錢加珺 ，張文德，張佳欣，趙 蕭，趙浩東，高旭澤，朱樂冉，陳大福，付中民，郭 睿

(福建農(nóng)林大學 動物科學學院(蜂學學院)/福建省蜂療研究所,福建 福州 350002)

東方蜜蜂微孢子蟲Nosemaceranae是一種專性侵染成年蜜蜂中腸上皮細胞的單細胞真菌病原，對蜂王、工蜂、雄蜂和幼蟲均有感染性[1]。東方蜜蜂微孢子蟲侵染能引起蜜蜂中腸上皮細胞結(jié)構(gòu)破壞、細胞凋亡和免疫應答抑制，哺育力下降，壽命縮短，嚴重影響蜂群群勢和生產(chǎn)力[2]。目前，東方蜜蜂微孢子蟲的參考基因組[3]和全長轉(zhuǎn)錄組[4]均已公布，為深入開展相關(guān)分子生物學研究奠定了基礎。

染色體結(jié)構(gòu)維持(Structural maintenance of chromosome，SMC)蛋白在細菌、古生菌和真核生物中廣泛存在，可直接參與染色體的形成與結(jié)構(gòu)維持等動態(tài)變化及DNA 的復制、重組和修復等過程，因而對染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的組織、細胞分裂過程中遺傳物質(zhì)的準確分離等均具有關(guān)鍵作用[5]。在水稻中，SMC1和SMC3-1基因被證實參與DNA 雙鏈斷裂損傷修復和有絲分裂等生物學過程[6]。作為SMC 復合體蛋白的成員之一，凝聚蛋白復合體Ⅰ通過分級折疊啟動早期的染色質(zhì)凝聚，起到塑造、穩(wěn)定染色體的作用[7]。敲除凝聚蛋白復合體Ⅰ或Ⅱ的特異亞基均能引起中期染色體結(jié)構(gòu)的明顯異常[8]。然而對于東方蜜蜂微孢子蟲，SMC 相關(guān)研究至今依然缺失。

近期，筆者團隊測定了nce-miR-15325 及其靶向的核凝聚復合體亞基(Nuclear condensin complex subunit，NCCS)基因在東方蜜蜂微孢子蟲侵染意大利蜜蜂工蜂過程中的表達譜，并發(fā)現(xiàn)nce-miR-15325 與NCCS具有相似的表達規(guī)律。本研究利用生物信息學方法解析東方蜜蜂微孢子蟲NCCS編碼的SMC 的分子特性，預測和分析東方蜜蜂微孢子蟲和其他物種SMC 的保守基序和結(jié)構(gòu)域，并進行系統(tǒng)進化分析，以期豐富東方蜜蜂微孢子蟲SMC的基礎信息，并為深入開展相關(guān)功能研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 SMC 的分子特性分析

根據(jù)前期基于東方蜜蜂微孢子蟲轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[9]預測出的NCCS序列，利用NCBI 網(wǎng)站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上的ORF 工具預測相應的氨基酸序列。通過Expasy 網(wǎng)站(https://www.espasy.org/resources)上的Protparam、ProtScale 和SWISS-model 等軟件分析SMC 的理化性質(zhì)、親水性和三級結(jié)構(gòu)。使用SignalP 4.1 Server、NetPhos 3.1 Server、TMHMM 及SOPMA 等軟件[10]預測SMC 的信號肽、磷酸化位點、跨膜結(jié)構(gòu)域和二級結(jié)構(gòu)。采用PSORTⅡ軟件(https://www.genscript.com/psort.html)[11]進行SMC 的亞細胞定位預測。

1.2 SMC 的保守基序和結(jié)構(gòu)域預測

使用MEME 軟件(https://meme-suite.org/)[12]預測東方蜜蜂微孢子蟲、海倫腦炎微孢子蟲

1.3 SMC 蛋白的系統(tǒng)進化分析

Encephalitozoon hellem、菲尼斯畢羅酵母Piromycescfinnis、發(fā)廯菌Trichophytontonsurans和黑曲霉Aspergillusmelleus等10 個物種SMC 的保守基序。通過Pfam 網(wǎng)站(http://pfam.xfam.org/search#tabview=tab1)查找東方蜜蜂微孢子蟲等10 個物種SMC 保守結(jié)構(gòu)域相關(guān)信息。采用TBtools 軟件預測上述10 個物種SMC 的結(jié)構(gòu)域，選擇默認參數(shù)。

利用Blast 工具將東方蜜蜂微孢子蟲SMC 氨基酸序列比對到NCBI GenBank 數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)，搜索序列相似性較高的其他物種的SMC。通過Mega 11.0 軟件[13]對東方蜜蜂微孢子蟲和其他物種的SMC 進行氨基酸序列多重比對，采用鄰接法構(gòu)建基于SMC 的系統(tǒng)進化樹，選擇軟件默認參數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 SMC 的分子特性

東方蜜蜂微孢子蟲NCCS含有3 093 個核苷酸，編碼的SMC 含有1 102 個氨基酸。SMC 的分子式為C5 787H9 418N1 526O1 771S41，相對分子質(zhì)量約130 020，等電點為8.28；包含195 個負電荷氨基酸，其中天冬氨酸和谷氨酸分別有67 和128 個；包含202 個正電荷氨基酸，其中賴氨酸和精氨酸分別有169 和33 個；含量最高和最低的氨基酸分別為賴氨酸和色氨酸(表1)。

表1 東方蜜蜂微孢子蟲SMC 的氨基酸組成Table 1 Amino acid composition of SMC in Nosema ceranae

SMC 的脂溶系數(shù)為93.49，平均親水系數(shù)為-0.740，親水氨基酸數(shù)量比疏水氨基酸多(圖1A)，說明該蛋白為親水性蛋白。SMC 中不存在典型的信號肽，說明其為胞內(nèi)蛋白(圖1B)。另外，在SMC中預測到104 個磷酸化位點，包含50 個絲氨酸、26 個酪氨酸和28 個蘇氨酸磷酸化位點(圖1C)。

二級結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示，SMC 含有787 個(71.42%)α-螺旋，106 條(9.62%)β-折疊，49 個(4.45%)β-轉(zhuǎn)角和160 個(14.52%) 無規(guī)則卷曲(圖2A)。三級結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示，SMC 的模板為6yvu.1.B，序列相似性為31.26%，其中61.00%的殘基自信度達80%以上(圖2B)。此外，SMC 同時定位于細胞核、細胞質(zhì)和線粒體，占比分別為78.30%、8.70%和13.00%。

2.2 SMC 的保守基序與結(jié)構(gòu)域分析

在東方蜜蜂微孢子蟲SMC 中預測到9 個保守基序，分別為Motif 1、2、3、4、5、6、7、8、9；類似地，在海倫腦炎微孢子蟲、顆粒病微孢子蟲Nosema granulosis、麥格水蚤漢氏孢蟲Hamiltosporidium magnivora、康氏泰羅漢孢蟲Thelohaniacontejeani、菲尼斯畢羅酵母、指間毛廯菌Trichophyton interdigitale、紫色毛廯菌Trichophytonviolaceum、發(fā)廯菌和黑曲霉的SMC 中同樣預測上述9 個Motif(圖3)，說明SMC 在東方蜜蜂微孢子蟲和其他真菌物種中高度保守。

圖3 東方蜜蜂微孢子蟲和其他9 個物種SMC 包含的保守基序Fig.3 Conserved motifs included in SMC of Nosema ceranae and other nine species

在東方蜜蜂微孢子蟲SMC 中預測到4 個結(jié)構(gòu)域，包括1 個SMC_N、1 個SMC_hinge、1 個AAA_29 和1 個AAA_23；在海倫腦炎微孢子蟲、指間毛廯菌和黑曲霉SMC 中同樣預測到1 個SMC_N、1 個SMC_hinge、1 個AAA_23 和1 個AAA_21；在顆粒病微孢子蟲、麥格水蚤漢氏孢蟲TBU02480.1 和康氏泰羅漢孢蟲SMC 中預測到2 個相同的結(jié)構(gòu)域，包括1 個SMC_N 和1 個SMC_hinge；在麥格水蚤漢氏孢蟲TBU02444.1 SMC 中預測到6 個結(jié)構(gòu)域，包括1 個SMC_N、1 個SMC_hinge、1 個AAA_29、1 個AAA_21、1 個AAA_23 和1 個AAA_15；在菲尼斯畢羅酵母SMC 中預測到5 個結(jié)構(gòu)域，包括1 個SMC_N、1 個SMC_hinge、1 個AAA_29、1 個AAA_21 和1 個AAA_23；在紫色毛廯菌SMC 中預測到3 個結(jié)構(gòu)域，包括1 個SMC_N、1 個SMC_hinge 和1 個AAA_15；在發(fā)廯菌SMC 中預測到3 個結(jié)構(gòu)域，包括1 個AAA_21、1 個SMC_N 和1 個SMC_hinge(圖4)。進一步分析發(fā)現(xiàn)東方蜜蜂微孢子蟲和其他9 個物種的SMC 中均含有1 個SMC_N 和1 個SMC_hinge(圖4)。以上結(jié)果進一步說明SMC 在東方蜜蜂微孢子蟲和其他真菌物種中高度保守。

圖4 東方蜜蜂微孢子蟲和其他9 個物種SMC 的結(jié)構(gòu)域比較Fig.4 Comparison of structural domains within SMC in Nosema ceranae and other nine species

2.3 SMC 的系統(tǒng)進化分析

如表2所示，東方蜜蜂微孢子蟲、海倫腦炎微孢子蟲、顆粒病微孢子蟲、康氏泰羅漢孢蟲、菲尼斯畢羅酵母、指間毛廯菌、紫色毛廯菌、發(fā)廯菌和黑曲霉均僅含有1 個SMC，而麥格水蚤漢氏孢蟲含有2 個SMC。

表2 東方蜜蜂微孢子蟲與其他9 個物種的SMC 蛋白概覽Table 2 Overview of SMC proteins in Nosema ceranae and other nine species

氨基酸序列多重比對結(jié)果顯示，東方蜜蜂微孢子蟲與菲尼斯畢羅酵母的SMC 序列相似性最高，達到61.96%，其次是與指間毛廯菌、發(fā)廯菌、紫色毛廯菌和黑曲霉，SMC 序列相似性均為60.98%，與康氏泰羅漢孢蟲的SMC 序列相似性最低(34.73%)。

系統(tǒng)進化分析結(jié)果顯示，東方蜜蜂微孢子蟲、顆粒病微孢子蟲、麥格水蚤漢氏孢蟲、康氏泰羅漢孢蟲和海倫腦炎微孢子蟲的SMC 聚為一個大支，而發(fā)廯菌、指間毛廯菌、紫色毛廯菌、黑曲霉和菲尼斯畢羅酵母的SMC 聚為一個大支；東方蜜蜂微孢子蟲與顆粒病微孢子蟲的SMC 聚為一支，且置信度達到99%，說明二者SMC 的進化距離最近(圖5)。

圖5 鄰接法構(gòu)建基于SMC 的東方蜜蜂微孢子蟲與其他9 個物種的系統(tǒng)進化樹Fig.5 Phelogenetic tree of Nosema ceranae and other nine species based on SMC by neighbor-joining method

3 結(jié)論與討論

目前，由于缺乏成熟的轉(zhuǎn)基因操作技術(shù)體系，東方蜜蜂微孢子蟲絕大多數(shù)基因功能未明，相關(guān)信息匱乏。本研究通過生物信息學手段對東方蜜蜂微孢子蟲NCCS基因編碼的SMC 進行分子特性解析，結(jié)果顯示，SMC 的分子式為C5 787H9 418N1 526O1 771S41，包含1 102 個氨基酸，相對分子質(zhì)量約130 020，等電點為8.28，脂溶系數(shù)為93.49，平均親水系數(shù)為-0.740，親水氨基酸數(shù)量多于疏水氨基酸，說明SMC 可能是親水性蛋白；不含信號肽和跨膜螺旋區(qū)，說明SMC 可能為胞內(nèi)蛋白和非跨膜蛋白。以上結(jié)果豐富了東方蜜蜂微孢子蟲NCCS基因的基本信息，為進一步開展相關(guān)功能研究提供了有價值的參考信息。另外，預測SMC 同時定位于細胞核、細胞質(zhì)和線粒體，但主要定位于細胞核(占比78.30%)，鑒于染色體主要存在于細胞核，上述結(jié)果符合客觀實際；但預測到少量SMC 分布于細胞質(zhì)和線粒體，一方面需要通過分子生物學試驗加以驗證，另一方面暗示SMC 功能的潛在多樣性。

真核生物中存在6 種SMC，這6 種蛋白兩兩結(jié)合形成異二聚體，進而結(jié)合其他組分形成復合體，分別為黏結(jié)蛋白復合體、凝聚蛋白復合體和SMC5-SMC6 復合體，這些復合體在DNA 修復、重組與復制等方面發(fā)揮重要作用[14]。SMC 在進化上較為保守，從微生物到哺乳動物的SMC 蛋白都具有相似的結(jié)構(gòu)[15]。本研究在東方蜜蜂微孢子蟲、海倫腦炎微孢子蟲、麥格水蚤漢氏孢蟲、顆粒病微孢子蟲、康氏泰羅漢孢蟲、菲尼斯畢羅酵母、指間毛廯菌、紫色毛廯菌、發(fā)廯菌和黑曲霉的SMC 中均預測到Motif 1～9 共9 個保守基序；此外，發(fā)現(xiàn)東方蜜蜂微孢子蟲和上述其他物種的SMC 均含有1 個SMC_N 和1 個SMC_hinge。以上結(jié)果表明SMC 在東方蜜蜂微孢子蟲和其他真菌中具有高度保守性，推測SMC 在東方蜜蜂微孢子蟲和上述其他真菌中發(fā)揮類似功能。本研究發(fā)現(xiàn)，東方蜜蜂微孢子蟲、顆粒病微孢子蟲、海倫腦炎微孢子蟲、麥格水蚤漢氏孢蟲和康氏泰羅漢孢蟲的SMC 聚為一個大支，說明這些物種的SMC 親緣關(guān)系較近；東方蜜蜂微孢子蟲與顆粒病微孢子蟲的SMC 聚為一支，置信度為99 %，說明二者的SMC 進化距離最近。

前人研究發(fā)現(xiàn)SMC 的C 端和N 端相互結(jié)合形成ATP 酶功能域，因此SMC 蛋白也屬于ABC(ATP binding cassette)蛋白家族[16]，ABC 蛋白在東方蜜蜂微孢子蟲的生命活動中起到重要作用[17]。因此，推測SMC 在東方蜜蜂微孢子蟲中發(fā)揮的功能類似于ABC 蛋白。

通過建立東方蜜蜂微孢子蟲侵染成年蜜蜂的模式進行東方蜜蜂微孢子蟲的基因功能研究已見諸報道[18-19]。我們下一步擬通過體外轉(zhuǎn)錄合成NCCS的dsRNA，并通過飼喂法探究東方蜜蜂微孢子蟲侵染蜜蜂宿主過程中NCCS的功能。