張昊楠 陳珊珊 徐建民 羅 萍 王曉萍 許志茹 范春節(jié)*

（1.東北林業(yè)大學生命科學學院，哈爾濱 150040；2.國家林業(yè)和草原局熱帶林木培育重點實驗室，中國林業(yè)科學研究院熱帶林業(yè)研究所，廣州 510520；3.林木遺傳育種國家重點實驗室，東北林業(yè)大學/中國林業(yè)科學研究院，哈爾濱/北京 150040/100091）

桉樹是桃金娘科（Myrtaceae）桉屬（Eucalyp?tus）的統(tǒng)稱，又稱尤加利樹，原產于澳大利亞及其附近島嶼，自1890—1899 年引入我國已有130 多年的歷史［1］，目前多分布于我國海南、廣東、廣西等地。桉樹作為生物質的主要來源之一［2］，具有重要的經(jīng)濟價值，在造紙和家具行業(yè)中被廣泛應用［3-4］。桉樹具有生長速度快、材性好、基因組小等優(yōu)點，因此對桉樹材性改良育種可作為研究的重要方向［5］。如有研究通過反義4CL基因來降低巨尾桉（Eucalyptus urophylla×E.grandis）和尾葉桉（E.uro?phylla）植株的木質素含量，以降低造紙的生產成本同時減少環(huán)境污染［6-7］。因此若能篩選和鑒定出抗逆以及改良桉樹的材性基因將對解決桉樹材性改良應用和應對生物和非生物脅迫奠定重要基礎。

擬南芥（Arabidopsis thaliana）walls are thin 1（WAT1）基因是Pesquet 等［8］在篩選百日草（Zinnia elegans）分化培養(yǎng)過程中與次生壁形成相關的數(shù)百個基因中被發(fā)現(xiàn)，其與紫花苜蓿（Medicago trun?catula）NODULIN 21（MtN21）為同源基因。擬南芥AtWAT1基因編碼一種液泡膜蛋白，主要在木質部導管和纖維細胞等維管組織相關的器官中表達，同時發(fā)現(xiàn)AtWAT1在信號級聯(lián)中主要定位于FRA3 下游和NST1/SND1上游，與纖維細胞中次生細胞壁的形成有關［9-10］。對WAT1突變體植株進行分析，發(fā)現(xiàn)木質部和束間纖維的次生細胞壁含量顯著降低，導管厚度和形態(tài)沒有顯著變化。在這個過程中，生長素含量和轉運受到抑制，生長素調控途徑相關基因表達量下調，說明WAT1基因通過介導生長素的運輸作用于纖維細胞中次生細胞壁沉積［11］。此外還發(fā)現(xiàn)WAT1基因通過響應光變化影響相關基因作用于次生壁的形成［12］。與之類似，Tang 等［13］研究證明棉花（Gossypiumspp.）的WATs（GhWATs）基因主要在根、節(jié)間、下胚軸表達量較高，棉花WATs基因突變植株中木質部發(fā)育受到抑制、木質素沉積增加、木質素合成增加和木質化相關基因表達量升高、生長素運輸受阻。此外，GhWATs基因突變植物體中水楊酸（SA）含量升高并且激活SA 合成和信號應答相關基因的表達。Denance等［12］研究也證明在擬南芥WAT1突變體中SA 含量升高并且抑制了吲哚乙酸、色氨酸和葡萄糖苷合成。此外，在其他研究中發(fā)現(xiàn)SA 與生長素水平呈負相關［13-15］。而且在擬南芥、棉花和番茄（Solanum lycopersicum）中的研究發(fā)現(xiàn)其WAT1突變體植株都呈現(xiàn)出對黃萎病、青枯病和維管束病原體的抗性增強［13，16-17］，說明WAT1可能是分子培育抗病品種過程中可利用的重要候選基因，將來可用于桉樹的抗病育種研究。

本研究通過前期的轉錄組測序分析發(fā)現(xiàn)巨桉（Eucalyptus grandis）WAT1基因在次生木質部中以及在初生生長到次生生長轉換過程中表達量顯著升高。為進一步研究其功能，對巨桉中EgrWAT1基因克隆，探究其基因結構特征，并利用qRT-PCR技術對其在不同組織部位以及在SA、MeJA、高鹽脅迫（NaCl）、缺磷（SH-P）、缺硼（SH-B）等脅迫處理下的表達模式進行分析。初步對EgrWAT1基因功能進行分析，期望為桉樹應對逆境脅迫和材性改良的分子機制和分子育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

植物材料為巨桉無性系GL1，均培育于中國林業(yè)科學研究院熱帶林業(yè)研究所。選取生長狀態(tài)良好且相對均一的植株，對植株分別進行SA、Me?JA、NaCl、SH-P、SH-B 處理。分別用0.1 mmol·L?1SA、0.1 mmol·L?1MeJA 進行噴施處理，分別在0、1、6、24、168 h后取葉片；200 mmol·L?1NaCl 進行灌根處理，分別在0、1、6、24、168 h 后取葉片；配制缺磷、缺硼的霍格蘭營養(yǎng)液培養(yǎng)幼苗，0 h、6 h、24 h、48 h、96 h、21 d 后取葉片。每個處理5 株植株，每個處理3 個重復，每次取樣統(tǒng)一采取4～6 的葉片。收集不同組織部位的樣品以及各種激素和逆境處理后的樣品迅速置于液氮中預冷，立即放置于冰箱中 ?80 ℃保存，用于RNA提取。

1.2 方法

1.2.1 EgrWAT1基因的生物信息學分析

利用ExPASy（https：//www.expasy.org/）數(shù)據(jù)庫在線預測EgrWAT1 蛋白的基本理化性質，包括理論等電點、氨基酸長度、蛋白分子質量、外顯子數(shù)量。利用WoLF PSORT（https：//wolfpsort.hgc.jp/）預測EgrWAT1 蛋白亞細胞定位。利用在線網(wǎng)站Gene Structure Display Server 2.0（http：//gsds.gaolab.org/）繪制EgrWAT1基因的基因結構。利用SOPM（NPS@：SOPMA secondary structure predic?tion（ibcp.fr））和SWISS-MODEL（https：//swissmodel.expasyorg/interactive）在線工具分別進行EgrWAT1的蛋白質二級結構和三級結構分析；利用SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）在線網(wǎng)站分析蛋白質保守結構域。

通過NCBI BLASTP（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/）在線查找在擬南芥、水稻（Oryza sativa）、大豆（Glycine max）、苜蓿、葡萄（Vitis vinifera）和楊樹（Populus trichocarpa）中巨桉WAT1的同源序列。通過PFAM 和SMART對不同植物的成員序列進行驗證，并利用Phytozome 網(wǎng)站獲得各成員的蛋白序列、基因序列和CDS 序列。利用MEGA 6.0 軟件將各WAT1成員的氨基酸序列，利用內置的Clustal W程序進行多重序列比對，選用鄰接法（Neighbor-Joining，N-J）構建系統(tǒng)進化樹（校驗參數(shù)Bootstrap值設置為重復1 000次）。

1.2.2 總RNA的提取及cDNA第一鏈的合成

收集約0.1 g 的材料放在凍存管中，迅速放入液氮中凍存。利用EASYspin 植物RNA 提取試劑盒（購于北京艾德萊生物科技有限公司）方法進行材料總RNA 提取，然后經(jīng)過DNaseⅠ消化基因組DNA，得到純化的總RNA。利用NanoDrop-2000儀器（購于美國賽默飛世爾科技公司）檢測所提取RNA 的質量和濃度。利用Superscript Ⅲ反轉錄試劑盒（購于美國英杰生命技術有限公司）將提取的RNA進行cDNA第一條鏈的合成。

1.2.3 EgrWAT1基因克隆

從Phytozome13（https：//phytozome-next.jgi.doe.gov/）數(shù)據(jù)庫中篩選下載獲得巨桉WAT1基因序列（Eucgr.D02535.1）。利用Primer Premier 5.0軟件設計特異性基因克隆引物，由北京擎科生物科技有限公司合成。以巨桉cDNA 作為模板進行PCR 擴增。獲得的目的片段連接到克隆載體pEASY blunt-T1 Cloning Kit（購于北京全式金生物技術有限公司）上，并將連接產物轉化大腸桿菌（Esche?richia coli）感受態(tài)細胞DH5α，次日選取陽性菌液送至北京睿博興科生物技術有限公司進行序列測定。

1.2.4 EgrWAT1基因表達模式分析

選取EgrEF2基因為內參基因并且根據(jù)EgrWAT1S和EgrWAT1L基因克隆后測序所得序列，利用Primer Premier 5.0 軟件設計特異定量引物。利用SYBR Premix ExTaqⅡ試劑盒（購于北京寶日醫(yī)生物技術有限公司）和Light Cycler 96 熒光定量分析儀（購于瑞士霍夫曼羅氏公司）進行qRT-PCR 分析。為避免試驗誤差確保數(shù)據(jù)準確性，試驗設置3 個生物學重復、3 個技術重復。利用2-ΔΔCt法對所得數(shù)據(jù)進行相對定量分析，并利用GraphPad Prism 8 和SPSS 22 進行統(tǒng)計學分析和圖片繪制。

1.2.5 過表達載體構建

采用限制性內切酶KpnⅠ和XbaⅠ（購于北京寶日醫(yī)生物技術有限公司）對EgrWAT1S和EgrWAT1L基因的產物和植物過表達載體pROKⅡ質粒進行雙酶切，酶切產物分別進行回收純化。利用T4DNA 連接酶將回收產物連接到表達載體中，然后將構建的載體用熱激法轉入到大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α（購于北京天根生化科技有限公司）中。次日，在篩選平板上挑取單克隆菌落進行PCR 驗證，選取陽性菌液送至北京睿博興科生物技術有限公司進行序列測定。將序列驗證成功的菌液置于冰箱中?80 ℃保存，重組質粒命名為pROKⅡ-EgrWAT1S和pROKⅡ-EgrWAT1L。陽性重組質粒通過電轉化法轉化至農桿菌（Agrobacteri?um）感受態(tài)細胞GV3101（購于北京天根生化科技有限公司）中，次日進行菌落PCR驗證，驗證成功的陽性菌落于冰箱中?80 ℃保存，用于后續(xù)轉化試驗。

2 結果與分析

2.1 EgrWAT1基因基本信息和蛋白質理化性質分析

Gene Structure Display Server 2.0 在線網(wǎng)站的基因結構分析結果顯示，EgrWAT1基因與擬南芥WAT1基因一樣均含有6 個外顯子和5 個內含子（見圖1A）。通過Phytozome 網(wǎng)站分析得知WAT1基因定位于6號染色體，EgrWAT1基因序列長度為2 073 bp、CDS 序列長度為1 071 bp，編碼356 個氨基酸。預測蛋白相對分子質量為3.904 kDa、理論等電點為9.23；亞細胞定位預測分析結果顯示EgrWAT1 主要定位在液泡、細胞膜，這與擬南芥WAT1 定位一致。其蛋白的二級結構由51.69%的α螺旋、4.49%的β折疊、26.12%的無規(guī)則卷曲和17.70%延伸鏈組成（見圖1B）。對巨桉和擬南芥的WAT1 蛋白三級結構進行預測，結果發(fā)現(xiàn)其均含有大量α螺旋結構，也進一步證明其作為膜蛋白的結構（見圖1C、D）。對EgrWAT1 蛋白保守結構域進行分析發(fā)現(xiàn)其含有2 個EamA 保守結構域，與擬南芥相同，且長度均為137 個氨基酸（見圖1E）。

圖1 EgrWAT1s基因的結構分析及蛋白二級、三級結構預測分析A.EgrWAT1s和AtWAT1s基因的結構分析；B.EgrWAT1蛋白二級結構預測分析（藍色表示α螺旋，綠色表示β折疊，黃色表示無規(guī)則卷曲，紅色表示延伸鏈）；C.桉樹EgrWAT1蛋白三級結構預測；D.擬南芥AtWAT1蛋白三級結構預測；E.EgrWAT1蛋白保守結構域分析Fig.1 Gene structure analysis and protein secondary and tertiary structure prediction of EgrWAT1 gene A.Gene structure analysis of EgrWAT1s and AtWAT1s；B.Prediction analysis of secondary structure of EgrWAT1 protein（Blue represented α helix，green represented β folding，yellow represented random curl，and red represented extended chain）；C.Three-dimension structure prediction of EgrWAT1 protein；D.Three-dimension structure prediction of AtWAT1 protein；E.Conserved domains of EgrWAT1 protein

2.2 EgrWAT1基因系統(tǒng)進化分析

為了研究巨桉中EgrWAT1 和其他植物WAT1蛋白的遺傳進化關系，利用MEGA 軟件對擬南芥、水稻、楊樹、葡萄、苜蓿、大豆WAT1 蛋白序列構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹（見圖2）。結果發(fā)現(xiàn)，EgrWAT1基因與擬南芥WAT1基因（At1g75500）的蛋白質同源相似度為66.3%。EgrWAT1 與楊樹的WAT1 蛋白同源性最高，也說明巨桉EgrWAT1與毛果楊（Pop?ulus trichicarpa）PtWAT1（Potri.011G148400.4.p）的親緣關系最近，其他物種相對較遠。

圖2 EgrWAT1與其他植物WAT1蛋白的系統(tǒng)進化樹At.擬南芥；Egr.巨桉；Gm.大豆；Mt.紫花苜蓿；Os.水稻；Pt.毛果楊；Vv.葡萄Fig.2 Phylogenetic tree analysis of EgrWAT1 protein and other plant WAT1 proteins At.Arabidopsis thaliana；Egr.Eucalyptus grandis；Gm.Glycine max；Mt.Medicago truncatula；Os.Oryza sativa；Pt.Populus trichocarpa；Vv.Vitis vinifera

2.3 EgrWAT1基因克隆

以巨桉的cDNA為模板，利用設計的克隆特異性引物（見表1）對巨桉WAT1基因進行PCR 擴增。經(jīng)過克隆得到了EgrWAT1基因的2 個轉錄本，擴增產物經(jīng)電泳檢測后進行回收并將其進行測序（見圖3）。分別獲得長度為1 071、1 171 bp 的轉錄本序列，分別命名為EgrWAT1S和EgrWAT1L。將2條基因序列進行氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)，EgrWAT1S能夠正常翻譯成完整的氨基酸序列，并保留了WAT1 的功能結構域。而EgrWAT1L則是第2 個內含子保留的轉錄本，對其進行氨基酸序列分析時發(fā)現(xiàn)其出現(xiàn)提前終止事件，并不能形成完整蛋白結構，但是其能夠轉錄，可能會通過轉錄行使作用。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

圖3 EgrWAT1基因克隆M.DL2000 DNA Marker；1.EgrWAT1S基因PCR產物；2.EgrWAT1L基因PCR產物Fig.3 Gene cloning of EgrWAT1 M.DL2000 DNA Marker；1.PCR product of EgrWAT1S；2.PCR prod?uct of EgrWAT1L

2.4 EgrWAT1S和EgrWAT1L在不同組織部位及節(jié)間中的表達情況

為進一步了解WAT1基因的表達模式，通過實時熒光定量PCR 對轉錄本EgrWAT1S和EgrWAT1L基因在不同組織部位以及在不同節(jié)間的表達進行分析（見圖4）。EgrWAT1S和EgrWAT1L在不同組織部位的表達呈現(xiàn)出明顯不同的模式。EgrWAT1S在根中表達量最高，與之不同，EgrWAT1L在韌皮部表達量顯著高于其他部位。而在不同節(jié)間，EgrWAT1S和EgrWAT1L表達趨勢相似，但其表達量的變化呈現(xiàn)出顯著不同。這些結果表明EgrWAT1L轉錄本可能通過轉錄后調控來影響WAT1基因的表達和作用，進而影響其在桉樹生長發(fā)育過程中行使功能。

圖4 EgrWAT1S 和 EgrWAT1L基因在不同組織部位中的表達模式A.EgrWAT1S基因在不同組織部位中的表達模式；B.EgrWAT1L基因在不同組織部位中的表達模式；C.EgrWAT1S基因在不同節(jié)間中的表達模式；D.EgrWAT1L基因在不同節(jié)間中的表達模式；A.莖尖；R.根；P.韌皮部；YL.幼葉；ML.成熟葉；XY.木質部Fig.4 Expression patterns of EgrWAT1S and EgrWAT1L in different tissues A.Expression pattern of EgrWAT1S in different tissues；B.Expression pattern of EgrWAT1L in different tissue parts；C.Expression pattern of EgrWAT1S in different internodes；D.Expression pattern of EgrWAT1L in different internodes；A.Apical meristem；R.Root；P.Phloem；YL.Young leaf；ML.Mature leaf；XY.Xylem

2.5 EgrWAT1S和EgrWAT1L基因在不同激素處理和脅迫下的表達情況

為了進一步研究EgrWAT1S和EgrWAT1L在應對激素或者脅迫時的表達量變化，開展了MeJA 和SA 不同處理時間其表達量的變化研究。結果表明：EgrWAT1S和EgrWAT1L的表達呈現(xiàn)出明顯不同甚至相反的表達趨勢。經(jīng)過MeJA 處理6 h，EgrWAT1S轉錄本的表達量顯著升高，與對照相比其表達量上調了5.65 倍，在168 h 時表達量達到對照的7.61 倍。與之相反，EgrWAT1L轉錄本表達量經(jīng)過MeJA處理后表達量下降（見圖5A、B）。與Me?JA 處理不同，經(jīng)過SA 處理6 h 和24 h，EgrWAT1S的表達量顯著上調，分別達到對照的156.95 和43.70 倍，而在168 h 處理后其表達量急劇下降，與對照相比都有明顯的降低。而EgrWAT1L轉錄本在經(jīng)過SA 處理1～24 h 時表達量變化均不明顯，而在經(jīng)過168 h 處理后，其表達量顯著升高，達到對照的1.61倍（見圖5C、D）。

圖5 EgrWAT1基因在不同激素和脅迫處理下的表達模式A，B.EgrWAT1S 和EgrWAT1L 基因分別在MEJA 處理不同時間下的表達模式；C，D.EgrWAT1S 和EgrWAT1L 基因分別在SA 處理不同時間下的表達模式；E，F(xiàn).EgrWAT1S和EgrWAT1L基因分別在鹽脅迫處理不同時間下的表達模式；G，H.EgrWAT1S和EgrWAT1L基因分別在缺磷處理不同時間下的表達模式；I，J.EgrWAT1S和EgrWAT1L基因分別在缺硼處理不同時間下的表達模式Fig.5 Expression patterns of EgrWAT1 under different hormone and stress treatments A，B.Expression pattern of EgrWAT1S and EgrWAT1L in different time of MEJA；C，D.Expression pattern of EgrWAT1S and EgrWAT1L in different time of SA；E，F(xiàn).Expression pattern of EgrWAT1S and EgrWAT1L in different time of NaCl；G，H.Expression pattern of EgrWAT1S and EgrWAT1L in differ rent time of SH-P；I，J.Expression pattern of EgrWAT1S and EgrWAT1L in different time of SH-B

對鹽脅迫、缺磷以及缺硼條件下EgrWAT1S和EgrWAT1L表達量變化的分析表明，經(jīng)過鹽脅迫處理6 h，EgrWAT1S和EgrWAT1L轉錄本的表達量顯著升高，分別達到對照的2.15 和7.20 倍，而在24 h處理后其表達量顯著降低，分別為對照的0.08 倍和0.02 倍（見圖5E、F）。經(jīng)過缺硼脅迫處理6 h，EgrWAT1S轉錄本表達量顯著下降，達到對照的0.25 倍，而在24 h 處理后表達量顯著升高。而EgrWAT1L轉錄本在經(jīng)過處理48 h后表達量顯著升高，達到對照的23.77倍（見圖5G、H）。與上述2 種脅迫不同，缺磷脅迫處理下EgrWAT1S和EgrWAT1L轉錄本的表達呈現(xiàn)相反的表達趨勢。經(jīng)過缺磷脅迫處理21 d，EgrWAT1S轉錄本表達量顯著上調，達到對照的4.70 倍。而EgrWAT1L轉錄本經(jīng)過處理24 h 后表達量則顯著上調，達到對照的4.11 倍，而在21 d 處理后其表達量急劇下降（見圖5I、J）。這些結果表明在不同激素和脅迫處理過程中，EgrWAT1L轉錄本可能通過轉錄控制來影響EgrWAT1S的表達，進而影響到其蛋白行使功能。

2.6 EgrWAT1S 和EgrWAT1L 基 因 過 表 達 載 體構建

為進一步研究EgrWAT1S和EgrWAT1L轉錄本的功能，選取proKⅡ質粒作為過表達載體（見圖6A），通過酶切連接的方式將2 個轉錄本構建到過表達載體proKⅡ上，然后將重組質粒轉化GV3101農桿菌。經(jīng)過篩選培養(yǎng)，挑取陽性單菌落進行搖菌和進一步的菌落PCR 驗證。結果如圖6B 所示，經(jīng)過35S 啟動子元件、NPT Ⅱ元件、LB元件、RB元件的檢測，表明EgrWAT1S和EgrWAT1L轉錄本已整合到表達載體中并轉化到根癌農桿菌（Agrobac?terium tumefaciens）中，可用于下一步的遺傳轉化。

3 討論

WAT1基因是MtN21基因的同源基因，EgrWAT1基因編碼蛋白含有2個跨膜結構域，均為MtN21 家族蛋白典型結構域EamA，約占總蛋白的77%。該結構域命名源于大腸桿菌中氨基酸輸出蛋白、具有藥物或代謝產物轉運蛋白中的特征結構域［18-19］，因此主要參與生長和生物活性物質轉運等過程［20］。擬南芥WAT1 也包含2 個EamA 保守結構域，可推測其功能具有相似性。經(jīng)過基因結構和系統(tǒng)進化樹等分析表明巨桉EgrWAT1基因與毛果楊WAT1基因親緣關系較近。經(jīng)預測EgrWAT1 編碼蛋白的亞細胞定位于液泡膜，該結果與擬南芥、棉花、香蕉（Musa nana）WAT1s 蛋白的研究結果［9，13，21］一致。由此推測巨桉WAT1蛋白可能作為液泡膜蛋白參與體內生長活性物質或激素運輸有關。

本研究以巨桉無性系GL1 為材料對EgrWAT1基因進行克隆，發(fā)現(xiàn)存在著另一轉錄本EgrWAT1L。與EgrWAT1S相比，轉錄本EgrWAT1L是由于第二個內含子保留形成的1 個新的轉錄本。通過對其氨基酸序列預測分析發(fā)現(xiàn)轉錄本出現(xiàn)提前終止，不能翻譯成完整的蛋白質。為了進一步研究EgrWAT1L的作用，因此與EgrWAT1S同時開展了其在不同組織部位和不同激素、脅迫條件下表達水平分析。值得注意的是，在不同組織部位中和不同脅迫處理下EgrWAT1S與EgrWAT1L轉錄本表現(xiàn)出明顯不同甚至相反的表達模式。這些說明EgrWAT1L可能以一種轉錄后調控的方式影響WAT1基因起作用。在早期的研究中也發(fā)現(xiàn)，可變剪接是多細胞生物發(fā)育過程中一種重要的調控機制［22］，通過轉錄后調節(jié)基因表達［23］。在楊樹次生木質部發(fā)育過程中，NAC 結構域蛋白（SND）家族基因PtrSND1通過可變剪切形成新的剪接變體PtrSND1-A2IR形成新的蛋白質。但是新的蛋白質缺乏DNA 結合域和反式激活活性，與原PtrSND1相互作用形成功能缺失的異源二聚體，從而調控楊樹木質部形成［24］。同時發(fā)現(xiàn)楊樹中維管相關NAC 結構域（VND）基因的剪接變體PtrVND6和PtrSND1，可以發(fā)揮相互交叉調節(jié)作用，進一步調控木材形成中的轉錄網(wǎng)絡［25］。內含子保留是可變剪接的一種主要模式，并且終止子提前出現(xiàn)的轉錄本可能會通過競爭性抑制從而抑制原蛋白。楊樹WND基因通過保留內含子2形成新的剪接變體PtrWND1B-s和PtrWND1B-l在楊樹纖維細胞壁增厚中起拮抗作用［26］。巨桉中EgrWAT1可能通過形成EgrWAT1L轉錄本在特定條件下負調控EgrWAT1S轉錄本從而在桉樹生長發(fā)育過程中發(fā)揮作用，具體作用機制需要進一步研究。

不同組織部位的qRT-PCR 分析結果顯示EgrWAT1S在莖中表達量較高，并且隨著木質化程度增加其表達量也呈升高趨勢，即在節(jié)間11 中表達量最高。因此EgrWAT1S基因可能參與木本植物初生生長到次生生長的轉換，尤其是桉樹的次生生長。Lee等［27］發(fā)現(xiàn)通過激活BR 缺陷型番茄的WAT1基因恢復了其次生木質部發(fā)育缺陷，而且進一步證實番茄SlWAT1是調節(jié)維管形成層中局部生長素穩(wěn)態(tài)和信號輸出以促進次生生長的關鍵調節(jié)因子。Ranocha 等［9］研究結果表明，擬南芥中WAT1在信號級聯(lián)中FRA3的下游和NST1/SND1的上游發(fā)揮作用，促進次生細胞壁形成。這些結果都說明EgrWAT1基因在木材形成和次生木質部發(fā)育中起著重要的作用，而通過解析EgrWAT1基因功能以及調控其表達水平獲得改變次生生長與次生木質部發(fā)育的轉基因材料，可以用于后續(xù)的研究與生產。

前期大量的研究結果表明茉莉酸甲酯、水楊酸等生長調節(jié)劑可作為植物應對生物和非生物脅迫反應的信號分子，其在多種植物中都能減緩對病原菌侵染等逆境脅迫的傷害［28-30］。同時發(fā)現(xiàn)在水楊酸處理條件下可以提高桉樹幼苗對青枯病的抗性［31-33］。并且已在多種植物中研究表明WAT1s的表達在SA 處理下呈現(xiàn)誘導作用，如擬南芥、棉花、香蕉［13，16，21］。這與本研究中結果一致，即外源施加SA 處理一定時間后均促進了巨桉中EgrWAT1S基因的表達，其中EgrWAT1S基因的表達量受SA 誘導較EgrWAT1L更為顯著，在處理6 h后可以達到對照的170 倍左右。有研究表明乙烯反應相關因子ERF1基因可以通過正向調控木質素合成相關基因和提高木質素含量來提高對黃萎病的抗性［34］。因此，WAT1基因可能也可以在乙烯調控和木質素含量之間作為“中樞”基因，在抗病等方面發(fā)揮重要作用。之前研究表明在擬南芥、棉花和番茄的WAT1突變植株均有利于提高植株對黃萎病、青枯病等的抗性。目前，隨著桉樹栽培面積擴大其伴隨而來的病害發(fā)生也日趨嚴重，其中青枯病和焦枯病發(fā)病率最高［35］。本研究構建過表達載體，期望通過獲得巨桉WAT1轉基因植株為進一步探索WAT1基因在生長調控、逆境脅迫過程中的作用具有重大意義。