常波

摘 要：建立了一種QuEChERS-固相萃取-液質(zhì)聯(lián)用法測定水產(chǎn)品中氯霉素的方法。經(jīng)測試此方法氯霉素在0.2～10.0 ng·mL-1時，線性關(guān)系良好，r2為0.999，3個添加水平的平均回收率在100%～115%，精密度為3.6%～10.0%。該方法具有操作簡單、結(jié)果準(zhǔn)確、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，適用于批量水產(chǎn)品中氯霉素殘留量的篩查。

關(guān)鍵詞：氯霉素；殘留量；水產(chǎn)品

Using QuEChERS-UPLC-MS/MS for Rapid Determination of Chloramphenicol in Aquatic Products

CHANG Bo

（Yingkou Agricultural and Rural Comprehensive Development Service Center （Yingkou Agricultural Product Quality Safety Inspection and Monitoring Center）， Yingkou 115004， China）

Abstract： In this paper， a method for the determination of chloramphenicol in aquatic products by QuEChERS-solid phase extraction-liquid mass spectrometry was developed. The chloramphenicol had a good linearity in the range of 0.2～10.0 ng·mL-1， r2 was 0.999， the average recovery rates were between 100%～115% at three additive levels， and the precision rates were between 3.6%～10.0%. This method is not complicated， high precision and high sensitivity， and is suitable for rapid screening of chloramphenicol residue in bulk aquatic products.

Keywords： chloramphenicol; residue; aquatic products

氯霉素類（Chloramphenicol，CAP）是一種人工合成的廣譜抗生素，價格便宜、抑菌性強(qiáng)、體內(nèi)吸收良好，被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)動物的疾病防控[1]。這些藥物一般較穩(wěn)定，不易降解，在水產(chǎn)品中殘留可通過食物鏈進(jìn)入人體，氯霉素能引起人的再生障礙性貧血、粒狀白細(xì)胞缺乏癥、新生兒灰色綜合征等疾病，尤其是氯霉素的低濃度藥物殘留會誘發(fā)致病菌的耐藥性[2]。氯霉素的殘留不但對人體造成危害，還會嚴(yán)重影響我國動物性食品的出口。我國在水產(chǎn)品養(yǎng)殖過程中禁止添加或使用氯霉素，2019年農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布了動物食品中禁止使用的藥品及其他化合物清單，規(guī)定在動物食品中不得檢出氯霉素[3]。

目前的標(biāo)準(zhǔn)前處理方法需要反復(fù)提取和氮吹濃縮吹干，前處理時間長，難以滿足批量水產(chǎn)品中氯霉素殘留量的快速篩查。QuEChERS是由美國化學(xué)家Lehotay和德國的Anastassiadas于2003年提出的一種快速（Quick）、簡便（Easy）、便宜（Cheap）、有效（Effective）、可靠（Rugged）及安全（Safe）的樣品處理技術(shù)[4-6]，最早在農(nóng)藥多殘留中使用。因此本方法采用Simle-QuEchERS Nano-Ant快速測定水產(chǎn)品中的氯霉素殘留量。這樣操作既簡單快速，又能保證檢測的準(zhǔn)確性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鯉魚，購買于營口市某農(nóng)貿(mào)市場；氯霉素（CAP，99.8%）、氯霉素氘代物（CAP-D5，100 μg·mL-1），購自MedJen；甲醇、乙腈（色譜純，德國Meker公司）；QuEChERS-SPE抗生素凈化小柱含鹽包4.0 g無水硫酸鎂（MgSO4），1.0 g氯化鈉，陶瓷均質(zhì)子（LUMTECH）；試驗(yàn)用水均為超純水。

Aglient超高效液相色譜-質(zhì)譜三重四極桿聯(lián)用儀6460（配有EI離子源）；分析天平（感量0.01 g、0.00 001 g，瑞士Mettle Toledo公司）；渦旋振蕩器（德國Heidolph）；1 000 μL移液槍（德國艾本德）；冷凍離心機(jī)（美國Thermo Fisher Scientific）；全自動氮吹濃縮儀N1（上海屹堯Preekem）；Milli-Q Advamtage超純水器（美國Millipore）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品前處理

稱取勻漿樣品5.0 g（準(zhǔn)確至±0.02 g），加CAP-D5內(nèi)標(biāo)工作液250 μL，于50 mL具塞離心管中；加入4.0 mL超純水和10 mL乙腈，渦旋5 min，加入4.0 g無水硫酸鎂（MgSO4），1.0 g氯化鈉（NaCl）及一顆陶瓷均質(zhì)子，渦旋1 min；4 ℃下離心，10 000 r·min-1，5 min；取一支Simle-QuEchERS Nano-Ant抗生素凈化柱垂直塞入50 mL具塞離心管中，緩慢下壓凈化柱頂部，上層清液隨壓力，自下而上進(jìn)入凈化柱儲液槽內(nèi)；使用移液槍至凈化柱儲液槽內(nèi)，吸取2 mL上清液于40 ℃水浴中氮?dú)獯抵两桑? mL流動相定容；過0.22 μm有機(jī)微孔濾膜至進(jìn)樣瓶，LC-MS/MS待測定。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

用乙腈將氯霉素配制成10 ng·mL-1、50 ng·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)中間液和將氘代氯霉素配制成20 ng·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)中間作液。分別精確量取10 ng·mL-1 標(biāo)準(zhǔn)液0.050 mL、0.100 mL和50 ng·mL-1標(biāo)準(zhǔn)液0.040 mL、0.100 mL、0.200 mL，再分別加入0.250 mL濃度為20 ng·mL-1的氘代氯霉素內(nèi)標(biāo)溶液，用20%的乙腈溶液稀釋成氯霉素濃度為0.5 ng·mL-1、1.0 ng·mL-1、2.0 ng·mL-1、5.0 ng·mL-1和 10.0 ng·mL-1、內(nèi)標(biāo)CAP-D5濃度為5.0 ng·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液，供液相色譜法-串聯(lián)質(zhì)譜法測定。以測得特征離子質(zhì)量色譜峰外標(biāo)和內(nèi)標(biāo)峰面積比為縱坐標(biāo)、對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。求回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

1.2.3 儀器條件

（1）色譜條件。色譜柱：Agilent Poroshell?120 EC-C18柱（100 mm×3.0 mm，2.7 μm）；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20 μL；流速：0.35 mL·min-1；流動相為乙腈-水進(jìn)行梯度洗脫見表1。

（2）質(zhì)譜MS條件。負(fù)離子電噴霧ESI-多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式；掃描方式：負(fù)離子；毛細(xì)管電壓：4 000 V；霧化氣壓力（GSI）：40 psi；氣流溫度：350 ℃；鞘氣流速：9 L·min-1。氯霉素的MRM模式定性定量分析參數(shù)見表2。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理優(yōu)化

本方法考察了水產(chǎn)品前處理中加入甲醇、乙腈對氯霉素類藥物的提取率的影響[7]，乙腈可避免提取脂肪，同時又能沉淀蛋白質(zhì)，可提高氯霉素提取率，因此本方法采用加入超純水和乙腈進(jìn)行提取，再加入鹽包（4.0 g無水硫酸鎂，1.0 g氯化鈉）進(jìn)行鹽析除蛋白和脫水，脫水會減少氮吹時間，提升檢測效率，用Simle-QuEchERS Nano-Ant抗生素凈化柱進(jìn)行凈化，代替正己烷除脂和通常用的SPE小柱凈化，此QuEchERS小柱操作步驟快速簡單，免去繁雜的提取步驟，節(jié)省前處理時間。

2.2 工作曲線線性范圍

以氯霉素濃度為橫坐標(biāo)，以氯霉素峰面積與CAP-D5峰面積比值為縱坐標(biāo)，得到其線性方程為y=0.988 640x-0.017 632（R2=0.999），氯霉素在0.5～10 ng·mL-1時，線性關(guān)系良好?？瞻柞庺~肉中添加1.0 μg·kg-1氯霉素和CAP-D5 MRM色譜圖見圖1。

2.3 方法回收率和精密度

在5.0 g空白鯉魚肉中添加3個低、中、高的濃度水平標(biāo)準(zhǔn)溶液，添加濃度分別為10 ng·mL-1氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1 mL，50 ng·mL-1氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1 mL，0.5 μg·mL-1氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1 mL，20 ng·mL-1 CAP-D5標(biāo)準(zhǔn)中間液250 μL，添加濃度水平分別為0.2 μg·kg-1、1.0 μg·kg-1、10.0 μg·kg-1，添加的CAP-D5濃度為5.0 ng·mL-1，每個添加水平做6個平行，按照1.2.1前處理的方法進(jìn)行處理，測定氯霉素峰響應(yīng)值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（Relative Standard Deviation，RSD），計算方法的回收率和精密度。由表3知，3個添加水平的平均回收率為100%～115%，精密度為3.6%～10.0%，滿足測定要求。

3 結(jié)論

對氯霉素的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行優(yōu)化，用水和乙腈進(jìn)行提取，Simle-QuEchERS Nano-Ant抗生素凈化柱進(jìn)行凈化，代替標(biāo)準(zhǔn)中乙腈和乙酸乙酯反復(fù)提取和正己烷除脂，減少前處理的時間，提升檢測效率。并加入CAP-D5作為內(nèi)標(biāo)進(jìn)行檢測，一定程度上消除了操作條件等的變化所引起的誤差。此QuEChERS方法操作簡單、靈敏度高、結(jié)果準(zhǔn)確，并且回收率和精密度滿足測定要求，適合大批量水產(chǎn)品中氯霉素的殘留量篩查。

參考文獻(xiàn)

[1]楊洪波，王荻，盧彤巖.氯霉素類藥物的藥理學(xué)在水產(chǎn)動物中的研究現(xiàn)狀[J].水產(chǎn)學(xué)雜志，2013，26（4）：61-64.

[2]孫偉紅，劉歡，邢麗紅，等.水產(chǎn)品獸藥殘留檢測技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)解析及能力驗(yàn)證工作探討[J].中國漁業(yè)質(zhì)量與標(biāo)準(zhǔn)，2017，7（2）：11-18.

[3]中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部.中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第250號[EB/OL].（2019-12-27）[2022-08-11].http：//www.moa.gov.cn/nybgb/2020/202002/202004/t20200414_6341556.htm.

[4]KLINSUNTHORN N，PETSOM A，NHUJAK T.Determination of steroids adulterated in liquid herbal medicines using QuEChERS sample preparation and high-performance liquid chromatography[J].Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis： An International Journal on All Drug-Related Topics in Pharmaceutical， Biomedical and Clinical Analysis，2011，55（5）：1175-l178．

[5]AGUILERA-LUIZ M M，VIDAL J L，ROMERO-GONZALEZ R，et al.Multi-residue determination of veterinary drugs in milk by ultra-high-pressure liquid chromatography–tandem mass spectrometry[J].Journal of Chromatography A，2008，1205（1-2）：10-16．

[6]STUBBINGS G，BIGWOOD T.The development and validation of a multiclass liquid chromatography tandem mass spectrometry （LC–MS/MS） procedure for the determination of veterinary drug residues in animal tissue using a QuEChERS （Quick， Easy， Cheap， Effective， Rugged and Safe） ap[J].Analytica Chimica Acta，2009，637（1-2）：68-78．

[7]高何剛.氯霉素殘留的液相色譜質(zhì)譜檢測方法的樣品前處理研究進(jìn)展[J].廣州化工，2017，44（8）：204-205.