孫小龍,戴軼群,馬 慧,俞俊霞,李紅梅,朱美林,吳成柱

中藥補骨脂為補骨脂PsoraleacorylifoliaL.的干燥成熟果實,具有補腎壯陽、補脾健胃等功效[1-2]。現(xiàn)代研究[3-4]表明,補骨脂含有香豆素類、黃酮類、單萜類等多種成分,具有抗菌、抗腫瘤、治療骨質(zhì)疏松、雌激素樣作用以及治療白癜風等藥理活性[5-7]。其中,補骨脂中的黃酮類化合物補骨脂乙素對腫瘤細胞具有較強的增殖抑制作用,已被逐漸開發(fā)和利用。補骨脂乙素具有抗炎[8]、抗菌[9]、抗腫瘤[10-11]等多種藥理活性。但是,目前對于從補骨脂中提取補骨脂乙素的工藝研究較少,鮮有的幾篇報道主要通過浸提法、超臨界CO2萃取以及回流法[12],這些方法具有提取效率低、能耗大等缺點,不能用于補骨脂乙素的大批量生產(chǎn)。堿提酸沉法具有低能耗、低污染、毒性低、高效率的特點,可以用于中藥成分的大量提取。本研究采用單因素試驗以及正交試驗,優(yōu)化堿提酸沉法提取補骨脂乙素的提取工藝,建立了一種高效率、無污染、可行性高的提取方法,這為今后提取補骨脂乙素提供了一定的參考價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 補骨脂(江蘇南京上元堂大藥房) ;補骨脂乙素標準品(寶雞市辰光生物有限公司,純度98.0%) ;碳酸鈉(分析純,上海展云化工有限公司);鹽酸(分析純,國藥集團化學試劑有限公司);甲醇、乙腈(色譜純,美國天地有限公司);三氟乙酸(分析純,美國天地有限公司)。

1.2 儀器 SOPTOP電子天平(上海舜宇恒平科學儀器有限公司),LC-20A高效液相色譜儀(日本島津公司),MixPlus旋渦混合儀(合肥艾本森科學儀器有限公司),L550離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司),Milli-Q超純水儀(美國Milipore公司),WK-1000A小型高速粉碎機(山東精誠醫(yī)藥裝備制造有限公司) ,DHG-9123A烘箱(上海精宏科技有限公司)。

1.3 溶液配制

1.3.1 供試品溶液的制備 將補骨脂粉末加入碳酸鈉水溶液中,超聲后過濾,濾液用鹽酸調(diào)pH后再過濾,將干燥后的濾渣用色譜甲醇溶解,用微孔濾膜過濾后備用。

1.3.2 對照品溶液的制備 稱取1.60 mg補骨脂乙素標準品,用色譜甲醇配成5.12 mg/mL后依次稀釋8倍,則對照品溶液濃度依次為640.00、320.00、160.00、80.00、40.00、20.00、10.00、5.00、2.50 μg/mL。

1.3.3 色譜條件 液相色譜柱為Waters Sun FireTMC18(4.6 mm ×250 mm,5 μm),在進樣量為20 μL、流速為1 mL/min、柱溫為40 ℃、檢測波長為254 nm的條件下進行檢測,其中,流動相為0.05%的三氟乙酸水溶液(A)和乙腈(B)進行梯度洗脫(0～30 min,20% B～100% B;30～40 min,100% B;40～45 min,100% B～20% B;45～47 min,20% B) 。

1.4 方法學考察

1.4.1 專屬性 按照“1.3.3”項下的色譜條件對對照品和供試品進行分析,記錄色譜圖。

1.4.2 標準曲線的制備 將配制好的補骨脂乙素對照品溶液按照“1.3.3”項下色譜條件進樣分析,記錄峰面積并繪制標準曲線,其中縱坐標表示峰面積,橫坐標表示濃度。

1.4.3 加樣回收率試驗 按照“1.3.1”項下方法將稱取的6份補骨脂乙素供試品制備為供試品溶液,按照“1.3.3”項下色譜條件測定6份溶液的峰面積;另取6份相同體積的供試品溶液,分別加入一定量的補骨脂乙素對照品,按上述同樣方法測定峰面積,計算回收率。

1.4.4 精密度試驗 將補骨脂粉末提取液按照“1.3.3”項下色譜條件連續(xù)進樣6次分析,測峰面積并計算相對標準偏差(RSD),得日內(nèi)精密度;同樣的方法每天連續(xù)進樣3次,共進樣3天,記錄峰面積并計算RSD值,得日間精密度。

1.4.5 重復性試驗 按照“1.3.1”項下方法將6份質(zhì)量相同的補骨脂粉末制備成供試品溶液,并按照“1.3.3”項下色譜條件進行分析,記錄峰面積并計算RSD值。

1.4.6 穩(wěn)定性試驗 按照“1.3.3”項下的色譜條件將補骨脂粉末提取液分別于0、2、4、8、12、24、36、48 h 進行分析,記錄峰面積并計算RSD值。

1.4.7 單因素試驗 (1)料液比對補骨脂乙素提取工藝的影響。固定堿液濃度為1%,堿提時間為1 h,酸沉pH為5,酸沉時間為1 h,超聲時間為10 min的條件保持不變,改變料液比例分別為1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25進行試驗,以補骨脂乙素含量為指標,高效液相色譜法進樣分析,記錄峰面積。(2)堿液濃度對補骨脂乙素提取工藝的影響。固定料液比為1∶5,堿提時間為1 h,酸沉pH為5,酸沉時間為1 h,超聲時間為10 min的條件保持不變,改變堿液濃度分別為1%、2%、3%、4%、5%進行試驗。(3)堿提時間對補骨脂乙素提取工藝的影響。固定料液比為1∶5,堿液濃度為1%,酸沉pH為5,酸沉時間為1 h,超聲時間為10 min的條件保持不變,改變堿提時間分別為0.5、1、1.5、2、2.5 h進行試驗。(4)酸沉pH對補骨脂乙素提取工藝的影響。固定料液比為1∶5,堿液濃度為1%,堿提時間為1 h,酸沉時間為1 h,超聲時間為10 min的條件保持不變,改變酸沉pH分別為 3、4、5、6進行試驗。(5)酸沉時間對補骨脂乙素提取工藝的影響。 固定料液比為1∶5,堿液濃度為1%,堿提時間為1 h,酸沉pH為 5,超聲時間為10 min的條件保持不變,改變酸沉時間分別為0.5、1、1.5、2、2.5 h進行試驗。(6)超聲時間對補骨脂乙素提取工藝的影響。固定料液比為1∶5,堿液濃度為1%,堿提時間為1 h,酸沉pH為 5,酸沉時間為1 h的條件保持不變,改變超聲時間分別為10、15、20、25、30 min進行試驗。

1.5 正交試驗 通過對單因素試驗結(jié)果進行分析,以L9(34)的方式進行正交試驗(見表1) 。

表1 正交試驗因素水平

2 結(jié)果

2.1 方法學考察

2.1.1 專屬性 由標準品可知補骨脂乙素的峰出現(xiàn)在24.4 min,其峰形良好,且分離度大于2,達到了基線分離的條件,專屬性良好(見圖1)。

2.1.2 線性相關(guān)性試驗 將補骨脂乙素峰面積作為縱坐標,濃度作為橫坐標繪制標準曲線,曲線方程為Y=24 683X+11 0191,R=0.999 7,其中Y表示補骨脂乙素峰面積,X表示濃度(μg/mL),試驗結(jié)果表明,實驗中補骨脂乙素在2.50～640.00 μg/mL呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.1.3 精密度試驗 按照“1.3.1”項下方法制備供試品溶液,連續(xù)測定6次,得日內(nèi)精密度;每天測定3次,連續(xù)測定3 d,得日間精密度。由表2可知,日內(nèi)精密度為0.99%,日間精密度為1.96%,兩者RSD均小于2%,這表明儀器具有良好的精密度。

表2 補骨脂乙素的日內(nèi)、日間精密度和準確度

2.1.4 回收率試驗 對制備的6份供試品溶液按照“1.3.3”項下色譜條件進樣分析,其平均回收率為110.88%,RSD為1.82%(見表3)。

表3 加樣回收率試驗結(jié)果(n=6)

2.1.5 穩(wěn)定性試驗 按照“1.3.3”項下色譜條件將配制好的供試品溶液進樣分析,進樣時間為0、2、4、8、12、24、36和48 h,RSD為1.52%,表明補骨脂乙素常溫放置48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好(見表4)。

表4 補骨脂乙素的穩(wěn)定性試驗結(jié)果

2.1.6 重復性試驗 相同條件下,將補骨脂乙素粉末按照“1.3.1 ”項下方法制備成供試品溶液,并按照“1.3.3”項下色譜條件進樣分析,重復6次,計算得其RSD為1.62%(n=6),該實驗結(jié)果表明此方法的重復性良好(見表5)。

表5 補骨脂乙素的重復性試驗結(jié)果

2.2 單因素試驗 固定料液比1∶10,堿液濃度1%,堿提時間1 h,酸沉pH 5,酸沉時間1 h,超聲時間10 min保持不變,依次改變上述條件中的單一條件進行單因素試驗。堿提酸沉法提取補骨脂乙素的最佳條件為:料液比1∶10,堿液濃度3%,堿提時間2 h,酸沉pH6,酸沉時間2 h,超聲時間25 min(見圖2)。

2.3 正交試驗 通過計算正交試驗極差值可知,各因素所產(chǎn)生的影響由大到小順序依次為:A堿液濃度,B酸沉時間,C超聲時間;此外,不同水平對結(jié)果的影響分別為:A3>A2>A1;B1>B2>B3;C3>C2> C1(見表6) 。由正交試驗方差分析結(jié)果可知,堿液濃度差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(見表7)。鑒于以上結(jié)果,優(yōu)化組合為A3B1C3,即堿提酸沉法提取補骨脂乙素的最佳條件為堿液濃度4%、酸沉時間0.5 h、超聲時間20 min。

表6 L9(34) 正交試驗分析結(jié)果

3 討論

中醫(yī)近年在國際上影響力漸增,隨著人們對于中藥的研究越發(fā)深入,探究各類中藥中的有效成分是近幾年來的熱點話題。目前已經(jīng)報道的中藥有效成分提取工藝有多種,例如:回流法、煎煮法、浸漬法、滲漉法和溶劑提取法等[13-14],這些方法都有其局限性,回流法和煎煮法會破壞受熱易分解的成分;浸漬法、滲漉法效率低時間長;溶劑提取法雖然效率高、簡單快捷,但毒性較大。

表7 L9(34) 正交試驗方差分析結(jié)果

堿提酸沉法作為一種經(jīng)濟、環(huán)保、高效的提取方法,常用于黃酮類、蒽醌類、酚性、內(nèi)酯結(jié)構(gòu)的木脂素、香豆素類等化合物的提取分離[15-16]。補骨脂乙素是中藥補骨脂中的查爾酮類活性成分,具有較高的藥理活性。但其在補骨脂中的含量較低,不易被大量開發(fā)利用,因此,尋找一種最優(yōu)的提取條件對其進行大量提取是非常有必要的。本研究針對補骨脂乙素酚羥基的酸性性質(zhì),通過堿提酸沉的方法優(yōu)化提取條件,建立了一種簡便、高效、重復性良好的補骨脂乙素堿提酸沉提取方法。

通過以補骨脂中補骨脂乙素含量為檢測指標,采用高效液相色譜法測其含量,前期預實驗中,考察了不同堿液氫氧化鈉及碳酸鈉對補骨脂乙素含量的影響,最終選擇了提取含量較高的碳酸鈉為最佳堿液;通過考察不同酸沉pH,發(fā)現(xiàn)酸性過強時沉淀消失,可能是沉淀出的化合物在強酸環(huán)境下生成鹽復溶于酸中,而pH 3～6范圍內(nèi)對補骨脂乙素含量影響較小,考慮到生產(chǎn)成本,選擇pH 6為最佳酸沉pH。

為進一步確認提取的最佳條件,根據(jù)單因素試驗結(jié)果,選擇堿液濃度、酸沉時間以及超聲時間三個水平進行正交試驗。本實驗通過對正交試驗的結(jié)果進行方差分析,以彌補其不能準確估計直觀分析結(jié)果對試驗的誤差及各因素作用的缺陷。根據(jù)單因素試驗與正交試驗結(jié)果,考慮到補骨脂乙素的生產(chǎn)成本以及提取效率等因素,我們確定堿提酸沉法提取補骨脂乙素的最佳工藝條件為:料液比1∶10,堿液濃度4%,堿提時間2 h,酸沉pH 6,酸沉時間0.5 h,超聲時間20 min。

本研究通過堿提酸沉的方法對補骨脂中的補骨脂乙素提取工藝進行優(yōu)化,其方法穩(wěn)定可靠、操作簡便,重現(xiàn)性好,適合補骨脂乙素的大量提取。