祖麗胡馬爾·艾孜木阿吉，趙 煥，馬 晟，高 苒，王雅茹，肖 汀，

(1．國(guó)家癌癥中心/國(guó)家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心/中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院腫瘤醫(yī)院，分子腫瘤學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，癌發(fā)生及預(yù)防分子機(jī)理北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100021；2．國(guó)家癌癥中心/國(guó)家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心/中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院腫瘤醫(yī)院，病理科，北京100021；3．中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，北京 100021)

尿路上皮癌(urothelial carcinoma，UC)是起源于尿路上皮的一種多源性惡性腫瘤，包括膀胱癌(bladder cancer，BC)和上尿路上皮癌(upper tract urothelial carcinoma，UTUC)，是泌尿生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一[1-3]。目前膀胱鏡和尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查是監(jiān)測(cè)UC的金標(biāo)準(zhǔn)。但膀胱鏡的局限性在于對(duì)UTUC和原位癌難以活檢，且有創(chuàng)不適合作為常規(guī)監(jiān)測(cè)的方法[4]。尿脫落細(xì)胞學(xué)雖屬于特異度高的無創(chuàng)檢查，但因其靈敏度有限從而容易漏診[5-6]。尋找可輔助尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查并提高UC檢出率的非侵入性生物標(biāo)志物是UC診治的研究重點(diǎn)。

隨著“精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)”概念的普及，液體活檢作為無創(chuàng)診療是腫瘤精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的發(fā)展方向之一。在泌尿生殖系統(tǒng)惡性腫瘤中，由于尿液與腫瘤直接接觸，使得尿游離DNA(cell-free DNA，cfDNA)檢測(cè)成為最常用的一種液體活檢方法[7]。cfDNA的檢測(cè)可以獨(dú)立于細(xì)胞形態(tài)學(xué)，甚至早于細(xì)胞形態(tài)的改變檢測(cè)出靶基因的突變狀態(tài)。有研究表明接受過膀胱切除術(shù)的患者尿cfDNA 中拷貝數(shù)水平預(yù)示著腫瘤復(fù)發(fā)的可能，而且在與循環(huán)腫瘤DNA(circulating tumor DNA，ctDNA)關(guān)聯(lián)時(shí)其預(yù)測(cè)結(jié)果更為明顯[8]。但由于尿cfDNA 濃度低DNA 含量較少，已有的傳統(tǒng)基因檢測(cè)手段如Sanger 測(cè)序等無法精準(zhǔn)檢測(cè)DNA含量低的樣本，所以另一種靈敏度更高的檢測(cè)方法成為了檢測(cè)尿cfDNA 的重要手段。液滴數(shù)字PCR(droplet digital PCR，ddPCR)是近年來發(fā)展起來的一種突破性定量的分析技術(shù)，這種高靈敏的技術(shù)已經(jīng)證明了其在絕對(duì)定量、稀有事件檢測(cè)、拷貝數(shù)變異、基因表達(dá)和定量miRNA等應(yīng)用中的可靠性[9]。

成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體3(fibroblast growth factor receptor 3，F(xiàn)GFR3)基因被認(rèn)為是膀胱癌患者尿液細(xì)胞中具有潛能的生物標(biāo)志物[10]。位于FGFR3第7號(hào)外顯子上的S249C 位點(diǎn)是最常見的突變位點(diǎn)(TCC→TGC)[11]，S249C 突變型受體中的半胱氨酸殘基可以使突變型單體在胞外形成二硫鍵從而觸發(fā)激酶的激活[12]，這會(huì)持續(xù)激活下游細(xì)胞的增殖途徑并減少細(xì)胞凋亡[13]，有研究表明該突變會(huì)導(dǎo)致乳頭狀膀胱癌的形成[14]。Montalbo等[15]對(duì)尿脫落細(xì)胞學(xué)診斷不明確的樣本通過多重PCR與SNapShot的方法聯(lián)用檢測(cè)FGFR3基因突變，結(jié)果發(fā)現(xiàn)由于檢測(cè)突變率較低無法評(píng)估其對(duì)于尿脫落細(xì)胞學(xué)診斷不明確樣本的臨床意義。Christensen 等[16]利用ddPCR 方法檢測(cè)尿cfDNA 和血漿ctDNA中FGFR3和PIK3CA突變位點(diǎn)，結(jié)果表明UC患者尿cfDNA 突變拷貝數(shù)水平與腫瘤階段、等級(jí)和大小呈正相關(guān)，尿cfDNA中高拷貝數(shù)能提示疾病的進(jìn)展。

本研究采用ddPCR 方法檢測(cè)UC 患者尿cfDNA 中FGFR3S249C突變情況，以輔助提高尿脫落細(xì)胞學(xué)診斷不明確的樣本對(duì)于UC的診斷效能。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本來源 選取2020年11月—2021年7月在中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院就診的泌尿系統(tǒng)疾病患者。前瞻性收集臨床懷疑有尿路上皮病變患者尿液(送檢尿量＞200 mL)，納入分析的實(shí)驗(yàn)組標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)膀胱鏡或術(shù)后組織病理結(jié)果確診為尿路上皮癌；納入分析的對(duì)照組標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)膀胱鏡或術(shù)后組織病理結(jié)果確診為良性。排除標(biāo)準(zhǔn)：非尿路上皮病變，或有其他系統(tǒng)的惡性腫瘤史。

1.1.2 樣本量估算 引用公式n=Uα2P(1-P)/δ2。n=預(yù)估樣本量；Uα=正態(tài)分布中累積概率為α/2 的U值；U0.05=1.96；P值分別為：預(yù)估FGFR3用于診斷尿路上皮癌的靈敏度(0.80)和診斷尿路皮癌的特異度(0.90)；δ=允許誤差(通常定為0.05～0.10)。計(jì)算得出預(yù)估所需樣本量為30。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑 提取尿cfDNA 所需試劑Quick-DNA Urine Kit(含尿液穩(wěn)定劑)購(gòu)于Zymo research 公司；QubitTMdsDNA HS and BR Assay Kits 購(gòu)于Invitrogen 公司。ddPCR 所需ddPCRTMSupermix for Probes(No dUTP)、微滴生成油、ddPCRTM微滴讀取油、DG8TMCartridges and Gaskets、DG8 Cartridge Holder、Pierceable Foil Heat Seal、PCR 半裙邊96 孔板和探針FGFR3 pS249C_dHsaMDV2516760(20×)均購(gòu)自Bio-Rad 公司；UltraPureTMDNase/RNase-Free 雙蒸水購(gòu)于Invitrogen公司。

1.1.4 實(shí)驗(yàn)儀器 QX200TMDroplet reader、QX200TMDroplet Generator、PX1 PCR Plate Sealer 和T100熱循環(huán)儀均購(gòu)于Bio-Rad公司；DRAGON LAB MX-F渦旋儀購(gòu)于Dragon公司；恒溫水浴鍋購(gòu)于北京醫(yī)療器械公司；Qubit 3.0購(gòu)于Thermo Fisher公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 尿cfDNA 提取 選擇送檢尿量大于200 mL者，混勻后留取40 mL，2500 g/min離心后留上清液加入尿液穩(wěn)定劑(每1 mL 尿加入70 μL 尿液穩(wěn)定劑)，以備DNA 提取。另外150 mL 尿用于尿脫落細(xì)胞學(xué)診斷制片。

尿cfDNA 提取分為3 個(gè)步驟：總DNA(游離)沉淀、蛋白消化、DNA 純化。①將已加入尿液穩(wěn)定劑的40 mL 尿液轉(zhuǎn)移到合適的離心管內(nèi)，并加入20 μL 純化珠，3000 g 離心15 min，收集細(xì)胞沉淀。②棄去上清后不攪動(dòng)細(xì)胞沉淀，保留大約100-400 μL 細(xì)胞沉淀，并向其中加入等體積的尿液細(xì)胞消化液，重懸。將5%的蛋白酶K加到重懸的細(xì)胞沉淀中，渦旋混勻，在55 ℃下孵育30 min。③添加1倍體積的基因組裂解液到消化完后的混合液中，并渦旋混勻。將全部樣品轉(zhuǎn)移到Zymo-SpinTMIC-S 柱中，Zymo-SpinTMIC-S 柱套在一個(gè)收集管后16000 g離心(下同)1 min，去除濾出液后，重復(fù)上述步驟。將Zymo-SpinTMIC-S柱套在新的收集管中，加入200 μL Urine DNA Prep Buffer 到離心柱中，離心1 min，棄去濾出液。將700 μL Urine DNA Wash Buffer 放置到離心柱中離心1 min，棄去濾出液。再用200 μL Urine DNA Wash Buffer重復(fù)上步驟。將離心柱轉(zhuǎn)移到不含DNase/RNase-free 的EP管中，加入10 μL DNA 洗脫液到基質(zhì)上，室溫下放置3～5 min，全速離心1 min 來洗脫DNA。cfDNA 濃度采用Qubit 3.0 熒光定量?jī)x測(cè)定，選取濃度＞0.3 ng/μL的cfDNA樣本進(jìn)行ddPCR檢測(cè)。

1.2.2 ddPCR 檢測(cè)尿cfDNA 中FGFR3S249C 突變進(jìn)行ddPCR 檢測(cè)的流程有配制反應(yīng)液、制備微滴、PCR擴(kuò)增、讀取微滴、分析數(shù)據(jù)。①配置反應(yīng)液：探針1 μL，ddPCRTMSupermix for Probes(No dUTP)11 μL，模板1 μL，UltraPuretm DNase/RNase-Free 雙蒸水加至終體積為20 μL。②制備油滴：在DG8 cartridge中間的8個(gè)孔內(nèi)分別加入20 μL配置好的反應(yīng)液，加樣時(shí)需避免引入氣泡。將70 μL微滴生成油加入到DG8 cartridge 最下方的8 個(gè)孔中蓋上DG8TMGaskets，并鉤牢兩邊小孔。制備好的DG8 Cartridge Holder 輕放于QX200TMDroplet Generator 中并生成微滴。③PCR 擴(kuò)增：DG8TMcartridge 最上排孔內(nèi)為已生成的微滴，在96 孔板內(nèi)緩慢打入已生成的微滴，將PX1熱封儀提前預(yù)熱對(duì)已鋪好微滴液的96孔板進(jìn)行封膜，運(yùn)行熱封儀的程序?yàn)?80 ℃，5 s。PCR反應(yīng)需在封膜后的30 min內(nèi)進(jìn)行：95 ℃、 10 min；39個(gè)循環(huán)94 ℃、30 s，55 ℃、1 min；98 ℃、10 min，16 ℃保存(升降溫速度2.5 ℃/s)。④讀取微滴，分析數(shù)據(jù)：在plate holder 中放入已完成PCR 的96 孔板組裝好后放入到QX200TMDroplet reader 中，使用QuantaSoft 軟件進(jìn)行檢測(cè)并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，ddPCR 反應(yīng)總微滴數(shù)＞10000 的樣本納入后續(xù)分析。按下式計(jì)算突變等位基因頻率(mutation allele frequency，MAF)，MAF 是ddPCR 讀出的突變型拷貝數(shù)占總拷貝數(shù)的比例，是判定該樣本是否有突變的重要標(biāo)準(zhǔn)[17-18]。

以往研究報(bào)道使用與本研究相一致的BioRad QX200 系統(tǒng)和實(shí)驗(yàn)試劑去檢測(cè)尿cfDNA 中FGFR3S249C突變位點(diǎn)[19-20]，對(duì)突變結(jié)果進(jìn)行判讀的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)為：MAF＞0.1%；突變陽(yáng)性微滴≥3。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 23.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。本研究中對(duì)MAF 和cfDNA 濃度等計(jì)量資料進(jìn)行Shapiro-Wilk 正態(tài)性檢驗(yàn)后，不符合正態(tài)分布故該計(jì)量資料以M(P25，P75)表示，組間比較采用非參數(shù)Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。分類變量使用Fisher 精準(zhǔn)檢驗(yàn)進(jìn)行比較。金標(biāo)準(zhǔn)是以膀胱鏡檢查或經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切術(shù)病理診斷結(jié)果為準(zhǔn)。繪制受試者工作特征曲線(receiver operating characteristic curve，ROC)，以尿脫落細(xì)胞學(xué)SHGUC 且病理結(jié)果診斷為UC 的患者作為實(shí)驗(yàn)組，以尿脫落細(xì)胞學(xué)結(jié)果是NHGUC且病理結(jié)果中未見腫瘤的患者為對(duì)照組，使用R語(yǔ)言中的pROC、ROCit 包分別計(jì)算出個(gè)截點(diǎn)上FGFR3S249C 突變對(duì)于診斷UC 的靈敏度和特異度，繪制出ROC曲線；曲線下的面積在0.5和1之間，AUC越接近于1，說明診斷效果越好，AUC在0.5～0.7時(shí)有較低準(zhǔn)確性，AUC在0.7～0.9時(shí)有一定準(zhǔn)確性，AUC 在0.9 以上時(shí)有較高準(zhǔn)確性。作圖使用GraphPad Prism 9.0.2。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 一般臨床資料

符合納入和排除標(biāo)準(zhǔn)且ddPCR下機(jī)數(shù)據(jù)可納入分析(總微滴數(shù)大于10000)的樣本例數(shù)共27例UC。男性19 例，女性8 例；年齡范圍36～77 歲，年齡中位數(shù)64歲。按照尿液細(xì)胞學(xué)巴黎報(bào)告系統(tǒng)(the Paris system for reporting urinary cytology，TPS)將納入的27例患者分為16 例高級(jí)別尿路上皮癌(high-grade urothelial carcinoma，HGUC)，8 例可疑高級(jí)別尿路上皮癌(suspicious for high-grade urothelial carcinoma，SHGUC)，3 例未見高級(jí)別尿路上皮癌(negative for high-grade urothelial carcinoma，NHGUC)。27例UC 患者中26例患者接受了手術(shù)治療，其組織病理結(jié)果按照2016年《WHO 泌尿系統(tǒng)及男性生殖器官腫瘤分類》標(biāo)準(zhǔn)(第4版)進(jìn)行分類，高級(jí)別UC 19 例，低級(jí)別UC 5 例，未見腫瘤2 例，未做手術(shù)1 例。按照2017年第8 版美國(guó)癌癥分期聯(lián)合委員會(huì)(AJCC)制訂的TNM分期系統(tǒng)進(jìn)行分期：3 例Ta，2 例T0，8 例T1，5 例T2，7 例T3，2例無T分期；浸潤(rùn)性UC 19例，非浸潤(rùn)性UC 4例。

2.2 尿cfDNA中FGFR3 S249C突變情況

采用ddPCR檢測(cè)尿cfDNA中FGFR3S249C突變情況，結(jié)果見表1。從納入研究的UC患者尿液中提取的DNA 濃度最低為0.348 ng/μL，通過ddPCR 可檢測(cè)到該濃度樣本的突變拷貝數(shù)MAF 值為39.6%，說明本研究中ddPCR 可檢測(cè)到cfDNA 濃度低樣本的突變基因。SHGUC組cfDNA中位濃度為17.05 ng/μL，高于HGUC組中的中位濃度16.65 ng/μL；HGUC 組cfDNA 濃度整體相比于SHGUC 組有上升趨勢(shì)；NHGUC 組中cfDNA中位濃度均低于HGUC 和SHGUC 組。SHGUC 組中MAF 中位值為0.24%，高于HGUC 組中的中位MAF 值0.01%。

表1 各尿脫落細(xì)胞學(xué)不同分級(jí)中尿cfDNA 濃度和ddPCR 檢測(cè)后的MAF值[M(P25，P75)]

通過ddPCR 檢測(cè)方法在患者尿cfDNA 中檢測(cè)到的微滴熒光信號(hào)以二維熒光增量圖的形式展示，在陰、陽(yáng)性液滴可以做最佳區(qū)分的位置上設(shè)定陰、陽(yáng)性截?cái)嘀?，從而得出樣本野生型拷貝?shù)和突變型拷貝數(shù)，結(jié)果見圖1。

2.3 FGFR3 S249C在不同尿脫落細(xì)胞學(xué)和病理分型中的突變率分析結(jié)果

27 例UC 患者尿cfDNA 樣本中有7 例為FGFR3S249C 突變陽(yáng)性，檢出率為25.9%(7/27)。在T 分期的T1 中FGFR3S249C 突變率為37.5%(3/8)。按病理結(jié)果分類FGFR3S249C 在高級(jí)別中突變率為26.3%(5/19)，低級(jí)別中為40.0%(2/5)，未見腫瘤類型中為0(0/2)。按尿脫落細(xì)胞結(jié)果分類FGFR3S249C在HGUC中突變率為18.8%(3/16)，SHGUC中為50%(4/8)，NHGUC中為0(0/3)。在浸潤(rùn)性UC中FGFR3S249C的突變率為31.6%(6/19)，在非浸潤(rùn)性UC 中其突變率為25%(1/4)。見表2。

表2 FGFR3突變與臨床病理相關(guān)指標(biāo)的關(guān)系[例數(shù)(百分比)]

FGFR3S249C 在病理分級(jí)及細(xì)胞學(xué)均為高級(jí)別UC 的樣本中突變率為23.1%(3/13)，在病理分級(jí)為高級(jí)別UC、細(xì)胞學(xué)為可疑高級(jí)別UC 的樣本中突變率為40%(2/5)，在病理分級(jí)為低級(jí)別UC、細(xì)胞學(xué)為可疑高級(jí)別UC的樣本中突變率為66.7%(2/3)。見圖2。

圖2 按病理分類概述ddPCR檢測(cè)FGFR3 S249C的突變結(jié)果

2.4 ddPCR 檢測(cè)FGFR3 突變對(duì)尿脫落細(xì)胞學(xué)SHGUC的診斷效能

8例尿脫落細(xì)胞學(xué)診斷為SHGUC的樣本其病理均診斷為UC，使用ddPCR 檢測(cè)這8 例SHGUC 中FGFR3S249C 突變陽(yáng)性的樣本可提高50%(4/8)的UC 檢出率。在SHGUC 樣本中使用ddPCR 檢測(cè)FGFR3S249C 突變，繪制ROC 并進(jìn)行分析，結(jié)果顯示AUC=0.781，95% CI(0.407，1.000)；靈敏度為62.5%，特異度為100%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值100%，陰性預(yù)測(cè)值40%，約登指數(shù)0.625。證明使用ddPCR 檢測(cè)FGFR3S249C 可輔助尿脫落細(xì)胞學(xué)提高對(duì)UC的診斷效能。見表3和圖3。

表3 尿脫落細(xì)胞學(xué)檢測(cè)結(jié)果為SHGUC的患者FGFR3突變情況與臨床資料

圖3 FGFR3突變預(yù)測(cè)UC的診斷效能

3 討論

尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查是診斷UC 特異度高的非侵入性檢測(cè)方式，但其靈敏度較低且細(xì)胞學(xué)結(jié)果為可疑的患者會(huì)有被漏診的風(fēng)險(xiǎn)。ddPCR 對(duì)于體液活檢中像cfDNA 這類DNA 含量少的樣本具有高靈敏度和特異度，且理論上ddPCR 可檢測(cè)出突變頻率遠(yuǎn)低于1%的基因[21]。本研究中使用ddPCR 可檢測(cè)出cfDNA 濃度0.348 ng/μL 樣本中的突變拷貝數(shù)且MAF 值為39.6%，這進(jìn)一步體現(xiàn)ddPCR對(duì)于樣本中DNA含量少所具有的檢出效能。Montalbo 等[15]采用多重PCR 與SNapShot 的方法聯(lián)用檢測(cè)FGFR3基因突變，在29 例細(xì)胞學(xué)診斷為非典型尿路上皮癌的樣本中僅有1 例為FGFR3S249C 突變，其檢出率較低。SNaPshot 雖然可以快速分析大量的SNP位點(diǎn)，但因?yàn)镾NapShot靈敏度低存在假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果的風(fēng)險(xiǎn)；而ddPCR 相比于SNaPshot 靈敏度更高，可以減少這種風(fēng)險(xiǎn)并提供更精準(zhǔn)的檢測(cè)結(jié)果[22]。在實(shí)驗(yàn)方法上SNapShot的DNA上樣量需要5 ng，與此相比之下，進(jìn)行ddPCR檢測(cè)時(shí)DNA上樣量?jī)H需1 ng也可有效擴(kuò)增出DNA片段[23]。故在本研究中應(yīng)用高靈敏度和特異度的ddPCR 檢測(cè)UC 患者中FGFR3S249C 突變情況，旨在輔助提高對(duì)于UC 的檢出率。

本研究中ddPCR 反應(yīng)后進(jìn)行數(shù)據(jù)分析將MAF＞0.1%且陽(yáng)性微滴數(shù)＞3 的樣本定義為FGFR3突變陽(yáng)性，該突變對(duì)于UC 的檢出率為25.9%(7/27)。Hayashi等[20]研究者利用ddPCR 方法從153 名患者(含56 名UTUC 患者)尿上清中提取cfDNA 檢測(cè)TERT和FGFR3熱突變位點(diǎn)，UTUC患者cfDNA中TERTC228T突變率為39.3%，TERTC250T 突變率為7.1%，F(xiàn)GFR3S249C 突變率為16.1%，結(jié)合細(xì)胞學(xué)檢測(cè)結(jié)果計(jì)算出其特異度和靈敏度分別是96.0%和78.6%。已被FDA批準(zhǔn)用于檢測(cè)膀胱癌的診斷工具UroVysion、NMP22等可作為非侵入性方式預(yù)測(cè)膀胱癌。目前有研究表明，尿脫落細(xì)胞學(xué)結(jié)合尿液cfDNA 診斷膀胱癌敏感性(77.5%)要高于尿脫落細(xì)胞學(xué)結(jié)合UroVysion(67.5%)[19]。這進(jìn)一步說明我們的結(jié)果與以往研究有一致性的同時(shí)，F(xiàn)GFR3S249C 突變對(duì)于UC 的診斷效能有一定臨床應(yīng)用價(jià)值。本研究結(jié)果的重要之處是對(duì)于尿脫落細(xì)胞學(xué)診斷不明確但病理結(jié)果為UC 的樣本中，F(xiàn)GFR3S249C突變檢測(cè)可以提高UC檢出率且具有一定的診斷效能。

本研究從尿液中提取cfDNA 濃度在各尿脫落細(xì)胞學(xué)HGUC 和SHGUC 中濃度都有升高的趨勢(shì)，且在HGUC 組和SHGUC 組中MAF 值均較高。尤其在SHGUC 組中當(dāng)不明確是否是高級(jí)別UC 時(shí)，F(xiàn)GFR3S249C 突變陽(yáng)性可輔助診斷SHGUC 以提高UC 診斷效能。SHGUC 中FGFR3S249C突變對(duì)UC 檢出率為50%[AUC=0.781，95% CI(0.407，1.000)]，這提示在尿cfDNA中使用ddPCR檢測(cè)FGFR3S249C的突變對(duì)診斷UC有一定的輔助作用。由于尿cfDNA提取并對(duì)其進(jìn)行ddPCR 檢測(cè)存在一定的技術(shù)難度，導(dǎo)致可納入到本研究的合格樣本數(shù)量較少，所以該研究結(jié)論還需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量來進(jìn)行驗(yàn)證。

綜上所述，使用ddPCR 檢測(cè)尿cfDNA 中FGFR3S249C 突變作為一種非侵入性的檢測(cè)方式可以輔助提高尿脫落細(xì)胞學(xué)診斷不明確樣本的診斷效能。該方法將在臨床上對(duì)于提高UC的早期篩查能力，輔助UC患者術(shù)前診斷、術(shù)后復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè)及預(yù)后判斷上提供一定的參考依據(jù)。