唐 嬌，譚劍斌，茅莉娜，張紫虹，李文立，胡帥爾，趙 敏，

(1．廣東省公共衛(wèi)生研究院健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估研究室，廣東 廣州 511430；2．廣東省疾病預(yù)防控制中心衛(wèi)生毒理所，廣東 廣州 511430；3．廣東省生物制品與藥物研究所藥理研究室，廣東 廣州 510440)

雙酚S 化學(xué)名稱為4, 4′-磺?；椒?4,4′-sulfonyldiphenol，BPS)，是雙酚A 的結(jié)構(gòu)類似物。毒理學(xué)研究和人群流行病學(xué)調(diào)查證明雙酚A具有雌激素作用，對(duì)生殖系統(tǒng)、肝臟具有一定損傷作用[1]，被禁止用于食品包裝材料[2-3]，雙酚S 由于具有耐熱、耐光、抗氧化等性能而成為雙酚A最普遍的替代物用于食品包裝材料[4]。然而，近年研究發(fā)現(xiàn)，在油脂、酸性或外界環(huán)境的影響下，包裝材料中的雙酚S 極易遷移至食品中，導(dǎo)致人體生物樣本中雙酚S 的檢出率逐年上升，人群暴露水平呈遞增趨勢(shì)[5]。雙酚S的安全性及人群暴露風(fēng)險(xiǎn)受到越來越多的關(guān)注。秀麗隱桿線蟲由于遺傳背景清晰，與人類基因同源性高，符合國(guó)際要求的“3R”原則等多種優(yōu)點(diǎn)，成為評(píng)價(jià)食品毒理效應(yīng)及機(jī)制探討的理想模式生物[6]。因此，本實(shí)驗(yàn)以秀麗隱桿線蟲為研究對(duì)象，探討雙酚S 對(duì)線蟲精子生成相關(guān)基因表達(dá)的影響，為雙酚S 的安全性研究資料提供有益補(bǔ)充。

1 材料與方法

1.1 主要材料和儀器設(shè)備

雙酚S(CAS：80-09-1)購(gòu)自阿拉丁公司，純度99%；秀麗隱桿線蟲N2 野生型、大腸桿菌OP50由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理學(xué)教研室惠贈(zèng)；Trizol 試劑、cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green半定量PCR試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；CFX96 Touch 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time， qPCR) 儀(Bio-Rad，美國(guó))；生化培養(yǎng)箱(ZHUJIANG LRH-250A)購(gòu)于廣東泰宏君公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱(DHP-9052)購(gòu)于中儀國(guó)科(北京)科技有限公司；渦旋振蕩器(IKA，德國(guó))；高速離心機(jī)(Thermo Fisher Scientific，美國(guó))；體視顯微鏡(Nikon SMZ745，日本)；細(xì)胞組織破碎儀(Bullet Blender Gold，Next Advance，美國(guó))。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 劑量設(shè)計(jì) 將雙酚S 溶解于二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)中，根據(jù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)配置濃度分別為5000、2000、200、20、2 μmol/L的雙酚S溶液，溶液中DMSO的終濃度全部為0.2%，進(jìn)行急性毒性試驗(yàn)，求得半數(shù)致死濃度(lethal concentration 50%，LC50)后，以1/1000、1/100 和1/10 的LC50濃度分別為約3、30 和300 μmol/L 進(jìn)行子代數(shù)目和精子生成相關(guān)基因表達(dá)的測(cè)定試驗(yàn)。

1.2.2 秀麗隱桿線蟲同步化 用S緩沖液將體內(nèi)含有大量蟲卵的成蟲從線蟲生長(zhǎng)培養(yǎng)基(nematode growth medium，NGM)沖洗至15 mL 離心管中，反復(fù)沖洗兩次以洗去線蟲身上的大腸桿菌OP50，棄上清，將配置好的堿性裂解液(4%的NaClO、2 mol/L 的NaOH、滅菌水體積比為1∶1∶1)按線蟲體積等比例加入離心管中，邊振蕩邊觀察，至蟲體全部裂解，離心去上清，將蟲卵用S緩沖液反復(fù)沖洗3次，取100 μL沉淀接種到涂布有大腸桿菌OP50的NGM培養(yǎng)基上，放入20 ℃生化培養(yǎng)箱過夜得到L1 期線蟲，繼續(xù)培養(yǎng)約48 h，得到L4期線蟲。

1.2.3 急性毒性試驗(yàn) 在96 孔板上加入不同濃度雙酚S 溶液200 μL，每個(gè)濃度設(shè)3 個(gè)平行孔，然后用挑針在每孔中加入約40 條L4 期線蟲，記錄受試蟲數(shù)(n總)。染毒24 h，用顯微鏡觀察每孔線蟲狀態(tài)，記錄線蟲死亡數(shù)目(n24h)。線蟲死亡的判斷標(biāo)準(zhǔn)：咽泵停止運(yùn)動(dòng)，用鉑絲多次觸碰蟲體無反應(yīng)。

死亡率(%)=n24h/n總×100%。

1.2.4 子代數(shù)目的測(cè)定 挑取同步化培養(yǎng)至L4 期的雌雄同體線蟲到涂布有不同濃度雙酚S的NGM培養(yǎng)基上，進(jìn)行24 h暴露。暴露結(jié)束后，在每個(gè)平板中挑取1只待測(cè)的線蟲，放入20 ℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)。在產(chǎn)卵期內(nèi)每天將線蟲轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的平板上，含有蟲卵的舊平板繼續(xù)放置在20 ℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，然后對(duì)每個(gè)平板上的線蟲數(shù)目進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，待線蟲排卵期結(jié)束，將每個(gè)平板線蟲數(shù)目相加，計(jì)算每條線蟲總的子代數(shù)目。

1.2.5 精子生成相關(guān)基因測(cè)定 使用qPCR 檢測(cè)精子生成相關(guān)基因的表達(dá)。將同步化培養(yǎng)至L4期線蟲分別在涂布有不同濃度雙酚S的NGM培養(yǎng)基上，進(jìn)行24 h暴露后，采用Trizol 法提取線蟲的總RNA，然后逆轉(zhuǎn)錄成cDNA進(jìn)行qPCR。引物根據(jù)線蟲數(shù)據(jù)庫(kù)的序列以及美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心進(jìn)行設(shè)計(jì)，具體引物序列見表1。反應(yīng)體系為：SYBR Green qPCR Mix(2×，High ROX) 10 μL，上、下游引物(3 μmol/L)各1 μL，去離子水7 μL，cDNA 1 μL，組成20 μL 反應(yīng)體系。擴(kuò)增步驟為：95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃、15 s，60 ℃退火30 s，采集熒光信號(hào)，40 個(gè)循環(huán)，72 ℃、30 s延伸，act-1作為參考基因，使用2-ΔΔCT法分析比較akt-1、swm-1、try-5、spe-4、spe-6基因的mRNA相對(duì)表達(dá)水平。

表1 精子生成相關(guān)基因的引物序列(5′-3′)

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，采用SPSS 18.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，急性毒性試驗(yàn)采用概率分析(probit analysis-Spearman)，計(jì)算線蟲雙酚S 染毒24 h 后的LC50；計(jì)量資料用xˉ±s表示，采用單因素方差分析，兩兩比較選擇Dunnett-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 雙酚S對(duì)秀麗隱桿線蟲的急性毒性試驗(yàn)

經(jīng)24 h暴露得到不同濃度雙酚S對(duì)秀麗線蟲的致死數(shù)據(jù)，如表2 所示。利用SPSS 軟件中的PROBIT 模塊進(jìn)行計(jì)算，根據(jù)3 次毒性試驗(yàn)結(jié)果，取3 次平均死亡率進(jìn)行分析，可得到雙酚S 暴露24 h 的LC50為2773.672 μmol/L，故后續(xù)以1/1000、1/100 和1/10的LC50濃度分別為約3、30 和300 μmol/L 進(jìn)行子代數(shù)目和精子生成相關(guān)基因表達(dá)的測(cè)定。

表2 雙酚S經(jīng)24 h暴露后秀麗隱桿線蟲死亡率

2.2 雙酚S 暴露24 h 對(duì)秀麗隱桿線蟲子代數(shù)目的影響

3、30 和300 μmol/L 雙酚S 作用24 h 后秀麗隱桿線蟲子代數(shù)目分別為197.6±32.4、184.5±39.5和180.4±42.9，與陰性對(duì)照組的(226.1±34.6)相比，各劑量組子代數(shù)目均明顯下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05 或0.01)。

2.3 雙酚S 暴露24 h 對(duì)秀麗隱桿線蟲精子生成相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響

將數(shù)值標(biāo)準(zhǔn)化，陰性對(duì)照組的基因表達(dá)水平定義為1。如表3所示，與陰性對(duì)照組相比，當(dāng)雙酚S濃度為3 μmol/L 時(shí)，akt-1基因mRNA 表達(dá)水平上調(diào)(P＜0.05)；當(dāng)雙酚S 濃度為30、300 μmol/L 時(shí)，swm-1、try-5、spe-4、spe-6基因的mRNA 表達(dá)水平上調(diào)(P＜0.05或0.01)。

表3 不同濃度雙酚S暴露24 h后秀麗隱桿線蟲精子生成相關(guān)基因mRNA的相對(duì)表達(dá)水平

3 討論

雙酚S 由于成為雙酚A 的替代物在食品包裝中廣泛使用，使其安全性得到廣泛關(guān)注。目前研究表明，雙酚S 具有內(nèi)分泌干擾活性、遺傳毒性，對(duì)哺乳動(dòng)物及斑馬魚有生殖毒性和發(fā)育毒性[7-8]。生殖毒性方面，文獻(xiàn)報(bào)道雙酚S 可以通過氧化應(yīng)激途徑介導(dǎo)生精細(xì)胞凋亡和類固醇激素合成障礙，從而導(dǎo)致生殖系統(tǒng)功能障礙[9]。本文以秀麗隱桿線蟲作為模式生物，研究雙酚S對(duì)精子生成相關(guān)基因的影響。

本研究經(jīng)過急性暴露試驗(yàn)得到雙酚S 的LC50為2773.672 μmol/L(換算后為694 mg/L)，與之前文獻(xiàn)報(bào)道的545.59 mg/L在一個(gè)數(shù)量級(jí)[10]。在評(píng)價(jià)生殖能力方面，子代數(shù)目是N2 野生型秀麗隱桿線蟲的經(jīng)典指標(biāo)，主要考察的是秀麗隱桿線蟲的繁殖能力。本研究表明雙酚S 在3、30、300 μmol/L 劑量時(shí)均可引起子代數(shù)目降低，并與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。之前也有文獻(xiàn)報(bào)道當(dāng)雙酚S劑量為0.01 μmol/L時(shí)，秀麗隱桿線蟲的子代數(shù)目顯著降低[10-11]，提示雙酚S暴露后可能導(dǎo)致秀麗隱桿線蟲的生殖細(xì)胞受損而引起繁殖能力下降。生殖細(xì)胞生成精細(xì)胞，精細(xì)胞成為有活力可以受精的精子，這些過程受多種信號(hào)通路的調(diào)控。在觀察影響的基因時(shí)，本文選取了精子發(fā)生相關(guān)基因akt-1和精子形成相關(guān)基因swm-1、try-5、spe-4、spe-6[12]。因?yàn)閍kt-1屬于Insulin/IGF通路，該通路是精子發(fā)生過程中關(guān)鍵的調(diào)控通路之一[13]。實(shí)驗(yàn)表明盡管線蟲暴露在3 μmol/L 雙酚S 時(shí)，可以使akt-1 mRNA的表達(dá)量增加(P＜0.05)，但隨著雙酚S 劑量的增加，mRNA 的表達(dá)量開始下調(diào)，但與對(duì)照組相比差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明雙酚S 對(duì)秀麗隱桿線蟲的精子生成影響并不是通過基因akt-1的表達(dá)進(jìn)而影響Insulin/IGF通路導(dǎo)致的，在后續(xù)試驗(yàn)中還需要驗(yàn)證該通路中的其他受體基因，進(jìn)一步確定雙酚S 是否介導(dǎo)該通路而影響精子發(fā)生引起子代數(shù)目降低。swm-1 信號(hào)通路是調(diào)節(jié)精子形成過程的關(guān)鍵通路之一[14-15]；try-5 使秀麗隱桿線蟲的精子在合適的時(shí)間活化[16]；spe-6是類酪蛋白激酶1 蛋白，在精子發(fā)生過程中影響精細(xì)胞的分裂，精子形成的發(fā)動(dòng)需要下調(diào)spe-6 蛋白的表達(dá)，同時(shí)也在精子活化方面發(fā)揮作用[17-19]；spe-4可以抑制精子的活化[20]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，雙酚S 暴露后精子形成相關(guān)基因swm-1、try-5、spe-4、spe-6 表達(dá)量均上升，導(dǎo)致精子活化異常，從而導(dǎo)致生殖能力降低。在后期研究中，將利用雄性突變體秀麗隱桿線蟲進(jìn)一步驗(yàn)證。