殷秀琴 于莉 易璐 方家華

長(zhǎng)沙市第一醫(yī)院眼科,長(zhǎng)沙 410005

翼狀胬肉是一種良性增生性眼部疾病,向角膜表面進(jìn)行性生長(zhǎng),導(dǎo)致眼部異物感、眼球運(yùn)動(dòng)障礙及視物遮擋[1-3]。病理學(xué)研究顯示,翼狀胬肉的主要成分是大量異常增生的成纖維細(xì)胞和新生血管,成纖維細(xì)胞的病理性增生是翼狀胬肉形成和發(fā)展的主要因素[4-5]。因此探明翼狀胬肉成纖維細(xì)胞病理性增生的分子機(jī)制是解析該病發(fā)病機(jī)制及靶向治療的關(guān)鍵。B淋巴細(xì)胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)是一種原癌基因,具有明顯抑制細(xì)胞凋亡的作用[6-7]。已有研究證實(shí),翼狀胬肉組織中過度表達(dá)的Bcl-2通過抑制成纖維細(xì)胞及上皮細(xì)胞凋亡,導(dǎo)致其過度增生,是翼狀胬肉形成的重要原因[8-10]。目前,Bcl-2在翼狀胬肉中過度表達(dá)的分子機(jī)制還不明確。Bcl-2基因啟動(dòng)子-483～-1 065 bp區(qū)域包含多個(gè)CCCTC結(jié)合因子(CCCTC binding factor,CTCF)結(jié)合位點(diǎn),而且該區(qū)域含有多個(gè)CpG島,為DNA甲基化敏感區(qū)域。DNA發(fā)生甲基化修飾后會(huì)導(dǎo)致DNA結(jié)構(gòu)超螺旋,進(jìn)而阻遏基因轉(zhuǎn)錄,引起基因轉(zhuǎn)錄沉默;而去甲基化則會(huì)使DNA結(jié)構(gòu)松散,促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄[11-12]。研究顯示,CTCF能介導(dǎo)靶基因DNA發(fā)生去甲基化,上調(diào)靶基因的表達(dá)[13-14]。CTCF與Bcl-2的調(diào)控關(guān)系以及CTCF與翼狀胬肉的關(guān)系目前均未見研究報(bào)道。本研究擬通過檢測(cè)翼狀胬肉中CTCF表達(dá)水平、Bcl-2基因DNA甲基化水平,以及CTCF與Bcl-2基因DNA甲基化水平的關(guān)系,闡述翼狀胬肉中Bcl-2異常表達(dá)的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1標(biāo)本來源與采集 收集2017年6月至2019年2月在長(zhǎng)沙市第一醫(yī)院眼科行翼狀胬肉切除聯(lián)合自體角膜緣干細(xì)胞移植術(shù)的22例原發(fā)性翼狀胬肉患者翼狀胬肉組織作為翼狀胬肉組,其中男12例,女10例,平均年齡(50.4±9.1)歲;采集同期行修復(fù)手術(shù)的20例眼外傷患者少量正常結(jié)膜組織作為正常結(jié)膜組,其中男13例,女7例,平均年齡(48.3±10.9)歲。翼狀胬肉組納入標(biāo)準(zhǔn):原發(fā)性翼狀胬肉。排除標(biāo)準(zhǔn):眼局部損傷引起的結(jié)膜異常增生;復(fù)發(fā)性翼狀胬肉。正常結(jié)膜組納入標(biāo)準(zhǔn):結(jié)膜裂傷、眼球破裂傷或眼球穿通傷的眼外傷患者。排除標(biāo)準(zhǔn):結(jié)膜炎、結(jié)膜腫物等結(jié)膜相關(guān)疾病患者。用生理鹽水充分洗凈術(shù)中切取的翼狀胬肉組織和正常結(jié)膜組織表面血液,修剪組織后立即置于液氮中保存。2個(gè)組患者年齡、性別等一般資料比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。本研究方案通過長(zhǎng)沙市第一醫(yī)院倫理委員會(huì)審批(批文號(hào):KL-2017021),所有標(biāo)本來源患者均簽署知情同意書。

1.1.2主要試劑及儀器 Trizol、青霉素/鏈霉素混合雙抗、Ⅱ型膠原酶、DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清、Lipofectamine 3000(美國(guó)Invitrogen公司);PrimeScriptTM逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green熒光染料(日本TaKaRa公司);蛋白酶抑制劑、RIPA細(xì)胞裂解液、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司);PVDF膜(美國(guó)Millipore公司);BCA試劑盒(美國(guó)Merck公司);鼠抗人CTCF抗體、鼠抗人Bcl-2抗體、鼠抗人3-磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)抗體、羊抗鼠IgG抗體、鼠抗人波形蛋白抗體、ECL化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)試劑盒、DAB顯色試劑盒(美國(guó)Cell Signaling Technology公司);基因組DNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司);EpiTect Fast DNA Bisulfite試劑盒(德國(guó)Qiagen公司);CTCF干擾質(zhì)粒pRS-CTCF、對(duì)照質(zhì)粒pRS(美國(guó)OriGene公司);細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(cell counting kit-8,CCK-8)(日本同仁化學(xué)公司)。Light Cycler96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(瑞士Roche公司);微量電動(dòng)組織勻漿器(美國(guó)Kimble公司)。

1.2 方法

1.2.1實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)各組CTCF、Bcl-2的mRNA表達(dá)水平 將翼狀胬肉組和正常結(jié)膜組組織剪成小塊,加入液氮迅速研磨粉碎并加入1 ml Trizol,轉(zhuǎn)入離心管中,使用電動(dòng)組織勻漿器充分勻漿;4 ℃條件下12 000×g離心5 min,取上清,按每1 ml加入200 μl氯仿,常規(guī)Trizol法抽提總RNA。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,并以cDNA為模板采用SYBR Green熒光染料法進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。反應(yīng)條件為:95 ℃預(yù)變性30 s;95 ℃變性5 s,60 ℃退火及延伸35 s,共40個(gè)循環(huán)。基因引物序列見表1,以GAPDH為內(nèi)參照,采用2-ΔΔCt法計(jì)算各目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1 PCR引物序列Table 1 PCR primer sequence基因引物序列(5'-3')產(chǎn)物長(zhǎng)度(bp)CTCF正向:TCGGCATCGTCGTTACAAA反向:ACGGACGCTCTCCAGTATGA122Bcl-2正向:TGTGTGTGGAGAGCGTCAAC反向:TCTTCAGAGACAGCCAGGAGA186GAPDH正向:CCAAGGCTGTGGGCAAGGT反向:GGAGGAGTGGGTGTCGCTGT239 注:PCR:聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng);CTCF:CCCTC結(jié)合因子;Bcl-2:B淋巴細(xì)胞瘤-2;GAPDH:3-磷酸甘油醛脫氫酶 Note:PCR:polymerase chain reaction;CTCF:CCCTC binding factor;Bcl-2:B-cell lymphoma-2;GAPDH:glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase

1.2.2Western blot法檢測(cè)各組CTCF、Bcl-2的蛋白表達(dá)水平 取翼狀胬肉組和正常結(jié)膜組樣本盡量剪碎,加入含蛋白酶抑制劑的RIPA細(xì)胞裂解液,于冰上進(jìn)行勻漿裂解30 min,4 ℃、12 000×g離心5 min,收集上清即為總蛋白提取液,BCA試劑盒測(cè)定濃度。每個(gè)樣本約取30 μg 總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳,并將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印到PVDF膜,使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%脫脂牛奶室溫封閉1 h,加入抗CTCF抗體(1∶300)、抗Bcl-2抗體(1∶300)、抗GAPDH抗體(1∶500),4 ℃孵育過夜;PBS漂洗3次后加入羊抗鼠二抗(1∶1 000)室溫孵育1 h,使用ECL化學(xué)發(fā)光法顯影,以GAPDH為內(nèi)參照,采用ImageJ分析軟件計(jì)算各目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3亞硫酸氫鹽處理后測(cè)序檢測(cè)各組Bcl-2啟動(dòng)子DNA甲基化水平 通過Meth-primer在線分析Bcl-2啟動(dòng)子DNA序列,預(yù)測(cè)CpG島并設(shè)計(jì)亞硫酸氫鹽處理后測(cè)序法(bisulfite sequencing PCR,BSP)引物,共使用2對(duì)引物分別對(duì)CpG島的不同區(qū)段(-465～-729 bp,-746～-1 073 bp)進(jìn)行擴(kuò)增,BSP引物序列見表2。取翼狀胬肉組和正常結(jié)膜組樣本盡量剪碎,加入液氮冷凍后研磨,使用基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA。使用EpiTect Fast DNA Bisulfite試劑盒處理和純化基因組DNA,所得DNA用于后續(xù)PCR反應(yīng)。PCR擴(kuò)增及克隆完成后進(jìn)行測(cè)序,分別統(tǒng)計(jì)各個(gè)樣本的測(cè)序結(jié)果(每樣本克隆數(shù)≥5),得出每個(gè)樣本單個(gè)CG位點(diǎn)的甲基化百分比。每個(gè)樣本所有位點(diǎn)甲基化百分比相加后除以位點(diǎn)數(shù)得到檢測(cè)區(qū)域的平均甲基化水平。

表2 Bcl-2啟動(dòng)子BSP引物序列Table 2 BSP primer sequence of Bcl-2 promoter擴(kuò)增位置正向引物(5'-3')反向引物(5'-3')產(chǎn)物長(zhǎng)度(bp)-465^-729 bpTAGGTTTGAGTAGAAGGTTTAAAACCCTCCTCTAAACCACC264-746^-1 073 bpAGAGGATAGGTATTATAGTTTTCCCCCCTAAACCCCCTCTT327 注:Bcl-2:B淋巴細(xì)胞瘤-2;BSP:亞硫酸氫鹽處理后測(cè)序法 Note:Bcl-2:B-cell lymphoma-2;BSP:bisulfite sequencing PCR

1.2.4翼狀胬肉成纖維細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定 取3例翼狀胬肉患者術(shù)中切除的翼狀胬肉,立即置入含無菌生理鹽水的EP管內(nèi),用預(yù)冷的含100 U/ml(商品單位)青霉素和鏈霉素的PBS重復(fù)漂洗至溶液變澄清。將標(biāo)本剪碎成約1 mm3的小塊,置于含1 mg/ml Ⅱ型膠原酶的無血清DMEM培養(yǎng)基中37 °C消化2 h,直接加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05%胰蛋白酶消化10 min,200×g離心10 min收集沉淀的細(xì)胞。將細(xì)胞重懸于含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、100 U/ml(商品單位)青霉素和鏈霉素的DMEM完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。去除未貼壁的細(xì)胞,貼壁細(xì)胞在DMEM完全培基中繼續(xù)培養(yǎng),傳代4代后使用。無菌蓋玻片經(jīng)多聚賴氨酸處理后放入6孔板中,將細(xì)胞懸液滴在蓋玻片上,于培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h;多聚甲醛固定細(xì)胞15 min,PBS沖洗3次,經(jīng)雙氧水和山羊血清處理后,加入鼠抗人波形蛋白抗體(1∶300),以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照,4 °C孵育過夜;PBS漂洗后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG(1∶1 000),室溫孵育1 h,DAB顯色劑顯色后于光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.2.5翼狀胬肉成纖維細(xì)胞的分組及轉(zhuǎn)染 將翼狀胬肉成纖維細(xì)胞接種到6孔板分成2個(gè)組,其中CTCF干擾組使用Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染CTCF干擾質(zhì)粒pRS-CTCF,對(duì)照組轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒pRS。轉(zhuǎn)染后48 h收集細(xì)胞分別抽提總RNA及基因組DNA,采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)CTCF、Bcl-2表達(dá)水平,采用BSP法檢測(cè)Bcl-2啟動(dòng)子DNA甲基化水平。

1.2.6CCK-8法檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的增生活性 先分別將CTCF干擾質(zhì)粒和空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)翼狀胬肉成纖維細(xì)胞,每組轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)后6 h按4×103個(gè)/孔的密度分別接種于96孔板,每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔,每組共接種3塊板。分別于轉(zhuǎn)染后12、24和48 h進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)前更換培養(yǎng)基后每孔加入10 μl CCK-8試劑,37 °C培養(yǎng)2 h,測(cè)量波長(zhǎng)450 nm處吸光度(absorbance,A)值。細(xì)胞活力抑制率=(對(duì)照組A值-CTCF干擾組A值)/對(duì)照組A值×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 翼狀胬肉組與正常結(jié)膜組中CTCF和Bcl-2 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

翼狀胬肉組CTCF mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為7.23±3.34和0.92±0.21,明顯高于正常結(jié)膜組的1.10±0.44和0.28±0.07,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-8.136、-13.025,均P<0.01)。翼狀胬肉組Bcl-2 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為10.27±4.64和0.95±0.27,明顯高于正常結(jié)膜組的1.10±0.41和0.32±0.14,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-8.789、-10.782,均P<0.01)(圖1)。

圖1 正常結(jié)膜組與翼狀胬肉組中CTCF和Bcl-2 mRNA及蛋白表達(dá)比較(正常結(jié)膜組n=20,翼狀胬肉組n=22) A、B:各組CTCF和Bcl-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 與正常結(jié)膜組比較,aP<0.01(獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)) C:各組CTCF和Bcl-2蛋白表達(dá)電泳圖 翼狀胬肉組CTCF和Bcl-2蛋白條帶灰度明顯強(qiáng)于正常結(jié)膜組 D、E:各組CTCF和Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 與正常結(jié)膜組比較,aP<0.01(獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)) Bcl-2:B淋巴細(xì)胞瘤-2;CTCF:CCCTC結(jié)合因子;GAPDH:3-磷酸甘油醛脫氫酶 圖2 正常結(jié)膜組與翼狀胬肉組中Bcl-2啟動(dòng)子DNA甲基化水平比較 與正常結(jié)膜組比較,aP<0.01(獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),正常結(jié)膜組n=20,翼狀胬肉組n=22) Bcl-2:B淋巴細(xì)胞瘤-2

2.2 翼狀胬肉組與正常結(jié)膜組中Bcl-2啟動(dòng)子DNA甲基化水平比較

翼狀胬肉組Bcl-2啟動(dòng)子DNA甲基化水平為0.65±0.09,明顯低于正常結(jié)膜組的0.83±0.06,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=7.408,P<0.01)(圖2)。

2.3 翼狀胬肉組織中Bcl-2 mRNA與CTCF蛋白及Bcl-2啟動(dòng)子DNA甲基化的相關(guān)性

翼狀胬肉組織中CTCF蛋白相對(duì)表達(dá)量與Bcl-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量呈顯著正相關(guān)(r=0.746,P<0.01)。Bcl-2啟動(dòng)子DNA甲基化水平與Bcl-2 mRNA表達(dá)水平呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.635,P<0.01)(圖3)。

圖3 翼狀胬肉組織中Bcl-2 mRNA與CTCF蛋白及Bcl-2啟動(dòng)子DNA甲基化水平相關(guān)性散點(diǎn)圖(Pearson線性相關(guān)分析,n=22) A:Bcl-2 mRNA與CTCF蛋白表達(dá)水平呈顯著正相關(guān) r=0.746,P<0.01 B:Bcl-2 mRNA表達(dá)水平與基因啟動(dòng)子甲基化水平呈明顯負(fù)相關(guān) r=-0.635,P<0.01 Bcl-2:B淋巴細(xì)胞瘤-2;CTCF:CCCTC結(jié)合因子

2.4 體外培養(yǎng)翼狀胬肉成纖維細(xì)胞的鑒定

倒置顯微鏡下觀察培養(yǎng)的細(xì)胞形態(tài)以長(zhǎng)梭形為主,分布均勻(圖4A)。免疫組織化學(xué)染色可見細(xì)胞質(zhì)中波形蛋白染色呈棕黃色陽(yáng)性染色,而陰性對(duì)照細(xì)胞無著色(圖4B,C)。結(jié)合形態(tài)學(xué)及免疫組織化學(xué)的結(jié)果基本鑒定為成纖維細(xì)胞。

圖4 體外培養(yǎng)翼狀胬肉成纖維細(xì)胞鑒定 A:倒置顯微鏡下觀察培養(yǎng)的細(xì)胞(×100,標(biāo)尺=200 μm) 細(xì)胞形態(tài)均一且多呈長(zhǎng)梭形,分布較均勻,密度較高時(shí)呈魚群狀或放射狀 B:細(xì)胞爬片波形蛋白免疫組織化學(xué)染色(DAB ×200,標(biāo)尺=100 μm) 細(xì)胞質(zhì)中波形蛋白染色呈棕黃色陽(yáng)性染色 C:細(xì)胞爬片波形蛋白免疫組織化學(xué)染色陰性對(duì)照(DAB ×200,標(biāo)尺=100 μm) 細(xì)胞無著色

2.5 各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞CTCF和Bcl-2 mRNA及蛋白表達(dá)比較

CTCF干擾組CTCF和Bcl-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.37±0.03和0.53±0.06,均明顯低于對(duì)照組的1.02±0.06和0.99±0.07,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=20.035、9.029,均P<0.01)。CTCF干擾組CTCF和Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.23±0.06和0.56±0.07,明顯低于對(duì)照組的0.52±0.05和0.92±0.12,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.914、4.719,均P<0.01)(圖5)。

圖5 CTCF干擾組與對(duì)照組CTCF和Bcl-2 mRNA及蛋白表達(dá)比較 A、B:各組CTCF和Bcl-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 與對(duì)照組比較,aP<0.01(獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),n=3) C:各組CTCF和Bcl-2蛋白表達(dá)電泳圖 CTCF干擾組CTCF和Bcl-2蛋白條帶灰度明顯弱于對(duì)照組 D、E:各組CTCF和Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 與對(duì)照組比較,aP<0.01(獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),n=3) CTCF:CCCTC結(jié)合因子;Bcl-2:B淋巴細(xì)胞瘤-2;GAPDH:3-磷酸甘油醛脫氫酶

2.6 各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增生活性比較

CTCF干擾組轉(zhuǎn)染后12、24和48 h細(xì)胞活力分別為0.10±0.01、0.17±0.01和0.38±0.04,明顯低于對(duì)照組的0.12±0.01、0.29±0.01和0.85±0.06,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.718、18.350、15.621,均P<0.01)。CTCF干擾組轉(zhuǎn)染后12、24和48 h細(xì)胞活力抑制率分別為(17.00±0.05)%、(41.00±0.05)%和(55.00±0.07)%(圖6)。

圖6 各轉(zhuǎn)染組不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞活力比較 與同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組比較,CTCF干擾組細(xì)胞活力明顯下降,aP<0.01(獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),n=3) CTCF:CCCTC結(jié)合因子 圖7 各轉(zhuǎn)染組Bcl-2啟動(dòng)子DNA甲基化水平比較 與對(duì)照組比較,aP<0.01(獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),n=3) Bcl-2:B淋巴細(xì)胞瘤-2;CTCF:CCCTC結(jié)合因子

2.7 各轉(zhuǎn)染組Bcl-2啟動(dòng)子DNA甲基化水平比較

CTCF干擾組Bcl-2啟動(dòng)子DNA甲基化水平為0.75±0.04,明顯高于對(duì)照組的0.61±0.03,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-4.472,P<0.01)(圖7)。

3 討論

CTCF是一種高度保守的具有多鋅指結(jié)構(gòu)的多功能轉(zhuǎn)錄因子,調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄[15-16]。CTCF對(duì)于不同基因發(fā)揮不同的調(diào)控作用,能結(jié)合到MYC原癌基因、Bax、HomeoboxA10等基因的啟動(dòng)子區(qū),作為絕緣子阻礙相鄰順式元件對(duì)基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)[17-19]。然而,CTCF也可以結(jié)合到淀粉樣β前體蛋白(amyloid beta precursor protein,APP)啟動(dòng)子作為轉(zhuǎn)錄激活劑,上調(diào)APP的轉(zhuǎn)錄[20]。CTCF的靶基因中有很多與細(xì)胞凋亡和增生相關(guān),異常表達(dá)的CTCF能介導(dǎo)眾多腫瘤細(xì)胞抵抗凋亡,導(dǎo)致其惡性增生[19,21-22]。大量研究證實(shí)成纖維細(xì)胞的異常增生與分化是翼狀胬肉形成的關(guān)鍵因素[23-24]。Shen等[9]研究發(fā)現(xiàn),翼狀胬肉組織中微小RNA(micro RNA,miR)-15a的表達(dá)顯著低于正常結(jié)膜組織,miR-15a的靶基因Bcl-2表達(dá)升高;在翼狀胬肉上皮細(xì)胞中過表達(dá)miR-15a可以下調(diào)Bcl-2的表達(dá),促進(jìn)細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示,翼狀胬肉組織中CTCF、Bcl-2的表達(dá)均較正常結(jié)膜組織明顯升高,且二者的表達(dá)水平呈顯著正相關(guān);CTCF干擾組細(xì)胞中Bcl-2表達(dá)水平顯著下調(diào),細(xì)胞活力明顯下降。這一發(fā)現(xiàn)完善了翼狀胬肉組織中Bcl-2過度表達(dá)的分子機(jī)制,證實(shí)CTCF是Bcl-2表達(dá)的重要促進(jìn)因子,從而參與翼狀胬肉的疾病進(jìn)程。

DNA甲基化是指在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶作用下,將甲基轉(zhuǎn)移到CpG二核苷酸的脫氧胞嘧啶第5位碳原子,形成5mC的過程[25]。DNA去甲基化是在TET(ten-eleven-translocation)蛋白家族介導(dǎo)的羥甲基化作用下開始的,通過一系列氧化還原反應(yīng)最終會(huì)去除5mC,將甲基化胞嘧啶轉(zhuǎn)化為未修飾的胞嘧啶[26]。Wiehle等[27]研究發(fā)現(xiàn),CTCF可以與TET家族蛋白相互作用,介導(dǎo)胚胎干細(xì)胞發(fā)育相關(guān)基因的DNA去甲基化。在B細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞及結(jié)腸癌細(xì)胞等腫瘤細(xì)胞中,Bcl-2基因DNA低甲基化導(dǎo)致Bcl-2過度表達(dá),參與腫瘤細(xì)胞的惡性增生[28-29]。本研究發(fā)現(xiàn)翼狀胬肉中Bcl-2啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化水平顯著低于正常結(jié)膜組織,且Bcl-2 DNA甲基化水平與其mRNA水平呈顯著負(fù)相關(guān),說明DNA低甲基化是Bcl-2在翼狀胬肉中異常表達(dá)的重要原因。此外,在翼狀胬肉成纖維細(xì)胞中干擾CTCF表達(dá)后,Bcl-2啟動(dòng)子DNA甲基化水平顯著上調(diào)。因此推測(cè)過度表達(dá)的CTCF是Bcl-2啟動(dòng)子低甲基化的重要原因。

綜上所述,過度表達(dá)的CTCF介導(dǎo)Bcl-2啟動(dòng)子低甲基化,導(dǎo)致Bcl-2異常高表達(dá),引起翼狀胬肉成纖維細(xì)胞凋亡/增生失衡,參與翼狀胬肉的形成。這一發(fā)現(xiàn)不僅完善了翼狀胬肉成纖維細(xì)胞凋亡及增生失衡的分子調(diào)節(jié)機(jī)制,更為翼狀胬肉患者的治療提供了有效的生物靶點(diǎn)。但本研究未探明CTCF與DNA甲基化/去甲基化相關(guān)修飾酶等調(diào)節(jié)DNA甲基化的直接效應(yīng)分子之間的相互作用,在后續(xù)的研究中我們會(huì)進(jìn)一步完善翼狀胬肉中CTCF參與Bcl-2啟動(dòng)子DNA低甲基化的分子機(jī)制。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明殷秀琴:參與研究選題、研究實(shí)施、論文撰寫;方家華:參與研究選題、實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)、論文修改和定稿;于莉、易璐:參與研究實(shí)施、數(shù)據(jù)分析