龍清吟 傅馨瑩 李菀榆 李俊熙 劉競澤 李艷軍 譚維 胡聰 張偉

〔摘要〕 目的 基于基因芯片數(shù)據(jù)庫（GEO）、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，結(jié)合ox-LDL誘導(dǎo)的大鼠主動脈血管內(nèi)皮細胞氧化損傷模型進行實驗驗證，探究補陽還五湯（Buyang Huanwu Decoction， BYHWD）干預(yù)動脈粥樣硬化（atherosclerosis， AS）氧化應(yīng)激的作用及相關(guān)機制。方法 通過TCMSP、Herb數(shù)據(jù)庫收集BYHWD中7味中藥有效成分及靶點；從GEO數(shù)據(jù)庫下載GSE19286、GSE2372數(shù)據(jù)集，鑒定AS差異表達基因（differentially expressed genes， DEGs）；通過GeneCards數(shù)據(jù)庫獲取氧化應(yīng)激靶點；取交集篩選出BYHWD、DEGs、氧化應(yīng)激共同靶點，進行PPI、GO和KEGG通路富集分析；在GSE19286、GSE2372的表達矩陣中，采用獨立樣本t檢驗進行核心靶點驗證。結(jié)合GEO數(shù)據(jù)庫和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果進行體外實驗驗證，檢測藥物對細胞活性氧表達及ALB、PLG、F2、GC、PLK1基因表達的影響。結(jié)果 篩選出972個中藥靶點、9438個氧化應(yīng)激靶點、173個DEGs，其中103個DEGs在AS組織樣本中高表達、70個DEGs在AS組織樣本中低表達；綜合中藥作用靶點、AS DEGs和氧化應(yīng)激靶點，得到24個“AS潛在靶點”，進行GO和KEGG富集分析，結(jié)果提示“AS潛在靶點”主要通過調(diào)控細胞周期信號通路，卵母細胞成熟信號通路和細胞減數(shù)分裂信號通路等信號通路發(fā)揮作用。根據(jù)Degree算法對“AS潛在靶點”進行拓撲分析，鑒定出前5位“AS核心靶點”，據(jù)統(tǒng)計分析提示BYHWD可能可以通過上調(diào)ALB、PLG、F2、GC的表達、下調(diào)PLK1的表達起到干預(yù)AS氧化應(yīng)激的作用。體外實驗結(jié)果顯示，BYHWD能抑制ox-LDL引起的活性氧（reactive oxygen species， ROS）增高；qPCR結(jié)果顯示，ox-LDL刺激后的大鼠主動脈內(nèi)皮細胞ALB、PLG、F2、GC基因表達均下降，PLK1基因表達上升，BYHWD含藥血清干預(yù)后可以上調(diào)ALB、PLG、F2、GC基因的表達（P<0.01；P<0.05），下調(diào)PLK1的表達（P<0.05）。

結(jié)論 BYHWD干預(yù)AS氧化應(yīng)激具有多成分、多靶點、多途徑的作用特點，其機制可能與減少ROS表達，上調(diào)ALB、PLG、F2、GC基因、下調(diào)PLK1基因表達相關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕 補陽還五湯；動脈粥樣硬化；氧化應(yīng)激；基因芯片；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)；分子對接

〔中圖分類號〕R285.5 ? ? ? 〔文獻標志碼〕A ? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０23.04.016

Bioanalysis and experimental study of Buyang Huanwu Decoction against oxidative

stress in atherosclerosis

LONG Qingyin， FU Xinying， LI Wanyu， LI Junxi， LIU Jingze， LI Yanjun， TAN Wei， HU Cong， ZHANG Wei*

College of Integrated Chinese and Western Medicine， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To investigate the interventions of Buyang Huanwu Decoction （BYHWD） on atherosclerosis （AS） oxidative stress and its related mechanism using Gene Expression Omnibus （GEO） and network pharmacology， combined with the rat aortic vascular endothelial cell oxidative damage model induced by ox-LDL. Methods The active components and targets of 7 Chinese medicines in BYHWD were collected by TCMSP and Herb. GSE19286 and GSE2372 data sets were downloaded from GEO to identify AS differentially expressed genes （DEGs）. The oxidative stress （OS） targets were obtained from GeneCards database. The common targets of BYHWD， DEGs and OS were selected by intersection to analyze the enrichment of PPI， GO and KEGG pathways. In the expression matrix of GSE19286 and GSE2372， the core target was verified by independent sample t-test. The effects of drugs on the expression of reactive oxygen species and the expression of ALB， PLG， F2， GC and PLK1 genes were tested in vitro combined with GEO and network pharmacological results. Results The total of 972 TCM targets， 9438 OS targets， and 173 DEGs were screened. Among them， 103 DEGs were highly expressed and 70 DEGs were lowly expressed in AS tissue samples. By combining the BYHWD targets， ASDEGS and OS targets， 24 "AS potential targets" were obtained for GO and KEGG enrichment analysis. The results suggested that "AS potential targets" mainly play a role by regulating cell cycle， oocyte maturation and cell meiosis signaling pathways. According to the topological analysis of "AS potential target" based on Degree algorithm， the five "AS core targets" were identified. According to statistical analysis， BYHWD may interfere with AS OS by up-regulating the expression of ALB， PLG， F2， GC and down-regulating the expression of PLK1. The results of vitro experiment showed that BYHWD could inhibit the increase of reactive oxygen species （ROS） induced by ox-LDL. The qPCR results showed that the expression of ALB， PLG， F2 and GC gene decreased and the expression of PLK1 gene increased in rat aortic endothelial cells stimulated by ox-LDL. BYHWD-containing serum could up-regulate the expression of ALB， PLG， F2 and GC （P<0.01， P<0.05） and down-regulate the expression of PLK1 （P<0.05）. Conclusion BYHWD has the characteristics of multi-component， multi-target and multi-pathway in the intervention of atherosclerotic OS， and its mechanism may be related to the decrease of ROS expression， up-regulation of ALB， PLG， F2， GC gene and down-regulation of PLK1 gene expression.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 Buyang Huanwu Decoction; atherosclerosis; oxidative stress; gene chip; network pharmacology; molecular docking

《中國心血管健康與疾病報告》指出，2019年我國農(nóng)村、城市心血管疾病分別占總死亡因素的46.74%和44.26%，每5例死亡中就有2例死于心血管疾病，在我國心血管疾病的發(fā)病率與致死率仍高居榜首[1]。動脈粥樣硬化（atherosclerosis， AS）是最常見的心血管疾病之一，有著發(fā)病緩慢、病程長的特點，以血管內(nèi)皮細胞（vascular endothelial cells， VECs）發(fā)生功能障礙為疾病起點，血管屏障功能受損使得炎性因子、血小板黏附因子、單核細胞及脂質(zhì)等向VECs下遷移與沉積，同時引起胞內(nèi)氧化-抗氧化系統(tǒng)失衡產(chǎn)生過多的活性氧（reactive oxygen species， ROS），隨著沉積的低密度脂蛋白（low-density lipoprotein， LDL）被修飾成氧化型低密度脂蛋白（oxidized low-density lipoprotein， ox-LDL），繼而被巨噬細胞或平滑肌細胞吞噬，形成泡沫細胞，在綜合交互作用下，最終導(dǎo)致動脈粥樣斑塊的形成[2-3]。由此可見，血管內(nèi)皮細胞的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激是AS的重要起始環(huán)節(jié)。

雖然AS疾病本身并不致命，但隨著斑塊不斷形成，可能使動脈管腔內(nèi)血流量減少50%以上[4]，繼而伴隨著血栓形成，疊加在破裂或侵蝕的AS斑塊上，就可能導(dǎo)致更嚴重的甚至危及生命的臨床事件，如心絞痛、冠狀動脈血栓、中風(fēng)、心肌梗死等。《動脈粥樣硬化中西醫(yī)結(jié)合診療專家共識2021》指出[5]，根據(jù)AS臨床上出現(xiàn)的主要癥狀，中醫(yī)學(xué)可將其歸為“眩暈”“頭痛”“癡呆”“中風(fēng)”“胸痹”“真心痛”“脈痹”“脈積”范疇，可分為痰瘀互結(jié)、痰熱互結(jié)、氣陰兩虛、氣滯血瘀4個主要證型。補陽還五湯作為經(jīng)典方劑用于心血管疾病的治療。有研究表明，補陽還五湯具有調(diào)控AS氧化應(yīng)激水平的作用[6-7]，但中藥復(fù)方化學(xué)成分復(fù)雜，補陽還五湯是如何協(xié)同多成分、多靶點、多途徑干預(yù)AS氧化應(yīng)激的，仍需進一步探討。

因此，為進一步研究補陽還五湯干預(yù)AS氧化應(yīng)激的作用機制，本研究結(jié)合GEO基因芯片數(shù)據(jù)庫、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，篩選補陽還五湯治療AS氧化應(yīng)激的核心靶點，通過原代血管內(nèi)皮細胞氧化應(yīng)激損傷等實驗進行核心靶點驗證，以觀察補陽還五湯對AS氧化應(yīng)激損傷的改善作用。

1 材料與方法

1.1 ?生物信息學(xué)研究

1.1.1 ?補陽還五湯靶點的獲取 ?通過TCMSP數(shù)據(jù)庫（https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php），以藥物口服生物利用度（oral bioavailability， OB）≥30%，化合物類藥性（drug likeness， DL）≥0.18為篩選條件，獲取補陽還五湯中赤芍、川芎、當歸、黃芪、桃仁、紅花6味中藥的活性成分。通過Herb（http：//herb.ac.cn/）數(shù)據(jù)庫，獲取補陽還五湯中地龍的中藥活性成分。綜合TCMSP、Herb庫中結(jié)果，將補陽還五湯中共7味中藥的活性成分導(dǎo)入PubChem數(shù)據(jù)庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）獲取其SMILES號或活性成分化學(xué)結(jié)構(gòu)式[8]。將SMILES號或活性成分化學(xué)結(jié)構(gòu)式導(dǎo)入Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫（http：//www.swisstargetprediction.ch/）獲取中藥藥物靶點。

1.1.2 ?AS差異基因的獲取 ?通過GEO數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/），以Atherosclerosis為檢索詞，獲取GSE19286、GSE2372芯片。以芯片中樣本的表達矩陣作為驗證集，將芯片中GSM44658、GSM44659、GSM478610、GSM478611樣本設(shè)為正常組（Normal組），GSM44660、GSM44661、GSM478606、GSM478607樣本設(shè)為AS模型組（Model組）。通過R語言limma包分析，并以|log2FC|＞1且P.adj＜0.05為篩選條件對樣本表達矩陣進行差異分析，獲取AS差異表達基因（differentially expressed genes， DEGs）。去除一個探針對應(yīng)多個基因的探針，同時保留多個探針對應(yīng)一個基因的最大探針。并通過R語言ggplot2包繪制DEGs火山圖、R語言ComplexHeatmap包前30位DEGs熱圖[9]。

1.1.3 ?氧化應(yīng)激靶點的獲取 ?以“oxidative stress”作為檢索詞，在GeneCards[10]數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org/）中獲取氧化應(yīng)激靶點。

1.1.4 ?補陽還五湯抗AS氧化應(yīng)激潛在靶點韋恩圖的構(gòu)建 ?將補陽還五湯靶點（drug）、AS差異表達基因（DEGs）、氧化應(yīng)激靶點（oxidative stress）取交集，采用R語言ggplot2包繪制補陽還五湯抗AS氧化應(yīng)激潛在靶點（AS潛在靶點）韋恩圖。

1.1.5 ?GO功能富集分析和KEGG通路富集分析 ?通過DAVID數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/），選擇“Homo sapiens”物種，獲取“AS潛在靶點”的GO、KEGG數(shù)據(jù)。采用R語言gglopt包根據(jù)-log P值繪制前5位GO、KEGG柱狀圖、前5位KEGG氣泡圖、前5位KEGG靶點通路圖。

1.1.6 ?蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction， PPI）網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建及拓撲分析 ?通過STRING數(shù)據(jù)庫（https：//cn.string-db.org/），導(dǎo)入“AS潛在靶點”選擇“Homo sapiens”物種，導(dǎo)出PPI網(wǎng)絡(luò)圖信息。采用Cytoscape 3.7.2對PPI蛋白網(wǎng)絡(luò)圖進行可視化。并利用CytoHubba工具根據(jù)Degree值算法鑒定出前5位“AS核心靶點”，對其進行拓撲分析。

1.1.7 ?“AS核心靶點”統(tǒng)計學(xué)分析 ?獲取“AS核心靶點”在GSE19286、GSE2372芯片中Normal組樣本與Model組樣本的表達矩陣信息，采用R語言對表達矩陣進行獨立樣本t檢驗以驗證其在AS中的差異表達情況并繪制差異分組比較圖。

1.2 ?實驗驗證

1.2.1 ?藥物 ?補陽還五湯由黃芪60 g、赤芍9 g、川芎6 g、當歸9 g、地龍9 g、紅花9 g、桃仁9 g 組成，購自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院左亞杰教授鑒定。阿托伐他汀片（批號H20133127，10 mg/片）購自浙江樂普藥業(yè)股份有限公司。

1.2.2 ?動物 ?SPF級雄性SD大鼠，體質(zhì)量180～200 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物合格證號：SCXK（湘）2019-0004。

1.2.3 ?主要試劑 ?DMEM/F12培養(yǎng)基、特級胎牛血清（批號：PM150210、164210-500）購自武漢普諾賽生命科技有限公司；CCK8試劑盒（批號：BS350B）購自上海白鯊生物科技有限公司；ox-LDL（批號：YB-002）購自廣州奕源生物科技有限公司；RNA提取試劑盒（批號：DP419）購自北京天根生化科技有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號：E047）和SYBR qPCR SuperMix Plus（批號：E096-01A）購自上海近岸科技有限公司。

1.2.4 ?主要儀器 ?CO2培養(yǎng)箱（德國Heraeus公司）；SW-CJ-1FD超凈工作臺（蘇州蘇凈儀器自控設(shè)備有限公司）；Cytation 3型多功能酶標儀（美國Bio-Tek公司）；Heraeus Fresco 17 型超速冷凍離心機（美國 Thermo Fisher Scientific 公司）。

1.2.5 ?含藥血清 ?采用隨機數(shù)表法，將SD大鼠隨機分為對照組、補陽還五湯組、阿托伐他汀組，每組5只。含藥血清的提取方法及灌胃劑量參考課題組前期方法及研究[11]。藥物組灌胃補陽還五湯10.8 g/（kg·d），阿托伐他汀0.9 mg/（kg·d），對照組灌胃等體積生理鹽水1 mL/（100 g·d），2次/d，連續(xù)7次。于末次給藥2 h后，10%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，麻醉后暴露腹主動脈取血，取血后脫頸處死。4 ℃靜置2 h后，全血3000 r/min離心15 min，取上層血清，分別得到空白血清、補陽還五湯血清及阿托伐他汀血清，于水浴鍋56 ℃滅活30 min，濾過分裝，于-80 ℃保存。

1.2.6 ?大鼠主動脈內(nèi)皮細胞提取 ?主動脈內(nèi)皮細胞提取參照消化壓片法[12]?？焖俅蜷_大鼠胸腹腔，分離出主動脈，置于含有PBS（含1%青鏈雙抗）的6 cm直徑單孔培養(yǎng)皿中，輕輕去除血管外周脂肪、結(jié)締組織。剪開血管，使得血管內(nèi)膜暴露在外。漂洗3次去除殘留的血細胞，吸棄多余PBS。加入2 g/LⅠ型膠原酶2 mL，37 ℃消化1 min后棄去，加入適量含血清培養(yǎng)基終止消化。將主動脈剪成1 mm左右長度的血管段（20～25段），轉(zhuǎn)移至用10 g/L明膠預(yù)先包被好的6孔板中央，每孔4～5段。用滅菌的蓋玻片蓋在血管段上方，輕輕下壓，每孔加入2 mL大鼠主動脈內(nèi)皮細胞完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.2.7 ?大鼠主動脈內(nèi)皮細胞鑒定 ?取第3代近融合VECs，細胞爬片后1% BSA封閉30 min，大鼠來源的vWF一抗4 ℃過夜后，用FITC標記的熒光二抗室溫孵育1 h，于激光共聚焦下進行免疫熒光鑒定。

1.2.8 ?血管內(nèi)皮細胞損傷模型的建立 ?取處于對數(shù)生長期的主動脈血管內(nèi)皮細胞，以1×105/孔接種于96孔板，待細胞貼壁。設(shè)置對照組和ox-LDL（25、50、75、100 g/mL）組，各給藥組加入相應(yīng)溶液，對照組加入含10% FBS 的DMEM/F12培養(yǎng)基，分別培養(yǎng)6、12、24 h，加入CCK8試劑，于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱孵育40 min，采用酶標儀測定450 nm處的吸光度（A）值，計算細胞抑制率。

1.2.9 ?細胞活性氧（reactive oxygen species， ROS）檢測藥物抗損傷情況 ?細胞造膜和給藥后，加入熒光探針H2DCF-DA（1∶1000）檢測ROS濃度，培養(yǎng)40 min后，細胞內(nèi)的活性氧可以氧化無熒光的DCFH生成有熒光的DCF，于熒光顯微鏡下拍照，采用Image J測定熒光值。

1.2.10 ?qPCR法檢測相關(guān)mRNA表達 ?提取細胞總RNA，微量核酸蛋白檢測儀檢測RNA樣品的濃度和純度，再進行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，采用SYBR法進行實時PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系（25 μL體系）：SYBR

Green qPCR Mix 12.5 μL，10 μmol/L正反引物2.5 μL，cDNA 1 μL，nuclease-free water 6.5 μL。每個樣品設(shè)3個孔，反應(yīng)在實時定量PCR儀上進行。以GAPDH為內(nèi)參基因，采用2-△△Ct法計算基因相對表達量。引物由武漢賽維爾生物科技有限公司合成，序列見表1。平行實驗3次。

1.2.11 ?統(tǒng)計學(xué)分析 ?所有統(tǒng)計分析均使用SPSS 23.0軟件進行，計量資料以“ｘ±s”表示，組間比較若符合正態(tài)性且方差齊性時，采用單因素方差分析LSD法進行兩兩比較；方差不齊時，采用Tamhane's T2法進行兩兩比較。

2 結(jié)果

2.1 ?補陽還五湯靶點的獲取

綜合TCMSP、Herb數(shù)據(jù)庫結(jié)果，獲取黃芪活性成分31個，包括formononetin（芒柄花素）、hederagenin（蛇床子素）、isoflavanone（異黃酮）等；當歸活性成分39個，包括beta-sitosterol（β谷甾醇）、stigmasterol（豆甾醇）、carvacrol（香芹酚）等；赤芍活性成分2個，包括baicalein（黃芩素）、ethyl oleate（油酸乙酯）；川芎活性成分15個，包括myricanone（楊梅酮）、crysophanol（大黃酚）等；桃仁活性成分20個，包括beta-sitosterol（β谷甾醇）、campesterol（樟腦甾醇）、hederagenin（蛇床子素）等；紅花活性成分14個，包括6-hydroxykaempferol（6-羥基山柰酚）、baicalein（黃芩素）、beta-carotene（β-胡蘿卜素）等；地龍活性成分12個，包括palmitic acid（棕櫚酸）、succinic acid（琥珀酸）、vanillin（香蘭素）等。

綜合PubChem、Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫結(jié)果，共獲取赤芍153個靶點（剔除10個重復(fù)值）、川芎521個靶點（剔除804個重復(fù)值）、當歸591個靶點（剔除1188個重復(fù)值）、黃芪504個靶點（剔除1196個重復(fù)值）、桃仁393個靶點（剔除539個重復(fù)值）、紅花336個靶點（剔除664個重復(fù)值）、地龍281個靶點（剔除503個重復(fù)值），把這7味中藥靶點進行綜合匹對，去除重復(fù)靶點后得到972個作用靶點。

2.2 ?AS差異基因的獲取

聯(lián)合GSE19286、GSE2372芯片對其樣本矩陣進行差異分析并以|log2FC|＞1且P.adj＜0.05為篩選條件繪制火山圖（圖1A），共篩選出173個DEGs，其中103個DEGs在AS組織樣本中高表達（log2FC＞1），70個DEGs在AS組織樣本中低表達（log2FC＞1）。根據(jù)|log2FC|排序繪制前40位差異基因熱圖以查看其在各樣本中的表達情況（圖1B，表2）。

2.3 ?氧化應(yīng)激靶點的獲取

GeneCards數(shù)據(jù)庫共獲取9438個氧化應(yīng)激靶點，根據(jù)預(yù)測分數(shù)大小排序前10位氧化應(yīng)激靶點依次為NOS3、NOS2、CPT2、NOS1、SOD1、CAT、AIFM1、TNF、TP53、NFE2L2。

2.4 ?補陽還五湯干預(yù)AS氧化應(yīng)激潛在靶點韋恩圖

取972個“中藥靶點”、173個“AS差異基因”、9438個“氧化應(yīng)激靶點”的交集繪制韋恩圖，獲取“AS潛在靶點”共24個，分別為CDK1、CCNB2、PGR、PLG、ALB、CHEK1、SELE、AMPD1、LGMN、PTGS2、MMP12、FABP1、LGALS4、CHRNA7、CCR9、DBF4、TTR、GRM5、TOP2A、GC、F2、PLK1、C3AR1、VCAM1（圖2A）。

2.5 ?GO、KEGG富集化分析結(jié)果

“AS潛在靶點”共獲取389條GO分析條目，包括328條生物過程（biological process， BP）條目、44條細胞組分（cellular component， CC）條目、17條分子功能（molecular function， MF）條目，KEGG分析共獲取14條KEGG（通路）條目。結(jié)果顯示，“AS潛在靶點”主要參與對β淀粉樣蛋白的反應(yīng)、核分裂核膜解體、膜解體等生物進程、富集于血液微粒、質(zhì)膜筏、空泡腔等細胞組分，參與毒性物質(zhì)結(jié)合、抗氧化活性、組蛋白激酶活性等分子功能（圖2B）。KEGG結(jié)果顯示，“AS潛在靶點”主要通過調(diào)控CDK1、CHEK1、PLK1、CCNB2、DBF4CDK1、CHEK1、PLK1、CCNB2、DBF4介導(dǎo)的細胞周期信號通路，CDK1、PGR、PLK1、CCNB2介導(dǎo)的卵母細胞成熟信號通路，CDK1、PGR、PLK1、CCNB2介導(dǎo)的卵母細胞減數(shù)分裂信號通路等信號通路發(fā)揮作用（圖2C、圖2D）。

2.6 ?PPI網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建及拓撲分析

STRING數(shù)據(jù)庫剔除2個無互作關(guān)系的靶點，分別為CCR9、AMPD1，保留22個AS潛在靶點的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖（圖3A）。

根據(jù)Degree算法對“AS潛在靶點”進行拓撲分析，鑒定出前5位“AS核心靶點”。根據(jù)Degree值排序前5位“AS核心靶點”依次為白蛋白（ALB）、纖溶酶原（PLG）、F2-異前列烷（F2）、Polo激酶1（PLK1）、糖皮質(zhì)激素（GC）（圖3B、表3），提示其可作為補陽還五湯干預(yù)AS氧化應(yīng)激的核心靶點。

2.7 ?“AS核心靶點”統(tǒng)計學(xué)分析

差異分組比較圖結(jié)果顯示（圖4），ALB、PLG、F2、GC在模型組中表達均低于正常組（P＜0.01、P＜0.001），PLK1在模型組中表達高于正常組（P＜0.01），提示補陽還五湯可能可以通過上調(diào)ALB、PLG、F2、GC的表達、下調(diào)PLK1的表達起到干預(yù)AS氧化應(yīng)激的作用。

2.8 ?大鼠主動脈內(nèi)皮細胞鑒定

如圖5所示，用免疫熒光法鑒定顯示，細胞均表達內(nèi)皮細胞特有的vWF蛋白。因此，證明所提取細胞為內(nèi)皮細胞。

2.9 ?不同濃度ox-LDL對血管內(nèi)皮細胞損傷的影響

與對照組比較，不同濃度ox-LDL（25、50、75、100 μg/mL）均可顯著降低主動脈血管內(nèi)皮細胞6、12、24 h 的活力（P＜0.01），抑制細胞增殖，且以ox-LDL 50 μg/mL干預(yù)血管內(nèi)皮細胞24 h作為細胞損傷的最佳條件。詳見圖6。

2.10 ?補陽還五湯對損傷細胞ROS表達的影響 ?與對照組比較，模型組熒光強度顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，補陽還五湯組ROS降低（P＜0.01）。詳見圖7。

2.11 ?補陽還五湯對ALB、PLG、F2、PLK1、GC基因表達的影響

與對照組相比，模型組ALB、PLG、F2、GC mRNA表達明顯降低（P＜0.01，P＜0.05），PLK1 mRNA表達明顯升高（P＜0.05）。與模型組比較，補陽還五湯組ALB、PLG、F2、GC mRNA表達水平增加，PLK1 mRNA表達水平降低（P＜0.01，P＜0.05）。詳見圖8。

3 討論

在過去的幾十年中，隨著基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)等技術(shù)的發(fā)展，大量的芯片和測序數(shù)據(jù)為人類疾病研究提供了豐富的資源。我們利用GEO數(shù)據(jù)庫下載GSE19286、GSE2372基因表達數(shù)據(jù)集，在AS樣本和健康樣本之間鑒別差異表達基因（DEGs）。共獲得173個DEGs可能與AS的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，其中上調(diào)基因103個、下調(diào)基因70個，可能成為AS的潛在治療靶點。

根據(jù)《動脈粥樣硬化中西醫(yī)結(jié)合診療專家共識2021》，中醫(yī)學(xué)認為AS的病機包括虛實兩個方面：虛主要指氣虛、血虛、陰虛、陽虛；實為瘀血、痰濁、毒邪、濕熱。對于氣虛血瘀證型，《素問·至真要大論》云：“疏其氣血，令其調(diào)達，而致和平?！惫十斠砸鏆饣钛ㄖ沃?。補陽還五湯出自清代王清任《醫(yī)林改錯》，在大補其氣的同時適量配伍活血之藥，補氣固本，活血治標，以達通開血道，氣通血活。西醫(yī)學(xué)認為AS的發(fā)病機制主要包括脂質(zhì)浸潤學(xué)說、內(nèi)皮損傷-反應(yīng)學(xué)說、血小板聚集和血栓形成假說、平滑肌細胞克隆學(xué)說等。而氧化應(yīng)激是由自由基在體內(nèi)產(chǎn)生的一種負面作用，與炎癥緊密相連，參與疾病發(fā)展并加速AS病變。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，補陽還五湯具有抗AS炎癥反應(yīng)、抗腦缺血、抗血栓、抗血管內(nèi)膜增生等作用[13-16]。體外實驗結(jié)果顯示，補陽還五湯可以減少ox-LDL損傷的血管內(nèi)皮細胞中ROS的表達，可能通過干預(yù)血管內(nèi)皮氧化損傷改善AS氧化應(yīng)激，但BYHWD是如何協(xié)同多成分、多靶點、多途徑干預(yù)AS氧化應(yīng)激的，仍需進一步探討。

通過將篩選出的972個中藥活性成分靶點與AS疾病發(fā)生發(fā)展相關(guān)的173個DEGs和9438個氧化應(yīng)激靶點取交集，共獲得24個補陽還五湯干預(yù)AS氧化應(yīng)激的潛在的共同靶點，即“AS核心靶點”。使用拓撲分析篩選出ALB、PLG、F2、PLK1、GC為前5位的“AS核心靶點”。其中，血漿中的ALB被證明是抵抗ROS的第一道防線，在抗氧化功能中起著關(guān)鍵作用[17]；PLG屬于纖溶系統(tǒng)成分之一，在病理狀態(tài)下，PLG激活受阻，凝血-纖溶系統(tǒng)的平衡破壞，易導(dǎo)致血栓形成，在病理過程中隨著炎性因子和ROS的產(chǎn)生，進而加重氧化應(yīng)激損傷與炎癥反應(yīng)[18]；同時有研究表明，F(xiàn)2的量化是評估體內(nèi)氧化應(yīng)激可靠的生物標志物之一[19]；過氧化氫可能通過增加PLK1蛋白表達誘導(dǎo)PC12細胞氧化損傷[20]；GC具有強大的免疫調(diào)節(jié)活性，可誘導(dǎo)T和B淋巴細胞凋亡的能力，通過線粒體途徑誘導(dǎo)產(chǎn)生ROS介導(dǎo)氧化反應(yīng)[21]。已有許多研究表明，ALB、PLG、F2、PLK1、GC均與氧化應(yīng)激關(guān)系密切[22-26]，而這5個靶點對于AS氧化應(yīng)激的相關(guān)疾病發(fā)展的闡述與研究尚不足。補陽還五湯可能可以通過上調(diào)ALB、PLG、F2、GC基因表達，下調(diào)PLK1基因表達的作用機制干預(yù)血管內(nèi)皮細胞氧化損傷，從而改善AS氧化應(yīng)激，這也與本研究的網(wǎng)絡(luò)預(yù)測結(jié)果相符，進一步提示補陽還五湯在AS氧化應(yīng)激中的治療潛力。

綜上所述，本研究基于基因芯片數(shù)據(jù)庫、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和實驗驗證，對補陽還五湯治療AS氧化應(yīng)激的作用機制進行預(yù)測，其機制可能與減少ROS表達，上調(diào)ALB、PLG、F2、GC基因、下調(diào)PLK1基因表達相關(guān)，為下一步深入開展機制研究提供了基礎(chǔ)和方向。

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〔收稿日期〕2022-11-23

〔基金項目〕國家自然科學(xué)基金項目（82174218）；湖南省自然科學(xué)杰出青年基金項目（2020JJ2024）；湖南中醫(yī)藥大學(xué)中西結(jié)合一流學(xué)科開放基金項目（2020ZXYJH49）。

〔第一作者〕龍清吟，女，碩士研究生，研究方向：中西醫(yī)防治心腦血管疾病。

〔通信作者〕*張 ?偉，男，博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，E-mail：zhangwei1979@hnucm.edu.cn。