饒雪琴，唐 瑞，李華平

(廣東省微生物信號(hào)與病害防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院,廣東 廣州 510642)

香蕉Musaspp.是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物，由尖孢鐮刀菌古巴專(zhuān)化型(Fusariumoxysporumf.sp.cubense,Foc) 引起的香蕉枯萎病不斷擴(kuò)散蔓延，使我國(guó)香蕉產(chǎn)業(yè)發(fā)展嚴(yán)重受阻。根據(jù)Foc 在不同香蕉品種上的致病性差異，將其分為Foc1、Foc2和Foc4 等3 個(gè)不同生理小種[1]。按照病害發(fā)生的地理區(qū)域等因素，進(jìn)一步將Foc4 分為熱帶4 號(hào)小種(Tropical race 4，TR4) 和亞熱帶4 號(hào)小種(Subtropical race 4，STR4)[2]；Foc1 分布于世界各地，侵染范圍較廣[3]，而TR4 為目前世界各地香蕉中蔓延最廣、危害最重的香蕉枯萎病菌[2]。我國(guó)自1996年在廣東番禺大面積發(fā)現(xiàn)香蕉枯萎病以來(lái)，隨后在海南、福建、廣西和云南等地相繼發(fā)現(xiàn)Foc4 引起的香蕉枯萎病[4]。目前為害我國(guó)香蕉的枯萎病菌主要是Foc1 和Foc4 生理小種[5-6]，其中，F(xiàn)oc4 多數(shù)為T(mén)R4[7]，該菌在熱帶亞熱帶地區(qū)均有較強(qiáng)致病力，嚴(yán)重威脅我國(guó)香蕉產(chǎn)業(yè)[5]。研究Foc 侵染香蕉最常用的方法是利用激光共聚焦掃描顯微鏡觀(guān)察熒光蛋白標(biāo)記的Foc[8-9]。Li 等[8]采用綠色熒光蛋白標(biāo)記Foc TR4 和Foc1，然后分別接種巴西蕉，發(fā)現(xiàn)兩者侵入方式不同，F(xiàn)oc TR4 從表皮細(xì)胞間或者傷口侵入，而Foc1 只能通過(guò)傷口侵染。Xiao 等[10]發(fā)現(xiàn)綠色熒光蛋白標(biāo)記的Foc4 先侵入巴西蕉幼根表皮，隨后侵入球莖和假莖，F(xiàn)oc 菌絲在假莖中最多、球莖中最少。Dong 等[11]發(fā)現(xiàn)接種Foc 后 7 d，在巴西蕉假莖和葉鞘中均能檢測(cè)到標(biāo)記的Foc4，但檢測(cè)不到標(biāo)記的Foc1；接種后15～30 d，在葉片中能檢測(cè)到Foc4；在巴西蕉根和球莖中Foc4 菌量高于Foc1。劉磊等[12]通過(guò)平板菌落計(jì)數(shù)法發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oc 在香蕉植株內(nèi)的分布因樣地發(fā)病程度和植株部位不同差異顯著，球莖中的Foc 明顯高于其他部位。這些學(xué)者利用不同的方法研究香蕉枯萎病菌侵染過(guò)程，為香蕉枯萎病菌致病和病害流行提供了參考。香蕉枯萎病萎蔫癥狀主要是由于維管束堵塞造成營(yíng)養(yǎng)和水分運(yùn)輸受阻[8]。Foc 侵染過(guò)程反映了香蕉體內(nèi)Foc 的變化，而Foc 分布與其侵染和致病性直接相關(guān)。由于香蕉枯萎病是一種菌量依賴(lài)性病害[13]，土壤中病菌含量是決定香蕉植株能否發(fā)病以及病害嚴(yán)重程度的影響因素。目前鮮見(jiàn)枯萎病菌在病株土壤中空間分布的相關(guān)報(bào)道，探究香蕉枯萎病菌在寄主體內(nèi)和根際土壤中的分布是研究香蕉枯萎病菌致病機(jī)制和病害流行的重要基礎(chǔ)。本研究對(duì)香蕉植株內(nèi)及根際土壤中Foc 含量及分布進(jìn)行分析，旨在為香蕉枯萎病菌的侵染和致病機(jī)理研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料為對(duì)Foc1 抗病、對(duì)Foc4 感病的‘巴西蕉’MusaacuminateL.AAA group,cv.Brazilian。Foc 均為華南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病毒實(shí)驗(yàn)室保存，F(xiàn)oc4菌株為T(mén)R4 XJZ2(VCG 01216)，F(xiàn)oc1 菌株為Foc1 FJZ3(VCG 01221)。溫室試驗(yàn)取“五葉期”盆栽幼苗置于防蟲(chóng)網(wǎng)室中，大田種植于華南農(nóng)業(yè)大學(xué)教學(xué)科研基地。

1.2 樣品總DNA 抽提和引物合成

香蕉枯萎病菌總DNA、土壤總DNA 以及香蕉總DNA 提取分別采用MAGEN 生物公司的真菌DNA、土壤總DNA 以及廣譜性植物DNA 抽提試劑盒，具體方法參考說(shuō)明書(shū)。利用核酸蛋白分析儀測(cè)定DNA 濃度及D260 nm/D280 nm比值。

根據(jù)GenBank 中香蕉枯萎病病菌序列，利用Primer 3 分別設(shè)計(jì)Foc PCR 和實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物，引物由上海生物工程有限公司合成，具體見(jiàn)表1。本研究中引用的引物以及設(shè)計(jì)的引物經(jīng)試驗(yàn)證明，對(duì)相應(yīng)Foc 生理小種都有特異性[4,14-15]。

表1 本研究引物信息Table 1 The primers used in this study

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 方法

提取Foc 侵染的‘巴西蕉’根部DNA，以其為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。電泳后，將目的片段切膠回收，連接至pMD18-T 載體上。經(jīng)PCR 和酶切，鑒定為陽(yáng)性的重組質(zhì)粒送生工測(cè)序，選取相似性大于90%的作為陽(yáng)性重組質(zhì)粒，分析其濃度，計(jì)算拷貝數(shù)。以10 倍梯度稀釋的質(zhì)粒DNA 作為絕對(duì)定量標(biāo)準(zhǔn)品。標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)由系列稀釋的量化目標(biāo) DNA 和Ct值生成。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 進(jìn)行3 次生物學(xué)和技術(shù)重復(fù)。

1.4 香蕉枯萎病菌接種液的制備和接種

將-80 ℃保存的Foc1 和Foc4 菌種接種在PDA 固體培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 周。將無(wú)菌水洗脫的孢子添加至YPD 液體培養(yǎng)基中恒溫振蕩培養(yǎng)，F(xiàn)oc1 和Foc4 培養(yǎng)溫度分別為28 和26 ℃。培養(yǎng)3 d 后，將培養(yǎng)液離心，孢子沉淀用無(wú)菌水洗2 次，調(diào)整孢子濃度備用。

香蕉枯萎病菌溫室接種采用傷根接種法[11]，接種后的香蕉置于25～32 ℃溫室內(nèi)培養(yǎng)。Foc 孢子濃度為1×105mL-1，無(wú)菌水作空白對(duì)照，每個(gè)處理15 株幼苗。大田種植的健康‘巴西蕉’株高1 m左右接種，在每株植株半徑為0.5 m 內(nèi)用取土器傷根后，澆灌1.5×106mL-1的Foc 接種液1 L。Foc1 和Foc4 各接種5 株。

1.5 香蕉枯萎病調(diào)查和樣品收集

對(duì)接種后香蕉發(fā)病情況進(jìn)行調(diào)查，計(jì)算病情指數(shù)，枯萎病分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)參考Brake 等[16]。對(duì)接種Foc1 和Foc4 的盆栽幼苗分別于接種后2、4、6、8、10、14、21 d 采集根、球莖、球莖以上3～4 cm 處假莖和剛展開(kāi)的第1 葉進(jìn)行Foc 檢測(cè)。接種后30 d，對(duì)大田種植的‘巴西蕉’植株不同部位進(jìn)行PCR 檢測(cè)，采集病株不同方位(東、南、西、北)、離植株不同地面半徑(r分別為5、15、30 cm)處不同深度(h分別為0～5、10～15、25～30 cm)的土樣進(jìn)行混合，共獲得9 組土壤樣品，-20 ℃保存，試驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.6 ‘巴西蕉’植株和根際土壤中Foc1 和Foc4菌量及統(tǒng)計(jì)分析

分別提取接種Foc1 和Foc4 的‘巴西蕉’植株不同部位和不同土壤DNA 作為定量模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 擴(kuò)增。通過(guò)計(jì)算確定不同樣品中Foc1 和Foc4 菌量。試驗(yàn)數(shù)據(jù)均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件(IBM company,Armonk,America)進(jìn)行方差分析，采用Duncan’s 法檢驗(yàn)差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 方法的建立

分別以制備的重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板，建立Foc1 和Foc4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR。結(jié)果(圖1) 表明，F(xiàn)oc1 和Foc4 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)分別為1.05×108～1.05×102和7.09×108～7.09×102μL-1；所建立的2 種標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的決定系數(shù)(R2)均為0.999，Ct值與拷貝數(shù)線(xiàn)性關(guān)系良好，擴(kuò)增效率(E)分別為107.1%和94.1%，達(dá)到了實(shí)時(shí)熒光定量PCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的要求(R2> 0.98，90%

圖1 Foc1 和Foc4 質(zhì)粒DNA 標(biāo)準(zhǔn)品實(shí)時(shí)熒光定量PCRFig.1 Real-time quantitative PCR of Foc1 and Foc4 plasmid DNA standards

2.2 ‘巴西蕉’接種Foc1 和Foc4 的癥狀

Foc1 傷根接種‘巴西蕉’8 d 后，球莖開(kāi)始變褐，且隨時(shí)間增加褐變逐漸加重；在接種后21 d，‘巴西蕉’葉片保持綠色，說(shuō)明Foc1 侵染前期只影響根部和球莖，不影響地上部。而接種Foc4 后6 d，球莖變褐，并且隨著時(shí)間的增加褐變?cè)絹?lái)越嚴(yán)重。在接種后21 d，地上部葉片開(kāi)始變黃。說(shuō)明Foc4 對(duì)‘巴西蕉’致病性比Foc1 強(qiáng)。

2.3 Foc1 和Foc4 在‘巴西蕉’根部及球莖中的菌量變化

分別提取Foc1 和Foc4 接種的‘巴西蕉’根、球莖、假莖、葉組織總DNA 進(jìn)行PCR 檢測(cè)，結(jié)果表明，接種后21 d，只在根和球莖中檢測(cè)到Foc，而假莖和葉片中未檢測(cè)到。接種Foc 后2 d，在‘巴西蕉’根部采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 可以檢測(cè)到Foc1 和Foc4，拷貝數(shù)分別為(1.62×103±2.97×102)和(9.65×103±4.68×102) μL-1；接種后21 d，根部Foc1 和Foc4 拷貝數(shù)分別為(5.26×104±8.37×102) 和(1.48×107±9.78×105) μL-1(圖2A)，F(xiàn)oc 值達(dá)到最大。表明在接種后2～21 d，F(xiàn)oc1 和Foc4 在‘巴西蕉’根部不斷增加，且Foc4 菌量明顯高于Foc1。

圖2 Foc1 和 Foc4 侵染‘巴西蕉’后根部和球莖的菌量變化Fig.2 The Foc quantity in roots and rhizomes of Musa acuminate cv.Brazilian seedlings infected by Foc1 and Foc4

接種后2 d，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)‘巴西蕉’球莖中Foc，結(jié)果顯示，球莖中能檢測(cè)到Foc4，幾乎檢測(cè)不到Foc1；Foc1 的Ct值為35.01±0.15，超出了 PCR 的檢測(cè)范圍(15～35)；Foc4 的Ct值為30.54±0.14、拷貝數(shù)為(41.10±4.00)×102μL-1。接種后6 d，F(xiàn)oc 在球莖中迅速增加，F(xiàn)oc1 和Foc4 的Ct值分別為26.27±0.08 和24.43±0.07，拷貝數(shù)分別為(211.0±6.21)×102和(234.00±1.31)×103μL-1。接種后21 d，F(xiàn)oc1 和Foc4 的Ct值分別為23.74±0.16 和20.38±0.20，拷貝數(shù)分別為(168.00±3.90)×103和(350.00±9.79)×103μL-1(圖2B)。表明在接種Foc 后6～21 d 內(nèi)，F(xiàn)oc 積累減緩，21 d 時(shí)積累量達(dá)到最大，且Foc4 菌量均高于Foc1。

隨后，對(duì)‘巴西蕉’不同部位Foc 進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)接種后2 和4 d，球莖中Foc 菌量低于根部Foc。接種后6 d，球莖中Foc 菌量開(kāi)始高于根部。

2.4 大田‘巴西蕉’及根際土壤中的Foc1 和Foc4分析

大田中‘巴西蕉’接種Foc1 和Foc4 后30 d，球莖變褐，接種Foc4 的球莖比接種Foc1 的球莖變褐更明顯。分別取接種Foc1 和Foc4 的‘巴西蕉’周?chē)寥莱樘峥侱NA，并以提取的土壤DNA(D260 nm/D280 nm約1.8，DNA 約為20 ng)為模板進(jìn)行PCR，結(jié)果(圖3)顯示，PCR 擴(kuò)增目的條帶清晰，與預(yù)期大小一致。

圖3 接種Foc4(A)和Foc1(B)后‘巴西蕉’根際土壤DNA 的 PCR 檢測(cè)Fig.3 PCR detection of DNA in rhizosphere soil of Musa acuminate cv.Brazilian after inoculation with Foc4 (A) and Foc1 (B)

為研究Foc 在根際土壤中分布，取接種Foc1 后 30 d 的‘巴西蕉’根際土壤樣品進(jìn)行分析，結(jié)果(圖4A)顯示，在距離‘巴西蕉’植株地面半徑(r)5 cm、土壤深度25～30 cm 處Foc1 菌量最高，拷貝數(shù)為(2 115.91±54.47) μL-1；而r分別為15 和30 cm 時(shí)，在土壤深度10～15 cm 處Foc1 菌量最高，拷貝數(shù)分別為(604.31±174.86)和(471.23±24.31) μL-1。當(dāng)r分別為5、15 和30 cm 時(shí)，在土壤深度為0～5 cm處Foc1 菌量均最低，拷貝數(shù)分別為(670.23±44.83)、(377.33±32.98)和(328.23±17.83)μL-1，表明在‘巴西蕉’根際空間分布中，與‘巴西蕉’植株距離越近，土壤中Foc1 菌量越大；相同地面距離時(shí)，以土壤深度為10～15 或25～30 cm 的土壤中Foc1 菌量最大。

圖4 Foc1 和Foc4 接種‘巴西蕉’后在土壤中的分布Fig.4 Distribution of Foc1 and Foc4 in rhizosphere soil after inoculating on Musa acuminate cv.Brazilian

對(duì)接種后30 d 的‘巴西蕉’根際土壤中Foc4 分析結(jié)果(圖4B)表明，在r為5 cm 且土壤深度25～30 cm 處土壤中Foc4 菌量最大，拷貝數(shù)為(12 506.79±289.58) μL-1；在r為30 cm 且土壤深度25～30 cm 處土壤中Foc4 菌量最小，拷貝數(shù)為(220.39±41.11) μL-1。Foc4 在‘巴西蕉’根際空間分布規(guī)律與Foc1 基本相同，但是在相同r和土壤深度時(shí)，除r為30 cm 且土壤深度25～30 cm 外，其他土壤中Foc4 菌量均高于Foc1。

3 討論與結(jié)論

3.1 香蕉枯萎病菌侵染‘巴西蕉’過(guò)程中Foc 菌量變化

香蕉枯萎病菌生理小種Foc1 和Foc4 對(duì)不同香蕉致病性差異是當(dāng)前研究熱點(diǎn)之一，對(duì)致病性不同的Foc1 和Foc4 開(kāi)展空間分布研究，可以為香蕉枯萎病的流行、預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)以及病害防控提供科學(xué)依據(jù)。目前，利用激光共聚焦顯微鏡研究香蕉枯萎病菌侵染過(guò)程大多數(shù)在室內(nèi)進(jìn)行，該方法不能準(zhǔn)確計(jì)算病菌含量，且鮮見(jiàn)大田香蕉枯萎病菌含量的研究報(bào)道。實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 不用標(biāo)記菌株，操作相對(duì)簡(jiǎn)單，廣泛應(yīng)用于病毒[17]、細(xì)菌[18]等定量分析。本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 定量分析了香蕉植株不同部位Foc1 和Foc4 菌量，與激光共聚焦顯微鏡觀(guān)察結(jié)果相比[3,8-9]，能夠準(zhǔn)確地掌握Foc 侵染量，可以為香蕉枯萎病的預(yù)測(cè)提供科學(xué)依據(jù)。

在研究Foc 侵染過(guò)程中，不同的研究者結(jié)果不同。本研究結(jié)果表明，在接種Foc 后 2 d，‘巴西蕉’球莖中Foc 菌量遠(yuǎn)低于根部，這與Li 等[8]研究結(jié)果一致。Li 等[8]觀(guān)察到Foc4 可以侵入‘巴西蕉’球莖，而Foc1 在接種后2 個(gè)月都不能侵入‘巴西蕉’球莖。本研究中，接種后6 d 的‘巴西蕉’球莖中均能檢測(cè)到Foc1 和Foc4，說(shuō)明接種后6 d，F(xiàn)oc1 和Foc4 已侵入‘巴西蕉’球莖。Xiao 等[10]發(fā)現(xiàn)接種后10 d 時(shí)Foc4 侵入‘巴西蕉’球莖，17 d 時(shí)已從球莖擴(kuò)展到假莖，且假莖、根部和球莖Foc4 菌量依次減少。本研究接種后21 d 發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oc 在球莖中最多，根部次之，假莖和葉片幾乎沒(méi)有。這與Dong 等[11]研究結(jié)果一致，即在侵染前期，香蕉球莖Foc 菌量高于其他部位。Foc1 和Foc4 侵染‘巴西蕉’根部后，菌量不斷增加，在不同時(shí)間和空間內(nèi)Foc4 菌量均高于Foc1，說(shuō)明在‘巴西蕉’中Foc1 和Foc4 在侵染速度、定殖后的繁殖能力以及擴(kuò)展能力方面差異明顯。在侵染前期，F(xiàn)oc4 能從‘巴西蕉’根部擴(kuò)展至球莖、假莖中，而Foc1 僅能從根部擴(kuò)展至球莖[11]；這可能與Foc1 和Foc4 對(duì)‘巴西蕉’的致病力不同有關(guān)，或者與‘巴西蕉’對(duì)Foc1 和Foc4 的抗病性差異有關(guān)。有研究表明，由于Foc1 和Foc4 的致病力不同，導(dǎo)致侵染過(guò)程中與‘巴西蕉’抗病性相關(guān)的多種酶活性不同[15]，并且Foc 致病相關(guān)基因的表達(dá)也不同[3]，這些差異最終決定了Foc1 和Foc4 能否從球莖向上擴(kuò)展至地上部從而引起香蕉系統(tǒng)性病害。

3.2 香蕉枯萎病菌在根際土壤中的分布

香蕉根系由初生根、二級(jí)和三級(jí)次生根組成，初生根可能有幾米長(zhǎng)，二級(jí)和三級(jí)次生根只有幾厘米至1 m 長(zhǎng)，且主要分布在土壤表層[19-20]，土壤中的少量病原菌可能使香蕉植株發(fā)生嚴(yán)重病害[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，在r為5 cm、土壤深度25～30 cm 時(shí)，無(wú)論是致病性強(qiáng)的Foc4 還是致病性弱的Foc1 菌量均比其他土壤層高。Foc 在土壤中的這種分布可能與‘巴西蕉’根系生長(zhǎng)特性有關(guān)，即在r為5 cm 且土壤深度25～30 cm 處是‘巴西蕉’二級(jí)和三級(jí)次生根最多的地方，F(xiàn)oc 菌量最多，此處Foc 菌量與香蕉枯萎病發(fā)生流行密切相關(guān)。在根際土壤中，F(xiàn)oc1 菌量一般低于Foc4，這可能與Foc4 強(qiáng)致病力有關(guān)。

土壤中Foc 分布影響香蕉枯萎病的發(fā)生，在一定范圍內(nèi)，隨土壤中菌量增加香蕉枯萎病發(fā)生加重，當(dāng)超過(guò)某一范圍，香蕉枯萎病發(fā)生達(dá)到飽和而不再加重[20]。本研究也發(fā)現(xiàn)香蕉植株根際土壤中Foc 菌量與香蕉枯萎病嚴(yán)重度呈正相關(guān)[21]，這符合香蕉枯萎病的發(fā)生規(guī)律，說(shuō)明影響香蕉枯萎病發(fā)生的病菌主要是根際土壤中的Foc。

香蕉枯萎病菌的侵染過(guò)程包括Foc 接觸香蕉根部、侵入根表皮后建立寄生關(guān)系[3]，并不斷繁殖擴(kuò)展的過(guò)程；其侵染過(guò)程不但體現(xiàn)了Foc 與香蕉的相互作用，而且與香蕉枯萎病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[22]。本研究表明，F(xiàn)oc1 比Foc4 在‘巴西蕉’植株中擴(kuò)張慢、定殖量低，F(xiàn)oc1 和Foc4 通常在香蕉根際土壤中含量高，同一空間中的Foc4 菌量明顯高于Foc1?！臀鹘丁俏覈?guó)現(xiàn)階段主要栽培品種之一，對(duì)不同香蕉枯萎病菌在‘巴西蕉’植株及根際土壤中的空間分布研究為Focl 和Foc4 致病機(jī)理的研究及科學(xué)制定綜合防控策略提供了理論依據(jù)。