黃泊文，向 菲，田子琦，耿 毅，歐陽(yáng)萍，黃小麗，陳德芳，陽(yáng) 濤

(1 四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,四川 成都 611130；2 四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院,四川 成都 611130；3 通威股份有限公司動(dòng)物保健研究所,四川 成都 610041)

流行性潰瘍綜合征(Epizootic ulcerative syndrome,EUS)是由侵入絲囊霉菌Aphanomyces invadans引起的一種季節(jié)性流行性疫病，最早于1971年在日本養(yǎng)殖的香魚(yú)中報(bào)道[1]，目前已在澳大利亞、美國(guó)、印度等全球多個(gè)國(guó)家被發(fā)現(xiàn)，已知可感染160 多種魚(yú)類(lèi)[2]，被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(World Organization for Animal Health，WOAH)列為法定申報(bào)疫病，我國(guó)將其列為二類(lèi)動(dòng)物疫病。該病以體表紅斑、鱗片掉落及皮膚壞死性潰瘍?yōu)榕R床病變特征，組織學(xué)上肌纖維廣泛壞死和霉菌性肉芽腫為特征[1,3-4]，主要流行于冬春兩季，發(fā)病后死亡率最高可達(dá)100%[5-6]，給魚(yú)類(lèi)健康造成嚴(yán)重威脅。常藕琴等[7]2019年證實(shí)在珠江三角洲養(yǎng)殖的雜交鱧潰瘍病的病原為侵入絲囊霉菌，首次確認(rèn)了流行性潰瘍綜合征對(duì)我國(guó)養(yǎng)殖鱧的危害，目前在我國(guó)鮮見(jiàn)其他養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)感染發(fā)病的報(bào)道。

大口黑鱸Micropterussalmoides，又稱加州鱸，具有適應(yīng)性強(qiáng)、生長(zhǎng)快、易起捕、經(jīng)濟(jì)價(jià)值高等優(yōu)點(diǎn)，2019年被列為我國(guó)漁業(yè)主導(dǎo)養(yǎng)殖品種，在全國(guó)范圍內(nèi)推廣[8]，養(yǎng)殖面積與產(chǎn)量快速提升，2020年全國(guó)產(chǎn)量已達(dá)62 萬(wàn)t，并有進(jìn)一步發(fā)展的強(qiáng)勁勢(shì)頭。但隨著大口黑鱸養(yǎng)殖的快速發(fā)展，出現(xiàn)了如鰤諾卡菌病、運(yùn)動(dòng)性氣單胞菌病等細(xì)菌性疾?。卉?chē)輪蟲(chóng)病、斜管蟲(chóng)病等寄生蟲(chóng)病和大口黑鱸病毒病、大口黑鱸肝脾腫大病等病毒性疾病[9-10]，制約大口黑鱸養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展。近年來(lái)養(yǎng)殖大口黑鱸在冬春兩季發(fā)生一種以全身多處潰瘍?yōu)椴∽兲卣鞯囊卟?，給大口黑鱸養(yǎng)殖造成較為嚴(yán)重?fù)p失。本研究采集自然發(fā)病病例，采用病原學(xué)、病理學(xué)和分子生物學(xué)相結(jié)合的方法進(jìn)行檢測(cè)，以期明確大口黑鱸冬春季潰瘍病的病因，為有效防控該病提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料來(lái)源

2020年11月與2021年3月分別從四川眉山東坡區(qū)和洪雅縣兩地養(yǎng)殖場(chǎng)各采集患病明顯的6 尾大口黑鱸，體質(zhì)量均值(540.3±75.9) g。

1.2 病理剖檢與組織壓片觀察

按照常規(guī)方法進(jìn)行病理剖檢，觀察外部與內(nèi)臟器官的病理變化；取自然發(fā)病魚(yú)潰瘍?cè)?，置于載玻片上，制做組織壓片，置于顯微鏡下觀察并記錄。

1.3 組織病理學(xué)觀察及基于侵入絲囊霉菌ITS 基因的特異性PCR 檢測(cè)

取潰瘍?cè)钆c正常交接處組織與各內(nèi)臟臟器，用體積分?jǐn)?shù)為10%的福爾馬林固定，按常規(guī)石蠟切片的制作方法制作切片，進(jìn)行蘇木精-伊紅染色(Hematoxylin-eosin staining,HE)及基底膜六胺銀(Periodic acid-silver metheramine,PASM)染色，置于顯微鏡下觀察并記錄。用真菌DNA 提取試劑盒(Omega bio-tek)提取患魚(yú)病變肌肉組織DNA，作為PCR 反應(yīng)的模板，參考OIE 水產(chǎn)手冊(cè)[11]侵入絲囊霉菌診斷規(guī)程，合成ITS11、ITS23 引物，進(jìn)行基于霉菌ITS基因的PCR 檢測(cè)，預(yù)期擴(kuò)增目的條帶550 bp。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)10 g/L 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.4 侵入絲囊霉菌的分離培養(yǎng)與形態(tài)學(xué)觀察

真菌分離培養(yǎng)參照OIE 水產(chǎn)手冊(cè)[11]侵入絲囊霉菌診斷規(guī)程，取潰瘍組織置于葡糖糖/蛋白胨(Glucose and peotone，GP)瓊脂中，25 ℃條件下培養(yǎng)并每日觀察，多次分離和純化直到培養(yǎng)物無(wú)污染。帶菌絲體的瓊脂塊置于葡糖糖/蛋白胨/酵母(Glucose peotone and yeast，GPY)肉湯中于20 ℃條件下孵育。依次在5 個(gè)含滅菌池塘水的培養(yǎng)皿中洗滌培養(yǎng)物后，于滅菌池塘水20 ℃過(guò)夜。約12 h 后，在倒置顯微鏡下觀察。

1.5 分離侵入絲囊霉菌ITS 基因序列分析

用真菌DNA 提取試劑盒提取分離霉菌純培養(yǎng)物DNA，作為PCR 反應(yīng)的模板，使用“1.3”中引物序列及PCR 程序擴(kuò)增ITS部分基因，PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)10 g/L 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，目的條帶切膠回收，采用TA 克隆法，克隆至pUCm-T 載體送成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司測(cè)序，ITS基因測(cè)序結(jié)果同GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列進(jìn)行相似性比對(duì)分析，用Mega 11.0軟件采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 病理剖檢及組織壓片觀察

患病大口黑鱸體表有形態(tài)不規(guī)則、大小不等的紅斑及明顯的體表潰瘍，皮膚肌肉壞死、溶解，出血呈灰白色或血紅色(圖1A)，潰瘍主要位于背部與體側(cè)，但部分病魚(yú)潰瘍發(fā)生在尾鰭或頭部，頭部潰瘍導(dǎo)致顱骨破損與穿孔(圖1B、1C)。鰓與內(nèi)臟器官除肝色澤呈土黃色外，其他組織器官無(wú)明顯的眼觀病變。體表潰瘍組織壓片鏡檢，可見(jiàn)大量長(zhǎng)桿形、絲狀、分支較少的菌絲體在肌肉中分布(圖1D)。

圖1 自然感染大口黑鱸臨床癥狀及壓片觀察Fig.1 Clinical symptoms of naturally infected Micropterus salmoides and squashing tissue observation

2.2 組織病理學(xué)及基于侵入絲囊霉菌ITS 基因的特異性PCR 檢測(cè)

鏡下觀察HE 染色的潰瘍組織病理切片，皮膚表皮壞死、脫落；骨骼肌廣泛性變性、壞死，肌纖維橫紋消失，肌漿凝固，均質(zhì)紅染，甚至斷裂、溶解；肌間隙與壞死的肌纖維內(nèi)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)(圖2A)。特征性的病變是在病變的肌肉與皮膚真皮中分布有大量境界清晰的大小不等、圓形或橢圓形的霉菌性肉芽腫，肉芽腫中心為菌絲體(圖2B、2C)，PASM染色呈黑色(圖2D)，其外由大量上皮樣細(xì)胞包繞，再外則是纖維細(xì)胞圍繞形成境界清晰的肉芽腫結(jié)節(jié)。除肝有一定程度的空泡變性外，鰓、脾、腎與心等內(nèi)臟器官無(wú)明顯的病變，PASM 染色也未見(jiàn)菌絲體。從兩地患病魚(yú)潰瘍組織中提取霉菌DNA，基于侵入絲囊霉菌ITS基因的特異性PCR 檢測(cè)，結(jié)果呈陽(yáng)性(圖3)。

圖2 大口黑鱸組織病理學(xué)變化Fig.2 Histopathological lesions of Micropterus salmoides

圖3 侵入絲囊霉菌ITS 基因PCR 擴(kuò)增電泳圖Fig.3 Electropherogram of the PCR amplification product of Aphanomyces invadans ITS gene

2.3 侵入絲囊霉菌的分離與形態(tài)學(xué)觀察

從兩地患病魚(yú)潰瘍?cè)钊〉募∪鈮K置于GP 瓊脂，25 ℃條件下培養(yǎng)并每日觀察，至肉眼可見(jiàn)有纖細(xì)菌絲體在培養(yǎng)基上形成(分別命名為BW1 和BW3)，將分離純化的菌絲體連帶瓊脂塊轉(zhuǎn)移至GP 肉湯中。培養(yǎng)12 h 后在顯微鏡下觀察，可見(jiàn)形態(tài)單一、直徑10～30 nm 的纖細(xì)菌絲漂浮在GP 肉湯中(圖4A)。將菌絲從瓊脂塊洗脫后置于無(wú)菌池塘水中，20 ℃培養(yǎng)12 h后在倒置顯微鏡下觀察，可見(jiàn)原孢子囊在菌絲體體部形成(圖4B)。

圖4 侵入絲囊霉菌形態(tài)觀察Fig.4 Morphology of Aphanomyces invadans

2.4 分離絲囊霉菌ITS 基因序列分析

采用真菌DNA 提取試劑盒提取分離霉菌BW1 與BW3 的全基因組DNA 作為模板，使用侵入絲囊霉菌特異性引物PCR 擴(kuò)增ITS基因部分序列，結(jié)果擴(kuò)增出550 bp 的預(yù)期目的片段(圖3)，TA 克隆測(cè)序后上傳GenBank 獲得登錄號(hào)分別為ON175890 與ON175891。在以ITS部分基因序列及其近緣種的ITS序列采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖5)，BW1(ON175890) 和BW3(ON175891)與侵入絲囊霉菌聚為一支，其ITS基因序列相似性分別為99.64%和99.46%。

圖5 基于ITS 基因的分離霉菌BW1 和BW3 的系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.5 Phylogenetic tree of the isolated fungal strains BW1 and BW3 based on ITS gene sequences

3 討論與結(jié)論

大口黑鱸作為我國(guó)漁業(yè)重要主導(dǎo)養(yǎng)殖品種，時(shí)常發(fā)生以體表潰瘍?yōu)榕R床病變特征的疾病給其健康養(yǎng)殖造成威脅，現(xiàn)已報(bào)道引發(fā)大口黑鱸出現(xiàn)體表潰瘍的病原有維氏氣單胞菌Aeromonasveronii、溫和氣單胞菌A.sobria、弗氏檸檬酸桿菌Citrobacter freundii、鰤諾卡菌Nocardiaseriolae和大口黑鱸虹彩病毒(Largemouth bass ranavirus)等[12-14]。近年來(lái)養(yǎng)殖大口黑鱸在冬春兩季流行一種以潰瘍?yōu)榕R床病變特征的疫病，其病因尚不清楚，我們前期進(jìn)行了已報(bào)道相關(guān)病原的檢測(cè)，結(jié)果未檢出相關(guān)病毒，偶爾檢出運(yùn)動(dòng)性氣單胞菌，但并非所有的樣本都能檢出。本研究分別于2020年11月與2021年3月從四川兩養(yǎng)殖場(chǎng)采集自然發(fā)病病料，采用病原學(xué)、病理學(xué)和分子生物學(xué)相結(jié)合的方法對(duì)患病魚(yú)進(jìn)行研究，所有的患病魚(yú)發(fā)現(xiàn)相同的病理?yè)p傷特征，也均檢出侵入絲囊霉菌，從而證實(shí)大口黑鱸冬春季流行的潰瘍癥是侵入絲囊霉菌感染所致。該結(jié)果不僅為大口黑鱸冬春季流行的潰瘍癥的防控提供了依據(jù)，同時(shí)也表明侵入絲囊霉菌可自然感染大口黑鱸，并造成較為嚴(yán)重的危害，因此，在大口黑鱸養(yǎng)殖中對(duì)侵入絲囊霉菌感染引起的流行性潰瘍綜合癥(EUS)應(yīng)給予高度關(guān)注。

自1971年在日本報(bào)道侵入絲囊霉菌感染養(yǎng)殖香魚(yú)引發(fā)EUS 以來(lái)，EUS 已在非洲、澳洲、南亞和美洲等地多個(gè)國(guó)家流行，已知可感染160 多種魚(yú)類(lèi)，被認(rèn)為是水生動(dòng)物病原中感染宿主最廣的病原，對(duì)養(yǎng)殖與野生魚(yú)類(lèi)都造成較大危害[15-16]。在我國(guó)盡管不時(shí)有疑似EUS 的報(bào)道，但都未確診，直到2019年常藕琴等[7]發(fā)現(xiàn)在珠江三角洲養(yǎng)殖的雜交鱧潰瘍病是侵入絲囊霉菌感染所致，從而證實(shí)了侵入絲囊霉菌在我國(guó)的存在及其對(duì)養(yǎng)殖鱧的危害。本研究首次報(bào)道了侵入絲囊霉菌對(duì)我國(guó)養(yǎng)殖大口黑鱸的感染與致病，表明侵入絲囊霉菌不僅危害到我國(guó)養(yǎng)殖的雜交鱧，同時(shí)對(duì)養(yǎng)殖的大口黑鱸也造成危害。有報(bào)道表明，在印度1988年首次爆發(fā)EUS 后[17]，至2017年EUS 已對(duì)30 多種魚(yú)類(lèi)造成危害，尤其是印度鯉等的危害較為嚴(yán)重[18]。我國(guó)是世界水產(chǎn)養(yǎng)殖第一大國(guó)，水產(chǎn)養(yǎng)殖品種豐富，包括鲇形目、鯉形目與鱸形目的諸多品種，尤其是鯉形目的草魚(yú)、鯉、鯽、鰱鳙與鲇形目的黃顙魚(yú)等在我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖中具有重要的地位，因此，應(yīng)開(kāi)展侵入絲囊霉菌對(duì)我國(guó)上述重要水產(chǎn)養(yǎng)殖品種的易感性研究，同時(shí)開(kāi)展EUS 在我國(guó)的流行病學(xué)調(diào)查，以科學(xué)評(píng)估EUS 對(duì)我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖的威脅，同時(shí)為科學(xué)防控EUS 提供必要的參考。

本研究發(fā)現(xiàn)，侵入絲囊霉菌感染時(shí)，大口黑鱸肌肉中出現(xiàn)明顯的肉芽腫，與鰤諾卡菌感染大口黑鱸相似[19]，但鰤諾卡菌感染不僅在肌肉中出現(xiàn)肉芽腫，同時(shí)在腎、脾與肝等內(nèi)臟器官也很易發(fā)生，而前者僅見(jiàn)于肌肉中；另外，鰤諾卡菌感染形成的肉芽腫中心為干酪樣壞死[19]，而侵入絲囊霉菌感染中心為菌絲體，形成典型的霉菌性肉芽腫。Lilley 等[20]提出多核巨細(xì)胞和霉菌性肉芽腫是EUS 病理診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，據(jù)報(bào)道在斑點(diǎn)胡子鲇、歐洲鲇、短棘鮰和斑點(diǎn)叉尾鮰等魚(yú)類(lèi)與鱸形目的羅非魚(yú)發(fā)生EUS 時(shí)確實(shí)出現(xiàn)明顯的上述病變，但在烏鱧、攀鱸和無(wú)鰾石首魚(yú)等鱸形目魚(yú)類(lèi)則未見(jiàn)多核巨噬細(xì)胞，本研究中大口黑鱸感染侵入絲囊霉菌時(shí)形成的肉芽腫內(nèi)也未見(jiàn)多核巨噬細(xì)胞，出現(xiàn)這種差異的原因可能與不同種屬魚(yú)類(lèi)的先天免疫應(yīng)答差異有關(guān)[16,21]，因此，魚(yú)類(lèi)EUS 的診斷應(yīng)在潰瘍、霉菌性肉芽腫的病理學(xué)特征的基礎(chǔ)上，結(jié)合病原學(xué)的檢測(cè)才更為準(zhǔn)確。

鑒于EUS 的危害性，其已被我國(guó)列為動(dòng)物二類(lèi)疫病，一旦確診發(fā)生該病應(yīng)根據(jù)《中華人民共和國(guó)動(dòng)物防疫法》的相關(guān)要求采取嚴(yán)格控制、撲滅等措施，防止擴(kuò)散，養(yǎng)殖水體應(yīng)避免直接向天然水域排放，從而防止侵入性絲囊霉菌的子囊孢子更大范圍地傳播與擴(kuò)散[4]。盡管有研究表明，福爾馬林、H2O2、ZnO3納米顆粒與ClO2在體外具有一定的殺滅侵入性絲囊霉菌的作用[2,22]，但用于臨床病例的治療效果還有待評(píng)估，對(duì)于EUS 目前鮮有有效的治療方法。另有報(bào)道，EUS 暴發(fā)時(shí)水體pH 多在4.5～6.0[23]，同時(shí)飼料中添加決明子等中藥提取物與殼聚糖等能明顯增強(qiáng)魚(yú)類(lèi)抗侵入絲囊霉菌的能力[24-25]，因此，在大口黑鱸養(yǎng)殖過(guò)程中應(yīng)注重水質(zhì)的調(diào)控，同時(shí)在飼料中添加殼聚糖等免疫刺激劑以增強(qiáng)其免疫力，降低EUS 的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。