李妙媛，唐坤泉，李映妮，熊 磊

（1.柳州市婦幼保健院/廣西科技大學(xué)附屬婦產(chǎn)醫(yī)院/兒童醫(yī)院，廣西 柳州 545001；2.云南中醫(yī)藥大學(xué)，云南 昆明 650500）

直腸給藥是一種傳統(tǒng)的中醫(yī)外治法，此方法應(yīng)用范圍廣泛，見(jiàn)效快，療效可靠，操作簡(jiǎn)便，兒童較易接受。但目前直腸給藥多為中藥煎劑或中成藥稀釋液，沒(méi)有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)與要求，除了個(gè)別中成藥栓劑外，尚缺乏中成藥灌腸專(zhuān)用制劑，影響了灌腸療法的普及和推廣。熱毒寧注射液是兒科臨床常用的中成藥，是由中藥青蒿、金銀花、梔子制成的現(xiàn)代中藥制劑，具有清熱、疏風(fēng)、解毒功效，有研究提示熱毒寧具有退熱、抗病毒、抗感染及提高免疫力的作用[1-3]。研究發(fā)現(xiàn)熱毒寧注射液對(duì)單純皰疹病毒HSV、腸道病毒71 型、流感病毒H1N1、柯薩奇病毒等均有抑制作用[4-7]。熱毒寧也是中醫(yī)兒科臨床診療指南中治療手足口病的A級(jí)推薦用藥，中藥灌腸療法是中醫(yī)兒科臨床診療指南中治療手足口病的B 級(jí)推薦療法。為了明確熱毒寧注射液直腸給藥的安全性，本研究進(jìn)行幼年大鼠的急性毒性實(shí)驗(yàn)及直腸黏膜刺激實(shí)驗(yàn)。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)藥物 熱毒寧注射液（10 mL/支）：由江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)。批號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字Z20050217。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF 級(jí)SD 5 周齡幼鼠40 只，體質(zhì)量（140±10）g，雌雄各半，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，合格證編號(hào)為SCXK（湘）2019-0004。室溫：（23±2）°C，相對(duì)濕度：（60±10）%，光暗周期：12 h。經(jīng)過(guò)1 周適應(yīng)性喂養(yǎng)后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。

1.3 急性毒性實(shí)驗(yàn) 取5 周齡SPF 級(jí)幼鼠20 只，雌雄各半，將雌雄幼鼠按性別隨機(jī)分為4 組，每組5 只，將4 組幼鼠不同性別之間隨機(jī)組合為2 組，每組10只，雌雄各半，分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。因熱毒寧注射液濃度和幼鼠腸道體積限制，且熱毒寧注射液藥物毒性低，單次灌腸給藥無(wú)法測(cè)定半數(shù)致死量（LD50），故據(jù)大鼠直腸容納最大量（20 mL/kg）予以最大給藥量實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)組每次以熱毒寧注射液最大濃度（35 g 生藥/10 mL）和最大容積20 mL/kg 灌腸，對(duì)照組以等量0.9%生理鹽水灌腸。灌腸時(shí)，經(jīng)幼鼠肛門(mén)置入導(dǎo)管，深度約5 cm，推注受試液，限制幼鼠活動(dòng)，2 h 后再分別給幼鼠重復(fù)給藥，藥物用量均同第1 次，共灌腸3次，相當(dāng)于幼兒臨床給藥量30 倍。灌腸后放入籠中，在室溫：（23±2）°C，相對(duì)濕度：（60±10）%，光暗周期：12 h 條件下飼養(yǎng)。觀察并記錄給藥后30 min、2 h及隨后7 d 幼鼠外觀、四肢活動(dòng)、飲食、排泄、體質(zhì)量等情況。每日觀察幼鼠毒性反應(yīng)情況，記錄癥狀出現(xiàn)、加重、減輕或死亡的時(shí)間和出現(xiàn)反應(yīng)的幼鼠數(shù)量，計(jì)算幼鼠死亡率，出現(xiàn)死亡幼鼠立即解剖，觀察其內(nèi)臟病理變化。

1.4 直腸黏膜刺激實(shí)驗(yàn) 取5 周齡SPF 級(jí)幼鼠20只，雌雄各半，將雌雄幼鼠按性別隨機(jī)分為4 組，每組5 只，將4 組幼鼠不同性別之間隨機(jī)組合為2 組，每組10 只，雌雄各半，分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。實(shí)驗(yàn)組使用熱毒寧注射液2 mL/kg 灌腸給藥，對(duì)照組以等量0.9%生理鹽水灌腸，每日1 次。給藥后，限制幼鼠活動(dòng)2 h，以保證藥液與直腸黏膜接觸，連續(xù)灌腸7 d。每日觀察幼鼠外觀、體質(zhì)量、飲食、肛門(mén)、四肢活動(dòng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)等情況。第8 d 脫頸處死后檢查直腸黏膜，并取該部位（距肛門(mén)2～10 cm）的腸段，經(jīng)固定、切片、HE 染色等處理后，進(jìn)行光鏡觀察，了解其組織結(jié)構(gòu)狀況，觀察局部黏膜刺激情況，具體黏膜刺激分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1。

表1 局部黏膜刺激及反應(yīng)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)

表2 熱毒寧注射液灌腸急性毒性實(shí)驗(yàn)對(duì)小鼠死亡情況的影響

表3 灌腸前后2 組幼鼠體質(zhì)量變化

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)軟件處理資料，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，屬于正態(tài)分布采用t 檢驗(yàn)，屬于非正態(tài)分布采用秩和檢驗(yàn)方法，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 幼鼠一般情況及死亡率 實(shí)驗(yàn)組在首日連續(xù)灌腸30 min 后出現(xiàn)短暫活動(dòng)減少、進(jìn)食減少及輕度反應(yīng)冷漠外無(wú)明顯的其他毒性反應(yīng)，約當(dāng)日灌腸結(jié)束2 h 后恢復(fù)，灌腸后實(shí)驗(yàn)組大鼠口鼻及肛門(mén)無(wú)異常分泌物，與對(duì)照組幼鼠無(wú)明顯差異。連續(xù)觀察7 d，動(dòng)物一般情況良好，活動(dòng)自如，皮毛光滑，飲食及大小便均未見(jiàn)明顯異常；無(wú)死亡幼鼠，實(shí)驗(yàn)結(jié)束處死所有幼鼠，解剖后肉眼觀察幼鼠心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟未見(jiàn)異常。

2.1.2 幼鼠體質(zhì)量變化 熱毒寧注射液灌腸給藥后，觀察7 d 后幼鼠體質(zhì)量變化情況。灌腸前2 組間體質(zhì)量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05），具有可比性；灌腸后2 組間體質(zhì)量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05），提示熱毒寧灌腸對(duì)幼鼠體質(zhì)量無(wú)影響。對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組灌腸前后自身體質(zhì)量比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），提示2 組幼鼠體質(zhì)量均增長(zhǎng)。

2.2 直腸黏膜刺激實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 幼鼠一般情況 給藥后每日觀察幼鼠外觀、體質(zhì)量、飲食、肛門(mén)、四肢活動(dòng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)等情況均正常。2 組體質(zhì)量均呈現(xiàn)明顯增長(zhǎng)（P＜0.05），具體見(jiàn)表4。

表4 灌腸前后2 組幼鼠體質(zhì)量變化

2.2.2 直腸黏膜刺激性 第8 d 脫頸處死幼鼠后檢查直腸黏膜，解剖觀察灌腸部位黏膜完整，無(wú)異常分泌物，血管走形清晰，無(wú)局部硬結(jié)。光鏡下腸黏膜完整，腺體結(jié)構(gòu)無(wú)改變，黏膜腺體間無(wú)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，排列規(guī)則，部份黏膜下血管可見(jiàn)輕中度充血，肌層完整。黏膜刺激分級(jí)參照見(jiàn)表1，評(píng)分結(jié)果見(jiàn)表5，切片HE 染色見(jiàn)圖1。

圖1 直腸黏膜刺激實(shí)驗(yàn)病理切片（HE 染色×100）

3 討論

《臨證指南醫(yī)案·幼科要略》強(qiáng)調(diào)“小兒熱病最多者，以體屬純陽(yáng)，六氣著人，氣血皆化為熱也，飲食不化，蘊(yùn)蒸于里，亦從熱化矣”，從中醫(yī)學(xué)角度分析兒童疾病以熱性居多，且多與飲食不節(jié)導(dǎo)致胃腸功能受損相關(guān)，并最終引起呼吸道、泌尿系統(tǒng)等疾病發(fā)生，這與現(xiàn)代黏膜免疫系統(tǒng)理論中黏膜在局部誘導(dǎo)后各處黏膜出現(xiàn)共同免疫應(yīng)答的觀點(diǎn)是吻合的。即當(dāng)某處黏膜受到免疫刺激后產(chǎn)生的免疫應(yīng)答，可能通過(guò)黏膜免疫調(diào)節(jié)途徑將免疫信號(hào)傳達(dá)至另一處，從而將局部刺激擴(kuò)大成一個(gè)系統(tǒng)或多個(gè)系統(tǒng)，甚至全身的免疫應(yīng)答[8]。我們推測(cè)此類(lèi)免疫應(yīng)答是中藥灌腸療法起效的現(xiàn)代生物學(xué)基礎(chǔ)，但此方法是否會(huì)損傷黏膜或存在毒副作用，這是臨床人員關(guān)注的問(wèn)題。熱毒寧注射液是常用清熱解毒制劑，它不僅可降低患者機(jī)體肺部的炎癥反應(yīng)、降低外周血炎癥指標(biāo)[9]，并且能降低并發(fā)癥，改善臨床指標(biāo)[10]，但臨床由于中成藥?kù)o脈使用的過(guò)敏風(fēng)險(xiǎn)而逐漸被限制使用或不敢使用，筆者臨床常用熱毒寧注射液直腸用藥治療手足口病、皰疹性咽峽炎等獲效，但其毒副反應(yīng)還需進(jìn)一步驗(yàn)證。該急性毒性實(shí)驗(yàn)采用最大藥量法進(jìn)行，以幼鼠腸道體積允許的最大劑量給予幼鼠熱毒寧注射液，觀察幼鼠出現(xiàn)的急性毒性反應(yīng)及體質(zhì)量變化。以幼鼠灌腸的最大體積給藥量為20 mL/kg，24 h 內(nèi)灌腸給藥3 次（相當(dāng)于兒童臨床每日等效用量的30 倍），當(dāng)日未見(jiàn)明顯毒性反應(yīng)，與對(duì)照組幼鼠表現(xiàn)無(wú)明顯差異；7 d 后，觀察兩組間幼鼠體質(zhì)量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，兩組體質(zhì)量增長(zhǎng)幅度一致，提示安全無(wú)毒性反應(yīng)。熱毒寧注射液臨床給藥兒童每日劑量為0.6 mL/kg，對(duì)應(yīng)大鼠實(shí)驗(yàn)劑量是2 mL/kg，連續(xù)給藥7 d，熱毒寧注射液直腸給藥對(duì)大鼠直腸黏膜刺激性與對(duì)照組刺激性水平相當(dāng)，黏膜未見(jiàn)損傷及未見(jiàn)分泌物，部分可見(jiàn)輕中度充血，評(píng)為輕度刺激性，考慮可能與多次灌腸反復(fù)刺激腸粘膜及黏膜在短時(shí)間內(nèi)超負(fù)荷吸收有關(guān)。本次實(shí)驗(yàn)條件下，使用熱毒寧注射液相當(dāng)于30 倍臨床靜脈使用劑量予大鼠直腸給藥未見(jiàn)急毒性反應(yīng)，表明熱毒寧制劑單次灌腸毒性非常低，符合安全性要求，提示擬定的兒童臨床灌腸劑量安全無(wú)毒。臨床劑量灌腸未見(jiàn)對(duì)直腸黏膜明顯損傷，與既往相關(guān)中藥灌腸研究結(jié)果相符[11]。

該實(shí)驗(yàn)表明：（1）熱毒寧注射液?jiǎn)未喂嗄c給藥無(wú)法測(cè)定LD50，在最大給藥量時(shí)對(duì)幼鼠無(wú)急性毒副作用，故臨床擬用熱毒寧注射液直腸給藥是安全的。（2）熱毒寧注射液多次直腸給藥對(duì)幼鼠直腸黏膜有輕度刺激性，但對(duì)黏膜組織無(wú)病理性損傷。綜上，提示熱毒寧注射液直腸給藥符合安全性要求，可供進(jìn)一步臨床研究使用。