趙雅潔，劉笑迎，曹 賀，游 毅

（1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一人民醫(yī)院，上海 200080；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬上海市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，上海 200011；3.上海市楊浦區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，上海 200090）

糖尿病性腦內(nèi)微小病變，是由長期糖尿病導(dǎo)致的并發(fā)癥，病人主要病因為“消渴”，主要病機(jī)為本虛標(biāo)實，本虛在于氣陰不足，陰精虧損，標(biāo)實在于瘀血阻滯。而糖尿病性腦內(nèi)微小病變的發(fā)展變化，也符合絡(luò)病的傳變特點，具有時間性，局部性與廣泛性，功能失常為主導(dǎo)，難治性和纏綿性，進(jìn)展性，復(fù)發(fā)性。提示治療糖尿病性腦內(nèi)微小病變應(yīng)當(dāng)持之以恒，緩以圖之。因此，雖然腦內(nèi)微小病變尚無腦卒中先兆的表現(xiàn)，我們在原理上也可以將其視為“中風(fēng)先兆”的一種無表現(xiàn)型，治療上可以參照“中風(fēng)先兆”。本實驗以此為依據(jù)，對糖尿病性腦內(nèi)微小病變模型大鼠進(jìn)行治療并評估治療效果。

1 材料和方法

1.1 材料與方法

1.1.1 實驗動物及試劑

健康雄性1月齡Wistar 大鼠，由上海中醫(yī)藥大學(xué)試驗動物中心提供，體質(zhì)量80～90 g。

1.1.2 實驗造模

參照趙寶珍等改良的2 型糖尿病模型建立方法，具體見參考文獻(xiàn)[1]。

1.1.3 實驗分組與藥物制備

各組動物隨機(jī)分為正常對照組（normal control，NC 組）；高糖損傷組（diabetes mellitus，DM 組）；阿司匹林對照組（aspirin control，AC 組）；中藥組（traditional Chinese medicine，TCM 組），6 只/組。

中藥組：養(yǎng)陰益氣方（黃芪、丹參、山藥、知母、黃柏、白芍）各10 g，加10 倍水煎煮1 h，過濾，藥渣加5倍水煎煮1 h，過濾，合并濾液，水浴濃縮至2 g 生藥/mL 藥液。

阿司匹林組：阿司匹林腸溶片，拜耳制藥，大鼠灌胃給藥體積為1 mL/kg。

1.1.4 實驗方法

NC 組、DM 組造模完成后分別以生理鹽水灌腸；AC 組，TCM 組造模完成后分別以阿司匹林片及中藥灌腸。4 組大鼠均在灌腸開始后第6月處死取材。

1.1.5 檢測指標(biāo)

（1）生化檢測

每組大鼠按月抽取血液進(jìn)行糖化血紅蛋白檢測。

（2）分子生物學(xué)檢測

標(biāo)本處理：分別于相應(yīng)的觀察時間點給大鼠腹腔注射10%水合氯醛，過量麻醉后后處死，在無菌條件下切取大鼠腦組織，投入多聚甲醛中固定后用石蠟包埋。迅速放入液氮，繼而轉(zhuǎn)至-70℃冰箱凍存。

標(biāo)本檢測：各組均以流式細(xì)胞術(shù)觀察細(xì)胞凋亡情況；RT-PCR 熒光定量檢測大鼠腦內(nèi)組織HIF-1α mRNA 的表達(dá)；Western blot 及免疫組化方法檢測HIF-1α 蛋白表達(dá)。

A.凋亡率測定：使用流式細(xì)胞儀檢測。試驗重復(fù)3 次。

B.HIF-1α mRNA 表達(dá)：采用Realtime PCR 方法測定。引物序列為：

HIF-1α mRNA

Primer F 5′-ACTATGTCGCTTTCTTGG-3′

Primer R 5′-TTTCTGCTGCCTTGTATG-3′

Size：194 bps

Gapdh mRNA

Primer F 5′-GGAGTCTACTGGCGTCTTCAC-3′

Primer R 5′-ATGAGCCCTTCCACGATGC-3′

Size：237 bps

按說明書用Trizol 提取總RNA，制作HIF-1α/GAPDH 的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進(jìn)行Realtime PCR 反應(yīng)試驗重復(fù)3 次。

C． HIF-1α 蛋白的表達(dá)：采用Western blot 測定，用Lowry 法測定所收集的蛋白質(zhì)含量，以GAPDH 作內(nèi)參。4 ℃孵育過夜后，以TBS-T 洗膜3 次，加入有辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（羊抗兔IgG-HRP）室溫孵育1 h，以TBS-T 洗膜3 次，ECL 顯色。膜經(jīng)凝膠成像儀（Bio-rad）記錄相應(yīng)的表達(dá)量。實驗重復(fù)3 次。

1.2 統(tǒng)計分析

所得數(shù)據(jù)均用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計處理。計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，符合正態(tài)分布者，各組間均數(shù)差異用方差分析，雙側(cè)檢驗，P＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)差異；非正態(tài)分布者，用秩和檢驗，P＜0.05 認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 生化檢測 與高糖損傷組相比，阿司匹林、中藥組每10 g 血紅蛋白吸光度表達(dá)量都有所減少，且各組之間相比有明顯統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05），與阿司匹林組相比，中藥組糖化血紅蛋白吸光度表達(dá)量有所增加（P＜0.05）。見表1。

表1 糖化血紅蛋白吸光度的組間比較（±s）

表1 糖化血紅蛋白吸光度的組間比較（±s）

注：vs 正常對照組，▲P＜0.05；vs 高糖損傷組，△P＜0.05；vs 阿司匹林組，*P＜0.05。

組別n糖化血紅蛋白吸光度正常對照組61.26±0.17高糖損傷組65.35±0.19▲阿司匹林組62.63±0.10▲△中藥組63.48±0.22▲△*

2.2 細(xì)胞凋亡率檢測 由早期凋亡率結(jié)果可以看出，與正常對照組相比高糖損傷組凋亡量明顯增加（P＜0.05），與高糖損傷組相比，阿司匹林、中藥組凋亡都有所減少（P＜0.05），且各組之間相比有明顯統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05），與阿司匹林組相比，中藥組凋亡率所增加，但無明顯統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2、圖1。

圖1 大鼠腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡率測定

表2 大鼠腦神經(jīng)細(xì)胞早期凋亡率測定（±s）

表2 大鼠腦神經(jīng)細(xì)胞早期凋亡率測定（±s）

注：vs 正常對照組，▲P＜0.05；vs 高糖損傷組，△P＜0.05；vs 阿司匹林組，*P＜0.05。

組別n早期凋亡率正常對照組63.80±0.36高糖損傷組625.13±2.22▲阿司匹林組617.00±1.90▲△中藥組620.50±1.02▲△*

由晚期凋亡率結(jié)果可以看出，與正常對照組相比高糖損傷組凋亡量明顯增加（P＜0.05），與高糖損傷組相比，阿司匹林、中藥組凋亡都有所減少（P＜0.05），且各組之間相比有明顯統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05），與阿司匹林組相比，中藥組凋亡率所增加（P＜0.05），說明該中藥對晚期凋亡抑制較早期差。見表3、圖1。

表3 大鼠腦神經(jīng)細(xì)胞晚期凋亡率測定（±s）

表3 大鼠腦神經(jīng)細(xì)胞晚期凋亡率測定（±s）

注：vs 正常對照組，▲P＜0.05；vs 高糖損傷組，△P＜0.05；vs 阿司匹林組，*P＜0.05。

組別n晚期凋亡率正常對照組60.80±0.36高糖損傷組69.90±1.10▲阿司匹林組63.40±0.53▲△中藥組66.30±1.05▲△*

2.3 HIF-1αmRNA 表達(dá) 由Realtime PCR 結(jié)果可以看出，與正常對照組相比高糖損傷組HIF-1αmRNA 表達(dá)量明顯增加（P＜0.05），與高糖損傷組相比，阿司匹林、中藥組、HIF-1αmRNA 表達(dá)量都有所減少（P＜0.05），且各組之間相比有明顯統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05），與阿司匹林組相比，中藥組HIF-1αmRNA 表達(dá)量有所增加（P＜0.05）。見表4。

表4 各組HIF-1α mRNA 表達(dá)（±s）

表4 各組HIF-1α mRNA 表達(dá)（±s）

注：vs 正常對照組，▲P＜0.05；vs 高糖損傷組△P＜0.05；vs阿司匹林組，*P＜0.05。

組別nmRNA正常對照組60.00268±0.00068高糖損傷組60.04484±0.00203▲阿司匹林組60.01308±0.00021▲△中藥組60.02679±0.00149▲△*

2.4 各組HIF-1α 蛋白表達(dá)情況 由Western blot結(jié)果可以看出，與正常對照組相比高糖損傷組HIF-1α 蛋白表達(dá)量明顯增加（P＜0.05），與高糖損傷組相比，阿司匹林、中藥組、HIF-1α 蛋白表達(dá)量都有所減少（P＜0.05），且各組之間相比有明顯統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05），與阿司匹林組相比，中藥組HIF-1α 蛋白表達(dá)量有所增加（P＜0.05）。見表5，圖3。

圖3 各組HIF-1α 蛋白表達(dá)

表5 各組HIF-1α 蛋白表達(dá)（±s）

表5 各組HIF-1α 蛋白表達(dá)（±s）

注：vs 正常對照組，▲P＜0.05；vs 高糖損傷組，△P＜0.05；vs 阿司匹林組，*P＜0.05。

組別n蛋白正常對照組60.09067±0.04310高糖損傷組60.57133±0.09548▲阿司匹林組60.24667±0.04359▲△中藥組60.43133±0.05897▲△*

3 討論

隨著對腦血管疾病的發(fā)生及其危險因素研究的深入，腦卒中一級預(yù)防的重要性越來越被人們認(rèn)識和重視。糖尿病是中風(fēng)的重要危險因素之一。隨著人們認(rèn)識的提高，糖尿病的治療和預(yù)防達(dá)到了一個新的水平。雖然部分患者的血糖在可控范圍內(nèi)，但還是無法避免中風(fēng)的發(fā)生。近年來，隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)糖尿病腦內(nèi)微小病變可以看作是糖尿病性腦血管病的早期表現(xiàn)[2-4]。

糖尿病是中風(fēng)和大腦發(fā)生微小變化的常見危險因素之一。預(yù)防大腦中的微小病變可以用“初級預(yù)防”指標(biāo)、“預(yù)測因素”[5]。這些認(rèn)識符合中醫(yī)學(xué)所倡導(dǎo)的“未病先防，既病防變”的理論。糖尿病腦血管病也是難以治療和預(yù)防的疾病之一。糖尿病合并微小腦病變的西醫(yī)治療效果不佳，中醫(yī)治療的具體機(jī)制尚不明確；中藥和方劑的選擇也是有爭議的[6]。

腦內(nèi)＜3 mm 的微小病變使其患腦梗死及腦梗死相關(guān)死亡的風(fēng)險增加至少3 倍。Knopman 教授[7]統(tǒng)計的1 906 名志愿者中，從足夠的腦MRI 資料中發(fā)現(xiàn)，腦白質(zhì)的微小梗死是腦血管事件隱匿進(jìn)展的重要原因?？梢姡委熌X內(nèi)微小病變是否可以作為腦卒中的“一級預(yù)防”手段已成為人們關(guān)注的熱點話題，而糖尿病是腦卒中與腦內(nèi)微小病變的共同危險因素，糖尿病性腦血管病也是難治難防的疾病之一。對于糖尿病患者來說，通過預(yù)防糖尿病性腦內(nèi)微小病變，進(jìn)一步預(yù)防腦卒中，是十分必要而可行的?；谶@一現(xiàn)狀，充分發(fā)揮中醫(yī)藥的優(yōu)勢和特點，結(jié)合中醫(yī)藥“絡(luò)病論”“扭轉(zhuǎn)論”等理論，提出并實施了“養(yǎng)陰截斷療法”等理論[8-9]。我們的實驗采用益氣養(yǎng)陰法治療糖尿病性腦內(nèi)微小病變?nèi)〉靡欢ǒ熜А?/p>

缺氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）是迄今為止發(fā)現(xiàn)的唯一能在特異性缺氧狀態(tài)下發(fā)揮活性的轉(zhuǎn)錄因子，對細(xì)胞缺氧起穩(wěn)定作用，是缺氧或某些氧化應(yīng)激狀態(tài)下產(chǎn)生的誘導(dǎo)低氧基因和修復(fù)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的調(diào)節(jié)因子，是依賴氧濃度調(diào)節(jié)的主要因子，對周圍氧環(huán)境具有較強敏感性[10-13]。其在哺乳動物和人體廣泛存在，直接或間接調(diào)節(jié)著血管生成、細(xì)胞增殖與凋亡、能量調(diào)節(jié)等眾多通路[14]。國內(nèi)外有諸多學(xué)者用不同的方法不同的動物證明[7]缺氧時HIF-1α 表達(dá)增高。

腦內(nèi)微小病變中醫(yī)并沒有明確記載，但根據(jù)其表現(xiàn)，MRI-T2WI 的主要病理變化為游離水（H+）和亞急性血腫[15]，可歸于中醫(yī)的“有形之邪”范疇。中醫(yī)一般將有形之邪歸結(jié)為血瘀、痰濕等病理產(chǎn)物，所以微小病變可以理解為痰濕、血瘀等阻滯腦絡(luò)，產(chǎn)生小“癥”“癥瘕”?！盁o癥狀、無征兆”——“中風(fēng)”的“癥狀”雖然沒有出現(xiàn)，但在“病”中，借助現(xiàn)代醫(yī)學(xué)手段，已經(jīng)可以看出實實在在的弊端。它符合現(xiàn)代中醫(yī)的“絡(luò)病論”[16]理論。

益氣養(yǎng)陰方由黃芪、丹參、山藥、知母、黃柏、白芍組成，采用益氣養(yǎng)陰來治療糖尿病性腦內(nèi)微小病變。追溯治療“中風(fēng)病”理論源流，有關(guān)陰精虧虛與中風(fēng)先兆的關(guān)系，明代張景岳在《景岳全書·非風(fēng)》中曾指出：“……多以素不能慎，或七情內(nèi)傷，或酒色過度，先傷五臟之真陰?！逼洳C(jī)為“陰虧于前，而陽損于后；陰陷于下，而陽泛于上，以致陰陽相失，精氣不交，所以忽而昏饋，卒然仆倒……”此后，葉天士承前啟后進(jìn)一步闡明了腎精虧虛、收納無權(quán)是中風(fēng)先兆致病因素之一，他說：“腎陰弱，收納無權(quán)，肝陽熾，虛風(fēng)蒙竅。”又說：“精血衰耗，水不涵木，木少滋榮，故肝陽偏亢?！边M(jìn)一步導(dǎo)致“內(nèi)風(fēng)旋動”，其表現(xiàn)為上實（脈弦動、眩暈、耳聾）、下虛（下肢無力）等腎虛欲仆之癥。針對這一病理特點，葉天士采用填補真陰法來截斷中風(fēng)的發(fā)生，既可補其不足，又可截斷病變之發(fā)展，療效顯著。葉天士在《臨證指南醫(yī)案·中風(fēng)》32 案中有關(guān)中風(fēng)先兆的醫(yī)案就有5 案。這是葉天士繼《內(nèi)經(jīng)》《難經(jīng)》《傷寒論》之后，運用中醫(yī)“治未病”這一最高治療原則，采用“養(yǎng)陰截斷療法”，論治中風(fēng)先兆的獨特經(jīng)驗，實踐證明，葉天士對中風(fēng)先兆的防治經(jīng)驗至今對預(yù)防中風(fēng)仍有較高的實用價值。這又正好與我們研究的糖尿病性腦內(nèi)微小病變，糖尿病體質(zhì)的病人陰精多不足的理論吻合。

本方中黃芪味甘，性微溫，針對糖尿病并發(fā)癥的“虛”證病機(jī)，具有益氣養(yǎng)元，扶正祛邪，補氣升陽、通經(jīng)脈的功效。臨床及藥理研究表明，黃芪具有調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞一氧化氮水平，調(diào)節(jié)血管生長因子VEGF 表達(dá)，降糖及抗脂質(zhì)過氧化的作用。丹參味微苦，性微寒，針對糖尿病并發(fā)癥，具有活血化瘀，通利經(jīng)絡(luò)的作用。現(xiàn)代研究表明，它具有調(diào)節(jié)細(xì)胞VEGF 表達(dá)，抗內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞凋亡的作用，此外還具有一定降血糖作用。山藥味甘，性平，具有益氣養(yǎng)陰，治本的作用?，F(xiàn)代藥理研究也表明山藥具有滋補、降血糖等重要作用。我們先期臨床和動物實驗研究發(fā)現(xiàn)以黃芪、山藥、丹參為君藥的方劑能改善糖尿病的周圍神經(jīng)癥狀；體外實驗也發(fā)現(xiàn)黃芪、丹參[9]對內(nèi)皮細(xì)胞[17-18]損傷有保護(hù)作用；地龍性寒，味咸，具有溶解血栓、激活纖溶酶原、抑制血小板聚集、降低血脂等作用[19]。許多臨床研究結(jié)果也表明地龍治療腦卒中有效。我們利用其消癥通絡(luò)的作用機(jī)理，將其[20-22]應(yīng)用于腦內(nèi)微小病變并取得了良好的療效。

本實驗提示益氣養(yǎng)陰方對糖尿病性腦內(nèi)微小病變的治療具有一定的作用，可降低糖化血紅蛋白吸光度，降低腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡率，此外我們還發(fā)現(xiàn)，本方可降低HIF-1α 的表達(dá)。HIF-1α 是缺氧或某些氧化應(yīng)激狀態(tài)下產(chǎn)生的誘導(dǎo)低氧基因和修復(fù)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的調(diào)節(jié)因子[23]。HIF-lα 在腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞（brain microvascular endothelial cells，BMECs）的破壞過程中起重要作用，缺血缺氧后，可見BMECs 腫脹，空泡形成，部分細(xì)胞線粒體腫脹或空泡化，自噬體增多，核糖體脫落，甚至細(xì)胞核染色質(zhì)固縮，最終導(dǎo)致血腦屏障破壞[24]。

綜上所述，我們認(rèn)為糖尿病性腦內(nèi)微小病變治療宜從“虛”“實”兩方面入手，扶正祛邪，采用“養(yǎng)陰益氣法”。