朱雪珍 ，張曉紅，桑 杰，周利娟

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院/綠色農(nóng)藥全國(guó)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東 廣州 510462)

活性氧(Reactive oxygen species，ROS)是植物有氧代謝以及逆境代謝過(guò)程中的產(chǎn)物?；钚匝鯀⑴c植物的生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞循環(huán)、細(xì)胞的程序性死亡、激素信號(hào)等生物過(guò)程，是調(diào)控各種生物和非生物脅迫反應(yīng)的重要信號(hào)分子[1-2]?；钚匝醯男再|(zhì)極為活潑，它的產(chǎn)生伴隨著植物正常的有氧代謝，當(dāng)植物受到環(huán)境脅迫時(shí)，如除草劑等外源化合物的脅迫，會(huì)誘導(dǎo)活性氧的產(chǎn)生[3-4]?；钚匝鹾恳坏┏隽酥参锏那宄芰?，就會(huì)與蛋白質(zhì)、脂類和DNA 等大分子物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，引起酶活性降低、膜透性增強(qiáng)及突變?cè)黾?，造成植物體細(xì)胞的氧化損傷甚至死亡[5]。活性氧水平的內(nèi)源性變化發(fā)揮著信號(hào)功能，并在適應(yīng)環(huán)境變化方面發(fā)揮積極作用[6-8]。所以測(cè)定植物體細(xì)胞內(nèi)ROS 含量的動(dòng)態(tài)變化對(duì)研究植物體內(nèi)活性氧的具體作用機(jī)制、ROS 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)以及植物的生長(zhǎng)發(fā)育等具有重要意義。

利用氧化還原敏感綠色熒光蛋白(roGFP)檢測(cè)活體氧化還原電位，是將一個(gè)本身不含二硫鍵且對(duì)生物系統(tǒng)沒(méi)有影響的蛋白，特異性地表達(dá)并定位到特定的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中的方法，可以無(wú)損傷地檢測(cè)活細(xì)胞內(nèi)的氧化還原電位。相比熒光染料[9-11]，roGFP探針因具備非破壞性、局域測(cè)定、可逆、實(shí)時(shí)和動(dòng)態(tài)的優(yōu)勢(shì)，成為評(píng)估細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的一種手段，適用于許多生物和細(xì)胞類型[9,12-17]。當(dāng)roGFP 感應(yīng)系統(tǒng)可用于哺乳動(dòng)物系統(tǒng)后，不同的roGFPs(roGFP1～4，roGFP-iX) 已被用作氧化還原傳感器[18-25]，廣泛應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域，從哺乳動(dòng)物到植物，尤其是在模式生物擬南芥中。且roGFP 在線粒體(Mitochondria-roGFP，mt-roGFP)中反映氧化還原電位的能力優(yōu)于在細(xì)胞質(zhì)(Cytoplasm-roGFP，croGFP)的[3]。

目前對(duì)擬南芥氧化還原電位影響的研究集中在干旱脅迫、高低溫和鹽潰等非生物逆境中，研究除草化合物對(duì)擬南芥氧化還原電位影響的相對(duì)較少。本試驗(yàn)測(cè)定不同作用機(jī)理的幾種商品化除草化合物和具有除草活性的植物源化合物小檗堿及其類似物[26-27]對(duì)mt-roGFP1 標(biāo)記的擬南芥轉(zhuǎn)基因植株根尖的根冠、分生區(qū)、過(guò)渡區(qū)和伸長(zhǎng)區(qū)在不同測(cè)定質(zhì)量濃度和時(shí)間下的氧化還原電位的影響，以期填補(bǔ)外源除草化合物脅迫下擬南芥細(xì)胞氧化還原電位變化的研究空白，分析除草化合物處理對(duì)植物細(xì)胞氧化還電位影響的變化規(guī)律，研究其對(duì)植物細(xì)胞起作用的方式，為應(yīng)用roGFP 探針技術(shù)研究除草化合物的作用機(jī)理提供新思路和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

擬南芥ArabidopsisthalianaL.Col 生態(tài)型，mtroGFP1 標(biāo)記的擬南芥轉(zhuǎn)基因植株由加州大學(xué)伯克利分校 Feldman Lewis J 教授提供。

超凈工作臺(tái)購(gòu)自蘇凈集團(tuán)安泰空氣技術(shù)有限公司；LRH-300-GⅡ光照培養(yǎng)箱購(gòu)自廣東省醫(yī)療器械廠；Zeiss Axiowert 熒光顯微鏡購(gòu)自德國(guó)ZEISS公司。

二甲戊靈、草甘膦：浙江新安化工集團(tuán)股份有限公司；氟樂(lè)靈、草銨膦：江蘇輝豐農(nóng)化股份有限公司；莠去津：利爾化學(xué)股份有限公司；環(huán)嗪酮：浙江欣禾化工有限公司；小檗堿：Sigma-Aldrich(上海)貿(mào)易有限公司；二氫小檗堿：四川省維克奇生物科技有限公司；次氯酸鈉(分析純)、赤霉素(分析純)、KNO3、NH4NO3、Ca(NO3)2、FeSO4·7H2O、MgSO4·7H2O、MnSO4·4H2O、CuSO4·5H2O、ZnSO4·7H2O、KH2PO4、H3BO3、MnCl2、NaCl、H2MoO4、CaCl2·2H2O、KI、NaMoO4·2H2O、CoCl2·6H2O 和Na2-EDTA(分析純)購(gòu)自廣州化學(xué)試劑廠；其他化合物均購(gòu)自成都瑞芬思生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 mt-roGFP1 標(biāo)記的擬南芥轉(zhuǎn)基因植株的培養(yǎng)

采用豎直培養(yǎng)皿法[3]培養(yǎng)mt-roGFP1 標(biāo)記的擬南芥轉(zhuǎn)基因植株。配制1/2 MS 培養(yǎng)基，并用1 mmol/L 的NaOH 溶液調(diào)節(jié)pH 至5.7～5.8，最后加入10 g/L 的瓊脂粉，121 ℃高溫滅菌20 min，放置干凈無(wú)菌環(huán)境備用。整個(gè)種植試驗(yàn)均在超凈工作臺(tái)進(jìn)行，先將mt-roGFP1 標(biāo)記的擬南芥轉(zhuǎn)基因種子放入無(wú)菌的2 mL 離心管中，用異丙醇溶液清洗消毒5 min，然后用1.5%(φ)的次氯酸鈉溶液充分浸泡10 min，再用無(wú)菌水清洗3～4 次，直至洗出液變?yōu)橥该鳎? ℃冰箱放置2～3 d，使種子春化以備用。將待用儀器及培養(yǎng)皿、培養(yǎng)基等放入超凈工作臺(tái)紫外滅菌30 min。用移液槍吸取20 mL 加熱溶化后的1/2 MS 培養(yǎng)基到10 cm×10 cm 方形培養(yǎng)皿中，待其完全冷卻凝固。用無(wú)菌水將春化后的mt-roGFP1標(biāo)記的擬南芥轉(zhuǎn)基因種子清洗3～4 次，用移液槍均勻播種到凝固培養(yǎng)基上，每皿50 顆種子，待水分完全蒸發(fā)后，封口膜封口。將培養(yǎng)皿豎直放置在光照強(qiáng)度4 000 lx、（22 ± 1）℃、16 h 光∶8 h 暗的光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)7 d。

1.2.2 擬南芥根尖透明化 待mt-roGFP1 標(biāo)記的擬南芥轉(zhuǎn)基因植株生長(zhǎng)至7 d，挑選長(zhǎng)勢(shì)一致、健康的擬南芥幼苗。將擬南芥植株用細(xì)胞透明液(HGG solution)透明化[28]后，使用Zeiss Axiowert 熒光顯微鏡拍攝。細(xì)胞透明液的配制：準(zhǔn)確稱取80 g ddH2O 和三氯乙醛溶液，加入10 mL 甘油和30 mL ddH2O，室溫下攪拌混勻并放置3～5 h。選擇長(zhǎng)勢(shì)一致的mt-roGFP1 標(biāo)記的擬南芥轉(zhuǎn)基因植株，直接放入細(xì)胞透明液中浸泡1 min，用鑷子輕輕取出，放在有1 滴10%(φ)甘油的干凈載玻片上，制片，在熒光顯微鏡(DIC 通道)下拍攝其明場(chǎng)圖片。

1.2.3 氧化還原電位的測(cè)量及分析 參考Jiang 等[29]的方法，待mt-roGFP1 標(biāo)記的擬南芥轉(zhuǎn)基因植株生長(zhǎng)7 d 后，挑選長(zhǎng)勢(shì)一致健康的擬南芥幼苗用作試驗(yàn)。熒光測(cè)量采用Zeiss Axiowert 熒光顯微鏡，激發(fā)波長(zhǎng)設(shè)置為410nm (DAPI 通道) 和470 nm(GFP 通道)，熒光值為505～530 nm發(fā)射波長(zhǎng)。選擇長(zhǎng)勢(shì)一致的mt-roGFP1 標(biāo)記的擬南芥轉(zhuǎn)基因植株，放在含有1 滴10%(φ)甘油的干凈載玻片上，制成玻片，在熒光顯微鏡(410 nm / 470 nm 通道)下拍攝熒光圖片，測(cè)量熒光強(qiáng)度，通過(guò)減去相鄰無(wú)細(xì)胞區(qū)域的熒光強(qiáng)度來(lái)校正每幅圖像的背景熒光強(qiáng)度，計(jì)算410 與470 nm 熒光強(qiáng)度比率。將同一擬南芥用外源化合物處理一定時(shí)間，重新測(cè)定410 與470 nm熒光比率；再將同一擬南芥用100 mmol/L H2O2溶液和DTT 溶液處理15 min，重新測(cè)定410 與470 nm熒光比率，即為最大和最小氧化還原電位時(shí)比率，最大氧化條件(100 mmol/L H2O2溶液)下的最大比值設(shè)定為1.00，最大還原條件(100 mmol/L DTT 溶液)下測(cè)得的最小比值設(shè)定為0.00，將最大還原值和氧化值歸一化，然后使用生成的校準(zhǔn)曲線將這些標(biāo)準(zhǔn)化的熒光比率轉(zhuǎn)換成氧化還原電位[29]。這些根尖的圖像在5 min 或更短時(shí)間內(nèi)被拍攝并測(cè)量保存。在根冠、分生區(qū)、過(guò)渡區(qū)及伸長(zhǎng)區(qū)中分別測(cè)量根尖的氧化還原電位。以Schwarzl?nder 等[30]的方法計(jì)算氧化還原電位。

氧化還原程度(OxDroGFP)計(jì)算如下：

式中，R為410、470 nm 時(shí)的熒光強(qiáng)度比率；Rred為使用100 m mol/L DTT 溶液處理時(shí)完全還原的熒光強(qiáng)度比率；Rox：使用100 mmol/L H2O2溶液處理時(shí)完全氧化的熒光強(qiáng)度比率；I470ox為完全氧化形式下470 nm 時(shí)的熒光強(qiáng)度；I470red為完全還原形式下470 nm 時(shí)的熒光強(qiáng)度。

氧化還原電位(O)計(jì)算如下：

式中，E0roGFP為roGFP 的中點(diǎn)電位(-272 mV，25.15 ℃，pH=7)；R為氣體常數(shù)(8.314 J·mol-1·K-1)；θ為溫度(298.15 K，25.15 ℃)；Z為轉(zhuǎn)移電子數(shù) (2)；F為法拉第常數(shù)(96 485.34 C·mol-1)。

1.2.4 除草化合物對(duì)擬南芥根尖細(xì)胞氧化還原電位的影響 選取不同作用機(jī)理的商品化除草劑(氨基酸生物合成抑制劑草甘膦和草銨膦、微管組裝抑制劑二甲戊樂(lè)靈和氟樂(lè)靈、光系統(tǒng)II 抑制劑莠去津和環(huán)嗪酮) 作為代表藥劑，選擇相同質(zhì)量濃度(20 mg·L-1)的不同藥劑，處理mt-roGFP1 標(biāo)記的擬南芥轉(zhuǎn)基因植株(15 min)，研究不同作用機(jī)理除草劑對(duì)mt-roGFP1 標(biāo)記的擬南芥轉(zhuǎn)基因植株根尖細(xì)胞氧化還原狀態(tài)的影響。測(cè)定方法同“1.2.3”。每個(gè)處理3 個(gè)重復(fù)。

1.2.5 草甘膦不同質(zhì)量濃度處理對(duì)擬南芥根尖細(xì)胞氧化還原電位的影響 選擇草甘膦為試驗(yàn)藥劑，用相同質(zhì)量濃度草甘膦、不同時(shí)間來(lái)處理mtroGFP1 標(biāo)記的擬南芥轉(zhuǎn)基因植株，研究不同作用時(shí)間對(duì)mt-roGFP1 標(biāo)記的擬南芥轉(zhuǎn)基因植株根尖細(xì)胞氧化還原狀態(tài)的影響。用不同質(zhì)量濃度草甘膦來(lái)處理mt-roGFP1 標(biāo)記的擬南芥轉(zhuǎn)基因植株，研究不同質(zhì)量濃度草甘膦對(duì)mt-roGFP1 標(biāo)記的擬南芥轉(zhuǎn)基因植株氧化還原狀態(tài)的影響。測(cè)定方法同“1.2.3”。每個(gè)處理3 個(gè)重復(fù)。

1.2.6 小檗堿及其類似物處理對(duì)擬南芥根尖細(xì)胞氧化還原電位的影響 選擇小檗堿及其10 種類似物做測(cè)試藥劑，用相同質(zhì)量濃度化合物來(lái)處理mtroGFP1 標(biāo)記的擬南芥轉(zhuǎn)基因植株，研究小檗堿及其10 種類似物對(duì)擬南芥根尖細(xì)胞氧化還原狀態(tài)的影響。測(cè)定方法同“1.2.3”。每個(gè)處理3 個(gè)重復(fù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用Excel 2010 處理數(shù)據(jù)，測(cè)定的數(shù)據(jù)均以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，試驗(yàn)重復(fù)3 次，相關(guān)試驗(yàn)數(shù)據(jù)均用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)，方差分析采用鄧肯氏新復(fù)極差多重比較法(Duncan’s multiple ranger test，DMRT)，數(shù)據(jù)處理由Office 2016 及Origin Pro 9.0 完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 擬南芥根尖細(xì)胞氧化還原電位測(cè)定

挑選長(zhǎng)勢(shì)一致健康的mt-roGFP1 標(biāo)記的擬南芥轉(zhuǎn)基因植株幼苗，經(jīng)透明化處理后制片觀察，并按“1.2.3”中的根尖分區(qū)測(cè)量擬南芥根尖根冠、分生區(qū)、過(guò)渡區(qū)和伸長(zhǎng)區(qū)的熒光強(qiáng)度變化(圖1)。

圖1 mt-roGFP1 標(biāo)記的擬南芥轉(zhuǎn)基因植株根尖透明化(A)及熒光分區(qū)(B)Fig.1 Root tip transparency (A) and fluorescence zoning(B) of mt-roGFP1 labeled transgenic Arabidopsis thaliana plants

在410 和470 nm 通道下拍攝mt-roGFP1 標(biāo)記的擬南芥轉(zhuǎn)基因植株根尖的熒光強(qiáng)度圖(圖2A、2B)、熒光強(qiáng)度—高度轉(zhuǎn)化圖(圖2C、2D)和熒光強(qiáng)度—高度轉(zhuǎn)化分區(qū)圖(圖2E、2F)。從圖2可以看出，生長(zhǎng)7 d 的擬南芥根尖分生區(qū)的熒光強(qiáng)度最大，根冠和分生區(qū)的最遠(yuǎn)端部分熒光強(qiáng)度較弱，隨著近端分生組織細(xì)胞停止分裂并逐漸進(jìn)入過(guò)渡區(qū)，熒光強(qiáng)度逐漸減弱。當(dāng)從過(guò)渡區(qū)進(jìn)入伸長(zhǎng)區(qū)時(shí)，熒光強(qiáng)度則變得更弱。

圖2 擬南芥根尖熒光強(qiáng)度圖Fig.2 Fluorescence intensity diagram of root tip of Arabidopsis thaliana

2.2 氨基酸生物合成抑制劑草甘膦和草銨膦對(duì)擬南芥根尖細(xì)胞氧化還原電位的影響

草甘膦和草銨膦對(duì)擬南芥根尖細(xì)胞氧化還原電位的影響見(jiàn)圖3A、3D。20 mg·L-1草甘膦處理擬南芥15 min 后，根冠、分生區(qū)、過(guò)渡區(qū)和伸長(zhǎng)區(qū)的氧化還原電位分別為-350.88、-351.82、-340.72 和-334.48 mV，從根冠到分生區(qū)呈現(xiàn)被還原趨勢(shì)，從分生區(qū)到伸長(zhǎng)區(qū)呈現(xiàn)出逐漸被氧化的趨勢(shì)(圖3A)。氧化還原電位變化量分別為29.68、22.77、19.98 和11.61 mV，各分區(qū)的氧化還原電位變化量之間存在顯著性差異（圖3D）。

圖3 不同作用機(jī)理商品化除草劑對(duì)擬南芥根尖細(xì)胞的氧化還原電位及變化量的影響Fig.3 Effects of commercial herbicides with different action mechanisms on redox potential and its changes of Arabidopsis thaliana root tip cells

20 mg·L-1草銨膦處理擬南芥15 min 后，根冠、分生區(qū)、過(guò)渡區(qū)和伸長(zhǎng)區(qū)的氧化還原電位分別為-291.42、-308.04、-313.18 和-310.43 mV，根冠達(dá)到最大電位，從根冠到過(guò)渡區(qū)呈現(xiàn)出逐漸被還原的趨勢(shì)，在過(guò)渡區(qū)達(dá)到最小電位值，各分區(qū)的氧化還原電位值之間存在明顯差異。處理前后的氧化還原電位變化量分別為-3.80、15.32、19.67 和20.43 mV，各分區(qū)的氧化還原電位變化量之間存在顯著性差異(圖3D)。

2.3 微管組裝抑制劑二甲戊靈和氟樂(lè)靈對(duì)擬南芥根尖細(xì)胞氧化還原電位的影響

二甲戊靈和氟樂(lè)靈對(duì)擬南芥根尖細(xì)胞氧化還原電位的影響見(jiàn)圖3B、3E。二甲戊靈處理擬南芥15 min 后，根冠、分生區(qū)、過(guò)渡區(qū)和伸長(zhǎng)區(qū)的氧化還原電位分別為-333.02、-342.85、-328.21 和-320.24 mV，從根冠到分生區(qū)呈現(xiàn)出逐漸被還原的趨勢(shì)，在分生區(qū)達(dá)到最小電位后，從分生區(qū)到伸長(zhǎng)區(qū)呈現(xiàn)出逐漸被氧化的趨勢(shì)，在伸長(zhǎng)區(qū)達(dá)到最大電位(圖3B)，各分區(qū)的氧化還原電位之間存在明顯差異。處理前后的氧化還原電位變化量分別為-6.55、-1.25、-0.86 和-4.57 mV，分生區(qū)和過(guò)渡區(qū)氧化還原電位變化量之間沒(méi)有顯著性差異(圖3E)。

20 mg·L-1氟樂(lè)靈處理擬南芥15 min 后，根冠、分生區(qū)、過(guò)渡區(qū)和伸長(zhǎng)區(qū)的氧化還原電位分別為-352.74、-357.08、-343.61 和-339.95 mV，從根冠到分生區(qū)呈現(xiàn)出逐漸被還原的趨勢(shì)，在分生區(qū)達(dá)到最小電位后，從分生區(qū)到伸長(zhǎng)區(qū)呈現(xiàn)出逐漸被氧化的趨勢(shì)，在伸長(zhǎng)區(qū)達(dá)到最大電位，各分區(qū)的氧化還原電位之間存在明顯差異(圖3B)。處理前后的氧化還原電位變化量分別為2.96、14.36、11.99 和-2.64 mV，各分區(qū)的氧化還原電位變化量之間存在顯著性差異(圖3E)。

2.4 光系統(tǒng)Ⅱ抑制劑莠去津和環(huán)嗪酮對(duì)擬南芥根尖細(xì)胞氧化還原電位的影響

莠去津和環(huán)嗪酮對(duì)擬南芥根尖細(xì)胞氧化還原電位的影響見(jiàn)圖3C 和圖3F。20 mg·L-1莠去津處理擬南芥15 min 后，根冠、分生區(qū)、過(guò)渡區(qū)和伸長(zhǎng)區(qū)的氧化還原電位分別為-345.70、-360.72、-335.48 和-329.08 mV，從根冠到分生區(qū)呈現(xiàn)出逐漸被還原的趨勢(shì)，在分生區(qū)達(dá)到最小電位后，從分生區(qū)到伸長(zhǎng)區(qū)呈現(xiàn)出逐漸被氧化的趨勢(shì)，在伸長(zhǎng)區(qū)達(dá)到最大電位，各分區(qū)的氧化還原電位之間存在明顯差異(圖3C)。處理前后的氧化還原電位變化量分別為13.06、10.96、10.99 和12.47 mV，分生區(qū)和過(guò)渡區(qū)氧化還原電位變化量之間沒(méi)有顯著性差異(圖3F)。20 mg·L-1環(huán)嗪酮處理擬南芥15 min 后，根冠、分生區(qū)、過(guò)渡區(qū)和伸長(zhǎng)區(qū)的氧化還原電位分別為-341.59、-356.23、-329.06 和-319.47 mV，從根冠到分生區(qū)呈現(xiàn)出逐漸被還原的趨勢(shì)，在分生區(qū)達(dá)到最小電位后，從分生區(qū)到伸長(zhǎng)區(qū)呈現(xiàn)出逐漸被氧化的趨勢(shì)，在伸長(zhǎng)區(qū)達(dá)到最大電位，各分區(qū)的氧化還原電位值之間存在明顯差異(圖3C)。處理前后的氧化還原電位變化量分別為8.92、8.43、3.61 和1.49 mV(圖3F)。

從不同作用機(jī)理商品化除草劑對(duì)擬南芥根尖細(xì)胞氧化還原電位的影響可以看出，除草銨膦外的5 種化合物的氧化還原電位均在分生區(qū)達(dá)到最小值，隨后從過(guò)渡區(qū)到伸長(zhǎng)區(qū)逐漸變大。

2.5 草甘膦不同處理時(shí)間對(duì)擬南芥根尖細(xì)胞氧化還原電位的影響

20 mg·L-1草甘膦不同處理時(shí)間對(duì)擬南芥根尖細(xì)胞氧化還原電位的影響見(jiàn)圖4A。擬南芥經(jīng)20 mg·L-1的草甘膦處理24、48、72 h 后，24 和48 h時(shí)的擬南芥生長(zhǎng)狀況良好，處理72 h 時(shí)，擬南芥出現(xiàn)軟化黃化情況。處理24 h 后，根冠、分生區(qū)、過(guò)渡區(qū)和伸長(zhǎng)區(qū)的氧化還原電位分別為-373.88、-373.39、-371.41 和-369.17 mV，根冠與分生區(qū)的氧化還原電位之間沒(méi)有顯著差異。處理48 h 后，根冠、分生區(qū)、過(guò)渡區(qū)和伸長(zhǎng)區(qū)的氧化還原電位分別為-367.95、-369.91、-366.36 和-366.33 mV，分生區(qū)與其他3 個(gè)分區(qū)的氧化還原電位之間存在顯著差異。處理72 h 后，根冠、分生區(qū)、過(guò)渡區(qū)和伸長(zhǎng)區(qū)的氧化還原電位分別為-369.52、-372.26、-371.51 和-374.43 mV，分生區(qū)與過(guò)渡區(qū)的氧化還原電位之間不存在顯著差異，其他分區(qū)間存在顯著差異。

圖4 草甘膦不同處理時(shí)間對(duì)擬南芥根尖細(xì)胞氧化還原電位的影響Fig.4 Effect of glyphosate with different treatment time on redox potential of Arabidopsis thaliana root tip cells

從草甘膦(20 mg·L-1)處理24、48、72 h 對(duì)擬南芥氧化還原電位的影響(圖4A) 中可以看出，24 和48 h 的氧化還原電位都從分生區(qū)到伸長(zhǎng)區(qū)逐漸呈現(xiàn)被氧化的趨勢(shì)，但72 h 的氧化還原電位從分生區(qū)到伸長(zhǎng)區(qū)逐漸被還原，在伸長(zhǎng)區(qū)達(dá)到最大還原狀態(tài)。

擬南芥經(jīng)20 mg·L-1草甘膦處理24 h 后，在過(guò)渡區(qū)達(dá)到最大氧化還原電位變化量為32.05 mV，在伸長(zhǎng)區(qū)達(dá)到最小氧化還原電位變化量(22.14 mV)，根冠與分生區(qū)的氧化還原電位變化量之間沒(méi)有顯著性差異，其他各分區(qū)的變化量之間都存在顯著性差異(圖4B)。處理48 h 后，在根冠達(dá)到最大氧化還原電位變化量(28.36 mV)，在伸長(zhǎng)區(qū)達(dá)到最小氧化還原電位變化量為18.21 mV，根冠與過(guò)渡區(qū)的氧化還原電位變化量之間沒(méi)有顯著性差異，其它各分區(qū)的變化量之間都存在顯著差異(圖4B)。處理72 h 后，在分生區(qū)到最大氧化還原電位變化量(35.93 mV)，在伸長(zhǎng)區(qū)達(dá)到最小氧化還原電位變化量(23.45 mV)，各分區(qū)的氧化還原電位變化量之間都存在顯著差異(圖4B)。每個(gè)處理時(shí)間的氧化還原電位變化閾值之間相差約10 mV，氧化還原電位變化量與處理時(shí)間之間未呈現(xiàn)顯著的相關(guān)性(圖5)。

圖5 不同質(zhì)量濃度草甘膦對(duì)擬南芥根尖細(xì)胞氧化還原電位變化的影響Fig.5 Effects of different concentrations of glyphosate on redox potential of Arabidopsis thaliana root tip cells

2.6 不同質(zhì)量濃度草甘膦處理對(duì)擬南芥根尖細(xì)胞氧化還原電位的影響

不同質(zhì)量濃度的草甘膦處理對(duì)擬南芥根尖細(xì)胞氧化還原電位影響顯著(圖5A)。處理質(zhì)量濃度為10 mg·L-1時(shí)，在根冠達(dá)到最小電位(-368.72 mV)，在伸長(zhǎng)區(qū)達(dá)到最大電位(-338.64 mV)；處理質(zhì)量濃度為20 mg·L-1時(shí)，在分生區(qū)達(dá)到最小電位(-351.82 mV)，在伸長(zhǎng)區(qū)達(dá)到最大電位(-334.48 mV)；處理質(zhì)量濃度為50 mg·L-1時(shí)，在伸長(zhǎng)區(qū)達(dá)到最小電位(-367.14 mV)，在根冠達(dá)到最大電位(-361.35 mV)。10 和20 mg·L-1的氧化還原電位均在分生區(qū)達(dá)到最小，在伸長(zhǎng)區(qū)達(dá)到最大，50 mg·L-1的氧化還原電位呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì)。

從氧化還原電位變化量(圖5B) 來(lái)看，10 和20 mg·L-1草甘膦處理的變化量有顯著性差異，但在過(guò)渡區(qū)和伸長(zhǎng)區(qū)的氧化還原電位變化量未發(fā)生明顯變化(圖5)，50 mg·L-1草甘膦處理時(shí)，氧化還原電位變化量變大。3 個(gè)質(zhì)量濃度的氧化還原電位變化量在根冠及過(guò)渡區(qū)之間均呈現(xiàn)顯著性差異。草甘膦質(zhì)量濃度增大，mt-roGFP1 標(biāo)記的擬南芥轉(zhuǎn)基因植株的氧化還原電位變化量增大，說(shuō)明氧化還原電位變化量與質(zhì)量濃度大小之間存在相關(guān)性，線性回歸方程為y=0.29x+21.57，R2=0.995 6。

2.7 小檗堿及其類似物處理對(duì)擬南芥根尖細(xì)胞氧化還原電位的影響

20 mg·L-1小檗堿及其類似物處理擬南芥15 min后，擬南芥根尖各分區(qū)細(xì)胞氧化還原電位和氧化還原電位變化量如圖6所示。氧化還原電位的結(jié)果(圖6A)表明，小檗堿及其類似物對(duì)擬南芥根尖細(xì)胞的氧化還原電位均有影響。經(jīng)小檗堿、鹽酸血根堿、白屈菜堿、D-四氫藥根堿、羅通定處理后，擬南芥根部各分區(qū)細(xì)胞氧化還原電位多數(shù)從根冠開(kāi)始呈現(xiàn)逐漸被氧化趨勢(shì)，在伸長(zhǎng)區(qū)達(dá)到最大氧化電位，且各分區(qū)氧化還原電位之間都存在明顯差異。經(jīng)巴馬汀、二氫小檗堿、去亞甲基小檗堿、甲基黃連堿處理后，擬南芥根部細(xì)胞氧化還原電位從根冠到分生區(qū)呈現(xiàn)被還原趨勢(shì)，且在分生區(qū)達(dá)到最大還原值。氧化還原電位的變化量結(jié)果(圖6B)表明，小檗堿及其類似物與對(duì)照藥劑草甘膦的氧化還原電位變化量之間存在明顯差異，小檗堿4 個(gè)分區(qū)的變化量之間有明顯差異，各化合物的變化量各不相同。

圖6 小檗堿及其類似物對(duì)擬南芥根尖細(xì)胞氧化還原電位及其變化量的影響Fig.6 Effects of berberine and analogues on redox potential and its changes of Arabidopsis thaliana root tip cells

3 討論與結(jié)論

roGFP 感應(yīng)系統(tǒng)在檢測(cè)植物細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)變化具有快速、可逆、動(dòng)態(tài)和實(shí)時(shí)等優(yōu)點(diǎn)，尤其是對(duì)擬南芥、煙草等模式植物的研究可探測(cè)從細(xì)胞到組織的氧化還原水平[31-32]。本研究在mt-roGFP1 標(biāo)記的擬南芥轉(zhuǎn)基因植株根尖細(xì)胞中檢測(cè)到mtroGFP1 探針響應(yīng)外源氧化劑(H2O2)和外源還原劑(DTT) 引起的氧化還原狀態(tài)的變化，證明了mtroGFP1 探針的靈敏性和可逆性[33]。用外源氧化劑處理擬南芥時(shí)，mt-roGFP1 探針被氧化，其熒光強(qiáng)度比率升高，用外源還原劑處理時(shí)，mt-roGFP1 探針被還原，熒光強(qiáng)度比率降低，證明mt-roGFP1 探針能夠響應(yīng)組織中氧化還原狀態(tài)的改變，試驗(yàn)結(jié)果與前人的研究結(jié)果[33]相一致。

基于mt-roGFP1 探針，通過(guò)測(cè)定6 種不同靶標(biāo)商品化除草化合物對(duì)mt-roGFP1 標(biāo)記的擬南芥轉(zhuǎn)基因植株根尖的根冠、分生區(qū)、過(guò)渡區(qū)和伸長(zhǎng)區(qū)4 個(gè)區(qū)域的氧化還原電位的影響，結(jié)果表明：氨基酸生物合成抑制劑(草甘膦和草銨膦)和微管組裝抑制劑(二甲戊靈和氟樂(lè)靈)處理后的細(xì)胞氧化還原電位變化規(guī)律呈現(xiàn)為：在分生區(qū)達(dá)到最大還原值，并從過(guò)渡區(qū)開(kāi)始呈現(xiàn)被氧化的趨勢(shì)，在伸長(zhǎng)區(qū)達(dá)到最大氧化值。Jiang 等[34]也曾指出在伸長(zhǎng)區(qū)2 種形式的roGFP1(c- roGFP1 和mt- roGFP1)都顯示出比分生區(qū)更氧化的靜息氧化還原狀態(tài)，且伸長(zhǎng)區(qū)更氧化的狀態(tài)可能與細(xì)胞壁疏松和植物細(xì)胞擴(kuò)張等因素有關(guān)。光系統(tǒng)II 抑制劑(莠去津和環(huán)嗪酮)處理后的氧化還原電位呈現(xiàn)規(guī)律性變化，在分生區(qū)達(dá)到最小值，并從分生區(qū)開(kāi)始，以逐漸被氧化的趨勢(shì)在伸長(zhǎng)區(qū)達(dá)到最大值，說(shuō)明mt-roGFP1 熒光探針能更好地響應(yīng)光系統(tǒng)II 抑制劑。另外，通過(guò)不同質(zhì)量濃度草甘膦處理擬南芥不同時(shí)間后發(fā)現(xiàn)，草甘膦對(duì)擬南芥根細(xì)胞氧化還原電位和電位變化量的影響具有明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系，即草甘膦質(zhì)量濃度增大，氧化還原電位值變化量也逐漸增大，呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系(R2=0.995 6)。植物源化合物小檗堿及其類似物對(duì)擬南芥根尖的氧化還原電位影響的結(jié)果表明，經(jīng)鹽酸血根堿、白屈菜堿、D-四氫藥根堿、羅通定和二氫小檗堿處理后，各分區(qū)氧化還原電位之間存在顯著差異；且大多數(shù)化合物處理后的氧化還原電位在分生區(qū)達(dá)到最大還原值，并從分生區(qū)到伸長(zhǎng)區(qū)逐漸被氧化，在伸長(zhǎng)區(qū)達(dá)到最大氧化值。此外，通過(guò)6 種不同作用機(jī)理的除草化合物和小檗堿及其類似物對(duì)氧化還原電位產(chǎn)生的不同影響也可說(shuō)明，小檗堿的作用機(jī)理不同于前述6 種商品化除草化合物，這與以往對(duì)小檗堿機(jī)理的研究[35]相符。

綜上，經(jīng)幾種除草化合物和小檗堿及其類似物不同時(shí)間和不同質(zhì)量濃度處理后，擬南芥根尖細(xì)胞氧化還原電位呈現(xiàn)規(guī)律性變化，即氧化還原電位均從根冠開(kāi)始逐漸被還原，在分生區(qū)達(dá)到最大還原值，從分生區(qū)到伸長(zhǎng)區(qū)逐漸被氧化，說(shuō)明植物根部分生區(qū)氧化還原電位響應(yīng)不同化合物的脅迫時(shí)表現(xiàn)出更明顯的被還原趨勢(shì)，因此，測(cè)定分析擬南芥根尖熒光強(qiáng)度和氧化還原電位的變化情況時(shí)，可選取分生區(qū)為主要觀察區(qū)域。這為采用roGFP 探針技術(shù)研究除草化合物對(duì)根系細(xì)胞線粒體作用的機(jī)制提供了基礎(chǔ)。

致謝：感謝加州大學(xué)伯克利分校Feldman Lewis J 教授和Jiang Keni 博士給予的技術(shù)指導(dǎo)和幫助！