(wǎng)袋容器。根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)觀察到的扦插過(guò)程中的形態(tài)變化，將5、100、300、700 年生側(cè)柏母樹(shù)插穗中的不定根形成過(guò)程分為4 個(gè)階段：扦插試驗(yàn)當(dāng)天設(shè)為第0 天，在0 d（S1，扦插前）、35 d（S2，愈傷組織形成期）、65 d（S3，不定根形成期）、95 d（S4，不定根伸長(zhǎng)期），對(duì)每個(gè)重復(fù)隨機(jī)選取6個(gè)插穗進(jìn)行樣本取材。拔出插穗后，用蒸餾水沖洗干凈，用濾紙擦干，迅速剝?nèi)〔逅牖?～3 cm韌皮部，剪碎混勻后保存在液氮中。

1.3 測(cè)定方法

1.3.1 營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)測(cè)定

稱取0.1 g 新鮮樣本，加入1 mL 提取液研磨勻漿，離心取上清。采用生理指標(biāo)試劑盒（蘇州科銘生物技術(shù)有限公司），利用酶標(biāo)儀，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)和參考杜常健等［22］進(jìn)行操作在540、620 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定不同樹(shù)齡扦插過(guò)程中的總糖、總蛋白吸光值。根據(jù)試劑盒的計(jì)算公式計(jì)算總糖、總蛋白的含量。

1.3.2 酶活性測(cè)定

稱取0.1 g 新鮮樣本，加入1 mL 提取液，進(jìn)行低溫研磨勻漿，離心取上清。采用生理指標(biāo)試劑盒（蘇州科銘生物技術(shù)有限公司）測(cè)定酶活性并計(jì)算。根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，PPO 活性的測(cè)定原理是PPO 催化鄰苯二酚產(chǎn)生醌，利用酶標(biāo)儀，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至525 nm 進(jìn)行測(cè)定；SOD 活性測(cè)定采用NBT法，通過(guò)黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶反應(yīng)系統(tǒng)產(chǎn)生超氧陰離子（O·?2），O·?2可還原氮藍(lán)四唑生成藍(lán)色甲臜，后者在560 nm 處有吸收；SOD 可清除O·?2，從而抑制甲臜的形成，在560 nm處測(cè)定吸光值；POD的測(cè)定原理是POD 催化H2O2氧化特定底物，在470 nm測(cè)定吸光值；采用硫代巴比妥酸?分光光度法，測(cè)定丙二醛（MDA）含量，利用MDA 與硫代巴比妥酸縮合，生成紅色產(chǎn)物，在532 nm處有最大吸收峰，進(jìn)行比色后可估測(cè)樣品中過(guò)氧化脂質(zhì)的含量，同時(shí)測(cè)定600 nm下的吸光度，利用532、600 nm下的吸光度的差值計(jì)算MDA的含量。

1.3.3 內(nèi)源激素含量測(cè)定

稱取0.2 g 樣品，用預(yù)冷的含10 μg·L?1抗氧化劑BHT 的80%冷甲醇溶液浸提4 h，過(guò)濾后，將處理液用冰盒送到中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)作物化控中心，采用酶聯(lián)免疫法（ELISA）進(jìn)行內(nèi)源激素含量測(cè)定，測(cè)定結(jié)果采用Logit曲線方法進(jìn)行計(jì)算。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 22.0 軟件的單因素方差分析（Oneway ANOVA）對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)開(kāi)展單因素方差分析，采用Turkey法比較不同組間的差異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同樹(shù)齡側(cè)柏插穗扦插生根情況

為了探討母樹(shù)樹(shù)齡對(duì)扦插生根率的影響，對(duì)不同樹(shù)齡的側(cè)柏開(kāi)展扦插試驗(yàn)。結(jié)果顯示5 年生側(cè)柏插穗的生根率和生根數(shù)量分別為63.5%和6.12，顯著高于古樹(shù)扦插的生根率和生根數(shù)量（P<0.05）。100、300、700 年生側(cè)柏插穗生根率分別為20.32%、18.55%、13.74%（圖1A），生根數(shù)量分別為3.26、2.81、2.24（圖1B）。結(jié)果表明不同樹(shù)齡的扦插生根率和生根數(shù)量沒(méi)有顯著差異，而幼樹(shù)扦插生根能力顯著高于古樹(shù)。

圖1 側(cè)柏樹(shù)齡對(duì)插穗生根的影響不同小寫(xiě)字母代表處理之間在P<0.05水平存在顯著性差異；數(shù)值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差Fig.1 Effects of age on rooting and cuttings of P. orientail Different lowercase letters in the same column represented significant difference at P<0.05 level；Data presented as mean±SD

2.2 不同樹(shù)齡側(cè)柏插穗扦插過(guò)程中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量變化

營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)為插穗在生根過(guò)程中提供能量。結(jié)果表明，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)包括總糖和總蛋白含量都隨著插穗母樹(shù)樹(shù)齡的增加而減少。5 年生側(cè)柏插穗的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)顯著高于古樹(shù)（P<0.05）（圖2A），說(shuō)明5年生的插穗能供給較多的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)促進(jìn)不定根形成。100、300、700 年生側(cè)柏插穗（P>0.05）（圖2B）營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量差別不顯著，說(shuō)明樹(shù)木到一定樹(shù)齡后生理狀態(tài)差異不顯著。

圖2 扦插過(guò)程中總糖和總蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化不同大寫(xiě)字母表示不同生根階段在同一樹(shù)齡的差異顯著（P<0.05），不同小寫(xiě)字母表示不同樹(shù)齡在同一生根階段差異顯著（P<0.05）；下同F(xiàn)ig.2 Changes of total sugar and total protein mass frac?tion during the cutting rooting process Different capital letters indicated significant difference among differ?ent rooting stages in the same tree age（P<0.05）；Different lowercase letters indicated significant difference among different tree ages in the same stage（P<0.05）；the same as below

側(cè)柏插穗的總糖和總蛋白含量隨著扦插進(jìn)程（S1～S4）呈先升高后降低的趨勢(shì)。在S2 時(shí)不同樹(shù)齡插穗的總糖和總蛋白含量呈上升趨勢(shì)，S3 不定根形成促使插穗中的總糖和總蛋白增強(qiáng)。這可能是因?yàn)椴逅氲厣喜拷M織的光合作用加強(qiáng)，產(chǎn)生的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)運(yùn)輸?shù)讲逅牖?，使插穗基部的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)積累。S4時(shí)側(cè)柏插穗的總糖和總蛋白含量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，可能是因?yàn)楦翟谏L(zhǎng)過(guò)程中消耗的總糖多于葉片光合作用合成的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。

2.3 不同樹(shù)齡側(cè)柏插穗扦插過(guò)程中抗氧化酶活性變化

抗氧化酶能清除有害物質(zhì)提高抗性，輔助不定根形成。結(jié)果顯示，5年生側(cè)柏的抗氧化酶包括PPO、SOD、POD 活性增加顯著高于古樹(shù)（P<0.05）（圖3）。插穗的抗氧化酶活性隨著側(cè)柏母樹(shù)樹(shù)齡的增加而下降。不同樹(shù)齡側(cè)柏插穗在S1 和S2 時(shí)PPO 活性呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)（圖3A），5、100 年生的側(cè)柏插穗的PPO 活性在各階段變化趨勢(shì)相似，呈現(xiàn)出先降低后升高的趨勢(shì)，而300、700年生側(cè)柏插穗的PPO 活性的變化趨勢(shì)相似，呈現(xiàn)出持續(xù)下降的趨勢(shì)。在S4 時(shí)5 年生側(cè)柏插穗的PPO 活性大幅度上升。在不定根形成期和不定根伸長(zhǎng)期，PPO活性的升高有利于“IAA-酚酸復(fù)合物”的形成，從而促進(jìn)不定根的形成和伸長(zhǎng)。

圖3 扦插過(guò)程中抗氧化酶活性變化Fig.3 Changes of activities of antioxidative enzymes dur?ing the cutting rooting process

所有樹(shù)齡側(cè)柏插穗隨著扦插生根的進(jìn)程SOD活性上升（圖3B），其中5 年生側(cè)柏插穗的SOD 活性上升的幅度顯著高于古樹(shù)（P<0.05），在S2～S4顯著大于S1。S4 時(shí)所有側(cè)柏母樹(shù)樹(shù)齡插穗的SOD活性達(dá)到峰值，說(shuō)明在扦插過(guò)程中插穗的SOD 活性升高，起到了促進(jìn)插穗抗逆和不定根發(fā)生的作用。

POD 能消除體內(nèi)有害的自由基，利于愈傷組織和不定根的形成。在S1～S2 時(shí)，5、100 年生側(cè)柏插穗的POD 活性隨生根的進(jìn)程顯著上升（P<0.05）（圖3C），S3 和S4 時(shí)所有插穗的POD 活性上升，5、100 年生側(cè)柏插穗的POD 活性顯著高于300、700年生（P<0.05），這說(shuō)明POD 活性上升有助于氧化IAA促進(jìn)不定根形成。

2.4 不同樹(shù)齡側(cè)柏插穗扦插過(guò)程中MDA含量變化

MDA 是膜脂過(guò)氧化的產(chǎn)物，含量越高表明膜脂受到的傷害越嚴(yán)重。側(cè)柏插穗的MDA 含量隨著插穗母樹(shù)樹(shù)齡的增高呈現(xiàn)升高的趨勢(shì)（圖4）。在扦插過(guò)程中，MDA 含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。S3 時(shí)5 年生側(cè)柏插穗的MDA 含量繼續(xù)升高，而其余樹(shù)齡插穗的MDA 含量下降，其中300 年生側(cè)柏插穗MDA含量下降的幅度較大。S4時(shí)5年生側(cè)柏插穗的MDA含量降低，側(cè)柏古樹(shù)插穗MDA含量升高。這可能是因?yàn)椴逅朐谇げ宄跗诘臋C(jī)械損傷，MDA含量上升，在愈傷組織形成和不定根發(fā)生時(shí)，插穗的生理狀態(tài)逐步恢復(fù)，并且對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力開(kāi)始增強(qiáng)，導(dǎo)致MDA含量降低。

圖4 扦插過(guò)程中MDA質(zhì)量摩爾濃度變化Fig.4 Changes of MDA during the cutting rooting process

2.5 不同樹(shù)齡側(cè)柏插穗扦插過(guò)程中內(nèi)源激素含量變化

側(cè)柏插穗的激素含量隨著插穗母樹(shù)樹(shù)齡的增加而呈現(xiàn)出不同的變化趨勢(shì)（圖5A）。不同樹(shù)齡側(cè)柏插穗之間IAA 含量差異顯著（P<0.05）。來(lái)自5、100、300 年生側(cè)柏插穗的IAA 含量在扦插4 個(gè)階段，呈先上升后下降的趨勢(shì)，S2時(shí)來(lái)源于不同樹(shù)齡側(cè)柏插穗的IAA 含量上升，促使內(nèi)源IAA 向插穗基部積累；在S3 時(shí)IAA 含量達(dá)到峰值。S4 時(shí)5、100、300 年生插穗的IAA 含量卻下降，可能是因?yàn)椴欢ǜ谏扉L(zhǎng)過(guò)程中消耗了大量IAA。另外不同樹(shù)齡側(cè)柏插穗的ZR 含量在扦插4 個(gè)階段，總體呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)（圖5B）。在扦插過(guò)程中側(cè)柏插穗的ZR 含量隨著插穗母樹(shù)樹(shù)齡的增加而下降。在S2～S4 時(shí)5 年生側(cè)柏插穗的ZR 含量顯著大于古樹(shù)插穗的ZR含量（P<0.05），這可能是較高濃度的ZR促進(jìn)了細(xì)胞分裂。

圖5 扦插過(guò)程中激素質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化Fig.5 Changes of hormones mass fraction in the cutting rooting process

在扦插過(guò)程的4 個(gè)階段GA 含量呈現(xiàn)降低—升高—降低的趨勢(shì)，S2 時(shí)所有樹(shù)齡側(cè)柏母株插穗的GA含量都呈現(xiàn)下降趨勢(shì)；S3時(shí)各樹(shù)齡側(cè)柏插穗GA 含量均呈上升趨勢(shì)，因此GA 在一定程度上促進(jìn)側(cè)柏不定根的發(fā)生（圖5C）。

隨著側(cè)柏母樹(shù)樹(shù)齡增長(zhǎng)，插穗ABA 含量呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)（圖5D），而在整個(gè)扦插過(guò)程中，5 年生側(cè)柏插穗的ABA 含量顯著低于古樹(shù)插穗的ABA含量（P<0.05），說(shuō)明側(cè)柏古樹(shù)插穗ABA 含量較高從而抑制扦插生根。在不定根形成期和不定根伸長(zhǎng)期，所有樹(shù)齡側(cè)柏插穗的ABA 含量在S3 時(shí)最低，這說(shuō)明ABA 含量的降低有利于扦插過(guò)程中插穗的不定根形成和伸長(zhǎng)。

2.6 不同樹(shù)齡側(cè)柏插穗扦插過(guò)程中ω（IAA）/ω（ABA）、ω（ZR）/ω（ABA）比值的變化

不同樹(shù)齡側(cè)柏插穗的ω（IAA）/ω（ABA）、ω（ZR）/ω（ABA）趨勢(shì)相似，比值總體呈上升趨勢(shì)（圖6）。在S1 時(shí)各樹(shù)齡側(cè)柏差異較小，在S2～S4 時(shí)5 年生側(cè)柏插穗的ω（IAA）/ω（ABA）、ω（ZR）/ω（ABA）比值大幅上升。且上升幅度顯著大于100、300、700 年生側(cè)柏插穗的ω（IAA）/ω（ABA）、ω（ZR）/ω（ABA）比值（P<0.05）。在S4 時(shí)5 年生側(cè)柏插穗的ω（IAA）/ω（ABA）比值上升幅度變小，而100、300、700 年生側(cè)柏插穗的ω（IAA）/ω（ABA）比值卻呈顯著下降趨勢(shì)（P<0.05）。通常情況下，ω（IAA）/ω（ABA）、ω（ZR）/ω（ABA）比值越高，插穗越容易生根。在此扦插試驗(yàn)的過(guò)程中，5 年生側(cè)柏插穗的ω（IAA）/ω（ABA）比值最高，這促進(jìn)了5 年生側(cè)柏插穗生根，而700 年生側(cè)柏插穗的ω（IAA）/ω（ABA）比值最小，因此，其生根率較低，這也是各種激素之間相互作用的結(jié)果。

圖6 扦插過(guò)程中IAA/ABA、ZR/ABA比值變化Fig.6 Changes of ratios of IAA/ABA、ZR/ABA during the cutting rooting process

3 討論

古樹(shù)隨著樹(shù)齡的增長(zhǎng)扦插生根率驟降，許多古樹(shù)如：甘蒙檉柳（Tamarix austromongolica）、銀杏等扦插生根率極低［23-24］，內(nèi)源生長(zhǎng)物質(zhì)減少是降低扦插生根能力的主要原因之一。插穗內(nèi)部充足的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)是根原基形成以及快速生根的基礎(chǔ)［25］。本研究發(fā)現(xiàn)側(cè)柏古樹(shù)隨著母樹(shù)樹(shù)齡的增加插穗的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)；這與白樺、長(zhǎng)白落葉松（Larix olgensis）樹(shù)齡增長(zhǎng)扦插生根率降低的結(jié)果［16］相似。在對(duì)秤錘樹(shù)（Sinojackia xylocarpa）扦插繁殖研究中發(fā)現(xiàn)，生根過(guò)程消耗插穗內(nèi)部大量的糖和蛋白［26］，這與本研究側(cè)柏插穗總糖含量提高有利于愈傷組織形成和不定根發(fā)生的結(jié)果一致。有研究發(fā)現(xiàn)來(lái)自5、100、300、700 年生側(cè)柏插穗在愈傷組織形成期，可溶性糖含量上升，并且5 年生側(cè)柏插穗的上升幅度最大［21］，與本研究的結(jié)果一致。插穗內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)為插穗不定根的形成提供了物質(zhì)保障，而且正是這些變化推動(dòng)了插穗的生根進(jìn)程。側(cè)柏古樹(shù)扦插生根率低可能是因?yàn)闋I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量不能滿足不定根形成和伸長(zhǎng)。

抗氧化酶能消除自由基等抑制生根的物質(zhì)［27］。插穗的SOD、PPO、POD 活性隨著插穗母樹(shù)樹(shù)齡的增加而降低。在側(cè)柏扦插過(guò)程中（S1～S4），PPO、SOD、POD活性呈先上升后下降的趨勢(shì)。5年生側(cè)柏插穗的抗氧化酶活性顯著高于古樹(shù)，這與扦插生根率趨勢(shì)一致，因此抗氧化酶活性高對(duì)扦插生根具有促進(jìn)作用。POD 酶活性峰值的出現(xiàn)對(duì)馬尾松（Pinus massoniana）不定根的發(fā)生起到了明顯的促進(jìn)作用［28］。扦插前期高活性的SOD 有利于增強(qiáng)百香果（Passiflora edulis）插穗抗性，促進(jìn)插穗切口愈合和愈傷組織的形成［29］，扦插后期SOD 的活性越高對(duì)杜仲（Castanea mollissima）不定根的形成越有利［30］，這兩項(xiàng)結(jié)果均與本研究的試驗(yàn)結(jié)果相一致。另外，栓皮櫟（Quercus variabilis）根原基的PPO 活性高有利于誘導(dǎo)不定根的形成［27］。MDA值越大表示電解質(zhì)的滲漏量越多，細(xì)胞膜受害程度越重，側(cè)柏古樹(shù)插穗抗氧化酶活性低而MDA 含量高說(shuō)明其各種不良環(huán)境抵抗能力弱導(dǎo)致生根困難。

IAA 能夠促進(jìn)插穗內(nèi)部營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的重新分配促進(jìn)插穗生根［31］。本研究中5、100、300 年生側(cè)柏插穗的IAA 含量呈先上升后下降的趨勢(shì)，在S3 時(shí)IAA含量達(dá)到峰值，說(shuō)明IAA對(duì)于不定根的誘導(dǎo)和伸長(zhǎng)具有促進(jìn)作用。此結(jié)果與山杏（Armeniaca si?birica）和北美香柏（Thuja occidentalis）的扦插試驗(yàn)結(jié)果［32-33］一致。ZR 對(duì)不定根的發(fā)生有促進(jìn)作用，ZR 含量隨著側(cè)柏插穗母樹(shù)樹(shù)齡的增加而下降。在整個(gè)扦插過(guò)程中，4 個(gè)樹(shù)齡段的側(cè)柏插穗的ZR含量呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，這與四倍體刺槐（tetraploidRobiniapseudoacacia）和白皮松（Pinus bungeana）扦插試驗(yàn)結(jié)果［15，34］相一致。IAA 和ZR 保證了細(xì)胞分裂、分化、形態(tài)建成過(guò)程中所需的物質(zhì)。

GA 和ABA 含量與扦插過(guò)程中的機(jī)械損傷有關(guān)，插穗的ABA 含量增加以增強(qiáng)插穗的抗逆性。本研究結(jié)果顯示5 年生側(cè)柏插穗的GA 含量顯著低于側(cè)柏古樹(shù)，因此含量低可能對(duì)不定根的形成有促進(jìn)作用。這與波葉金桂（Osmanthus fragrans）和興安圓柏（Sabina davurica）扦插時(shí)低濃度的GA有利于低樹(shù)齡母樹(shù)插穗不定根發(fā)生的試驗(yàn)結(jié)果［7，35］一致。在S3 時(shí)GA 含量高說(shuō)明創(chuàng)傷能夠誘導(dǎo)器官的再生和防御［19-20］。在不定根形成期和不定根伸長(zhǎng)期，側(cè)柏古樹(shù)插穗的ABA 含量在S3 時(shí)達(dá)到最高值，說(shuō)明ABA 對(duì)于不定根的誘導(dǎo)和伸長(zhǎng)具有一定的抑制作用。這與ABA 含量過(guò)高抑制山杏（Armeniaca sibirica）、菲油果根原基發(fā)育和不定根伸長(zhǎng)的結(jié)果［32，18］一致。而雜交鵝掌楸（Lirioden?dron chinese×L.tulipifera）IAA/ABA 升高時(shí)有利于插穗不定根的形成［36］與側(cè)柏古樹(shù)的結(jié)果相似，說(shuō)明各種激素在側(cè)柏古樹(shù)扦插過(guò)程中相互影響，適合適量的激素促進(jìn)不定根生成。

4 結(jié)論

扦插保存?zhèn)劝毓艠?shù)優(yōu)良種質(zhì)資源發(fā)揮古樹(shù)的生態(tài)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值具有重要作用。通過(guò)研究不同樹(shù)齡側(cè)柏古樹(shù)扦插生根關(guān)鍵時(shí)間點(diǎn)的生理生化變化，發(fā)現(xiàn)有利于生根的物質(zhì)如：營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)（總糖、總蛋白）、抗氧化酶（PPO、POD、SOD 活性）、激素含量（IAA、ZR）在隨著樹(shù)齡的增長(zhǎng)各個(gè)扦插生根階段逐漸降低。MDA、GA和ABA呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，這些物質(zhì)在不定根形成階段含量最高致使側(cè)柏古樹(shù)扦插生根難。說(shuō)明有利于生根的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、抗氧化酶、激素在側(cè)柏古樹(shù)插穗中含量較低，而有害物質(zhì)較多。因此，在古樹(shù)扦插過(guò)程中施加適量的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)（總糖、總蛋白）、激素（IAA）有助于提高古樹(shù)生根率。