董麗榮，李應(yīng)才，孫 赟

（1.昆明市食品藥品檢驗(yàn)所，云南 昆明 650031；2.云南中醫(yī)藥大學(xué)，云南 昆明 650500）

顛茄片主要有效成分為阿托品、山莨菪堿、東莨菪堿等托烷類生物堿[1-2]。由于含量高低相差懸殊，不適宜同時(shí)建立多成分的含量測(cè)定方法[3]。近年文獻(xiàn)報(bào)道，關(guān)于顛茄制劑的生物堿類有效成分的測(cè)定，均采用高效液相色譜法[4-5]。《中國(guó)藥典》2020 版一部對(duì)顛茄片中的硫酸天仙子胺、東莨菪內(nèi)酯分別采用2 個(gè)不同的高效液相色譜法進(jìn)行含量測(cè)定，方法分析時(shí)間長(zhǎng)、效率低、操作繁瑣，其他峰對(duì)主峰干擾大。供試品取樣量樣量大（100 片），在實(shí)際監(jiān)督抽檢工作中，往往樣品量難于滿足檢驗(yàn)需求。本試驗(yàn)建立了采用UPLC-MS/MS 法同時(shí)測(cè)定顛茄片中硫酸天仙子胺、東莨菪內(nèi)酯2 種有效成分的定量分析方法。該方法靈敏準(zhǔn)確，取樣量少，效率高，可為顛茄片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的優(yōu)化提升提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器 AB 4500 質(zhì)譜儀（SCIEX）；LC-40 超高效液相色譜儀（島津公司）；AL204（萬(wàn)分之一）電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；MS205DU（十萬(wàn)分之一）電子天平（特勒-托利多儀器上海有限公司）；Arium comfortⅡ超純水儀（賽多利斯）；SK8210HP 超聲波清洗器（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）。

1.2 對(duì)照品及試劑試藥 硫酸天仙子胺（批號(hào)110752-500912，純度96.0%），東莨菪內(nèi)酯（批號(hào)110826-501616，純度99.6%），均來(lái)源于中國(guó)食品藥品檢定研究院；色譜純甲醇（Fisher 公司），色譜純甲酸（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。3 批顛茄片均為天津力生制藥股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào)分別為2101002、2111021、2110019。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜-質(zhì)譜條件

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Waters Acquity UPLC HSS T3 色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流動(dòng)相：0.1%甲酸水溶液-甲醇，按照表1進(jìn)行梯度洗脫；流速：0.2 mL·min-1；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量4.0 μL。

表1 梯度洗脫程序

2.1.2 質(zhì)譜條件 采用AB 4500 質(zhì)譜系統(tǒng)，ESI 源，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（multiple reactions moniroring，MRM）模式，離子源溫度為550 ℃，正負(fù)離子掃描，得硫酸天仙子胺、東莨菪內(nèi)酯的質(zhì)譜參數(shù)見表2，與文獻(xiàn)[7]報(bào)道基本一致。

表2 各成分質(zhì)譜參數(shù)

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 精密稱取硫酸天仙子胺、東莨菪內(nèi)酯兩種對(duì)照品各適量，分別置于10 mL 量瓶中，用50%甲醇定容，得硫酸天仙子胺、東莨菪內(nèi)酯的質(zhì)量濃度分別為0.212、0.180 mg·mL-1的單一照品溶液。分別精密量取上述對(duì)照品溶液適量，置同一10 mL 量瓶中，用50%甲醇定容，得硫酸天仙子胺、東莨菪內(nèi)酯分別為0.998、1.001 μg·mL-1的混合照品儲(chǔ)備液。

2.2.2 供試品溶液 分別取不同批次的顛茄片20片，精密稱定，研細(xì)，精密稱取約0.1 g 置于50 mL 量瓶中，加入50%甲醇溶液適量，超聲提?。l率33 kHz，功率250 W）15 min，放冷，用50%甲醇溶液定容至刻度，搖勻，濾過，精密吸取續(xù)濾液1.0 mL 至10 mL 量瓶中，用50%甲醇溶液定容，搖勻，經(jīng)0.22 μm濾頭濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，用50%甲醇稀釋成系列濃度混合對(duì)照品溶液，其中硫酸天仙子胺質(zhì)量濃度分別為：193.6、387.2、580.8、774.4、968.0 ng·mL-1，東莨菪內(nèi)酯質(zhì)量濃度分別為：1.0、5.0、10.0、20.0、50.0 ng·mL-1。取上述系列混合對(duì)照溶液，分別按“2.1”項(xiàng)下條件測(cè)定，線性回歸計(jì)算。結(jié)果見表3。結(jié)果表明，上述2 個(gè)成分在各自線性范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

表3 回歸方程與線性范圍測(cè)定結(jié)果

2.3.2 檢測(cè)限與定量限測(cè)定 精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液，逐級(jí)稀釋后按“2.1”項(xiàng)條件測(cè)定，以離子對(duì)S/N 為3 考察其檢出限，結(jié)果硫酸天仙子胺和東莨菪內(nèi)酯的檢出限分別為的0.25 pg·mL-1和0.10 pg·mL-1；以離子對(duì)S/N 為10 考察其定量限，結(jié)果硫酸天仙子胺和東莨菪內(nèi)酯的定量限分別為0.87 pg·mL-1和0.49 pg·mL-1。

2.3.3 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.3.1”項(xiàng)下項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液（硫酸天仙子胺、東莨菪內(nèi)酯的質(zhì)量濃度分別為387.19 ng·mL-1、200 ng·mL-1），按“2.1”項(xiàng)條件測(cè)定，連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄各指標(biāo)成分峰面積并計(jì)算其RSD 值。結(jié)果硫酸天仙子胺和東莨菪內(nèi)酯峰面積的RSD 分別為0.91%和1.11%，表明儀器精密度良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取批號(hào)為2101002 的樣品，制備供試品溶液，室溫下放置0、2、4、8、12、24 h，按“2.1”項(xiàng)條件測(cè)定，記錄各指標(biāo)成分峰面積并計(jì)算其RSD值。結(jié)果硫酸天仙子胺和東莨菪內(nèi)酯峰面積的RSD分別為1.25%和1.30%，表明供試品溶液在室溫下放置24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)樣品6 份，制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)條件分別進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算各指標(biāo)成分的含量。結(jié)果硫酸天仙子胺、東莨菪內(nèi)酯含量的RSD 分別為1.41%和0.97%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.6 準(zhǔn)確度試驗(yàn) 分別取已測(cè)含量的同一批號(hào)（批號(hào)為2101002）樣品6 份，每份取約0.1 g，精密稱定，置于50 mL 容量瓶中，分別精密加入硫酸天仙子胺和東莨菪內(nèi)酯對(duì)照品溶液適量，按“2.2.2”項(xiàng)下的方法制備成供試品溶液。按“2.1”項(xiàng)下條件測(cè)定。結(jié)果見表4。

表4 各成分加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.3.7 樣品含量測(cè)定 分別不同批號(hào)樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下的方法制備成供試品溶液。按“2.1”項(xiàng)下條件分別進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算含量。測(cè)定結(jié)果見表5。對(duì)照品溶液（A）和供試品溶液（B）的MRM 色譜圖見圖1。

圖1 對(duì)照品溶液（A）和供試品溶液（B）的MRM 色譜對(duì)比圖

表5 各成分含量測(cè)定結(jié)果（n=2）

3 討論與結(jié)論

3.1 色譜條件的優(yōu)化 本實(shí)驗(yàn)考察了有機(jī)相甲醇和乙腈及梯度洗脫對(duì)分離效果的影響。結(jié)果用乙腈作為流動(dòng)相時(shí)，硫酸天仙子胺色譜峰出現(xiàn)分叉現(xiàn)象。本實(shí)驗(yàn)通過更換色譜柱、調(diào)整梯等，依舊無(wú)法消除硫酸天仙子胺色譜峰出現(xiàn)分叉現(xiàn)象。故采用甲醇作為流動(dòng)相，能得到理想的色譜峰形和分離效果，且質(zhì)譜信號(hào)響應(yīng)較強(qiáng)。

3.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化 東莨菪內(nèi)酯在負(fù)離子模式形成的離子比正離子模式形成的離子豐度比更強(qiáng)，碎片離子穩(wěn)定。綜合考慮選擇正負(fù)離子模式。

3.3 提取溶劑的選擇 本文參考2020 版《中國(guó)藥典》標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)提取溶劑甲醇和水的比例進(jìn)行了比較，綜合考慮了提取率，基質(zhì)效應(yīng)干擾等指標(biāo)，最終確定甲醇-水（50 ∶50）為提取溶劑。

3.4 供試品溶液雜質(zhì)峰探討 圖1中顯示，供試品溶液中存在東莨菪內(nèi)酯的雜峰，其離子對(duì)信息和東莨菪內(nèi)酯一致。通過查閱文獻(xiàn)可能是屬于和東莨菪內(nèi)酯的同類生物堿。該生物堿是否為活性成分，需要進(jìn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)控制，應(yīng)需進(jìn)一步研究。

3.5 結(jié)論 《中國(guó)藥典》2020年版一部采用兩種HPLC 法測(cè)定該藥中2 種成分的含量，硫酸天仙子胺和東莨菪內(nèi)酯含量差異大（硫酸天仙子胺為每片70～120 μg、東莨菪內(nèi)酯含量為每片不得少于2.2 μg），難于同時(shí)進(jìn)混標(biāo)測(cè)定，方法分離時(shí)間為50 min，雜峰干擾明顯。UPLC-MS/MS 法定性定量具有靈敏度高、分析速度快、抗干擾強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)，能大大縮短實(shí)驗(yàn)時(shí)間，提高效率。本實(shí)驗(yàn)建立了UPLC-MS/MS 法同時(shí)測(cè)定顛茄片中2 種成分的含量。該方法簡(jiǎn)便快速、靈敏高效、所需樣品量小，可為優(yōu)化提升該制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。