孫輝 劉翠玲 姚靜 何秋婷 謝月 梁奇

〔摘要〕 目的 探討葛根素（puerarin， PUE）在脂多糖（lipopolysaccharide， LPS）誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞中的抗炎作用，并揭示其分子機(jī)制。方法 采用CCK-8比色法分別設(shè)置不同濃度的LPS和PUE，觀察對RAW264.7細(xì)胞活性的影響，篩選出合適的LPS造模濃度及PUE的給藥濃度。將細(xì)胞分為正常對照組、模型組（1 μg/mL）、PUE給藥組（12.5、25、50 μmol/L）。Griess法檢測一氧化氮（nitric oxide， NO）釋放量；ELISA法檢測腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α， TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β， IL-1β）和白細(xì)胞介素-6（interleukin-6， IL-6）的含量；qRT-PCR法檢測環(huán)氧化酶-2（cyclooxygenase-2， COX-2） mRNA水平；Western blot法檢測誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase， iNOS）、COX-2、p-IκBα、p-p65蛋白表達(dá)水平。結(jié)果 與正常對照組比較，不同濃度的LPS誘導(dǎo)24 h，RAW264.7細(xì)胞存活率降低，但對細(xì)胞增殖無影響（P＞0.05），PUE在濃度100 μmol/L及以下時對RAW264.7細(xì)胞增殖也無影響（P＞0.05）；與模型組相比，PUE給藥組（12.5、25、50 μmol/L）NO、TNF-α、IL-1β及IL-6的釋放量顯著降低（P<0.01），COX-2的蛋白及mRNA表達(dá)水平顯著降低（P<0.05），iNOS、p-IκBα、p-p65的蛋白表達(dá)水平呈濃度依賴性降低（P<0.01）。結(jié)論 PUE的體外抗炎作用機(jī)制與抑制核因子κB（nuclear factor-κB， NF-κB）信號通路相關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕 葛根素；脂多糖；RAW264.7細(xì)胞；炎癥；一氧化氮；一氧化氮合酶；NF-κB信號通路

〔中圖分類號〕R285.5 ? ? ?〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A ? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０23.04.008

Anti-inflammatory effects and mechanisms of Puerarin on LPS-induced RAW264.7 macrophages

SUN Hui， LIU Cuiling， YAO Jing， HE Qiuting， XIE Yue， LIANG Qi*

Bao'an TCM Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine， Shenzhen， Guangdong 518101， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To explore the anti-inflammatory potential of Puerarin （PUE） in lipopolysaccharide （LPS）-induced RAW264.7 macrophages and reveal its potential molecular mechanisms. Methods The effects of different concentrations of LPS and PUE on the viability of RAW264.7 cells were determined by CCK-8 colorimetric method， and the appropriate LPS modeling concentration and PUE administration concentration were screened. Cells were divided into normal control group， model group （1 μg/mL）， and PUE administration group （12.5， 25， 50 μmol/L）; Griess assay was used to assess the nitric oxide （NO） concentration; tumor necrosis factor-α （TNF-α）， interleukin-1β （IL-1β） and interleukin-6 （IL-6） content was measured by ELISA; cyclooxygenase-2 （COX-2） mRNA levels were detected by qRT-PCR; the protein expression levels of inducible nitric oxide synthase （iNOS）， COX-2， p-IκBα， and p-p65 were determined by Western blot. Results Compared with the normal control group， the survival rate of RAW264.7 cells decreased after 24 h of LPS induction at different concentrations， and there was no effect on cell proliferation （P>0.05）， PUE has no significant cytotoxic effects at or below the concentrations of 100 μmol/L （P>0.05）; Compared with the model group， PUE administration group （12.5， 25， 50 μmol/L） displayed favorable inhibitory effects on the release level of NO， TNF-α， IL-1β and IL-6 （P<0.01）， and the protein and mRNA expression levels of COX-2 significantly decreased （P<0.05） in LPS-induced RAW264.7 cells， and it is the same for the expression levels of iNOS， p-IκBα， p-p65 （P<0.01）. Conclusion The anti-inflammation mechanisms of PUE is related with nuclear factor-κB （NF-κB） signaling pathway.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 puerarin; lipopolysaccharide; RAW264.7 cells; inflammation; nitric oxide; inducible nitric oxide synthase; NF-κB signaling pathway

炎癥是機(jī)體對有害刺激（如病原體、受損細(xì)胞或刺激物）的復(fù)雜生物反應(yīng)。炎癥反應(yīng)導(dǎo)致疼痛、發(fā)熱、瘙癢、紅脹，甚至誘發(fā)過敏、哮喘及腫瘤等[1-2]。炎癥介導(dǎo)的關(guān)鍵因子核因子κB（nuclear factor-κB， NF-κB）是Toll樣受體（Toll-like receptor， TLR）通路中的重要信號分子。這些因子的調(diào)節(jié)被廣泛認(rèn)為是抑制各種炎癥的良好策略。更具體地說，NF-κB是促炎基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的一個重要因素，如白細(xì)胞介素-6（interleukin-6， IL-6）、一氧化氮（nitric oxide， NO）誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase， iNOS）和環(huán)氧化酶-2（cyclooxygenase-2， COX-2），也是NF-κB激活所必需的[3-4]。因此，NF-κB活化與炎癥性疾病密切相關(guān)，針對NF-κB的抗炎藥物的開發(fā)備受關(guān)注。

中藥葛根是解表退熱的代表性藥物之一，廣泛應(yīng)用于治療臨床炎癥性疾病，如發(fā)熱[5]、疼痛[6-10]及類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎[11-12]等。葛根素（puerarin， PUE）是葛根的主要有效成分，雖然其抗炎活性已有報(bào)道[13]，但是PUE的抗炎活性所涉及的細(xì)胞機(jī)制仍有待闡明。本研究通過將PUE作用于脂多糖（lipopolysaccharide， LPS）誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞炎癥模型，研究PUE抗炎癥反應(yīng)的作用及機(jī)制，為其進(jìn)一步的開發(fā)及臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 ?細(xì)胞及藥品

小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞購自中國科學(xué)院武漢分院細(xì)胞庫。PUE（上海詩丹德標(biāo)準(zhǔn)服務(wù)技術(shù)有限公司，批號：110752-202013，純度≥98%）；LPS（美國Sigma-Aldrich公司，批號：#028M4094V）。

1.2 ?主要試劑

CCK-8試劑盒（北京蘭杰柯科技有限公司，批號：21266840）；胎牛血清（德國Nobimpex公司，批號：A115-500）；DMEM培養(yǎng)基、PierceTM BCA蛋白檢測試劑盒（上海賽默飛世爾科技公司，批號：8122524、WK342259）；UltraSYBR Mixture PCR試劑盒（北京康為世紀(jì)生物科技股份有限公司，批號：CW2601M）；cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（上海翌圣生物科技股份有限公司，批號：H8203980）；iNOS（上海Abcam公司，批號：ab178945）；COX-2（批號：37843）、p-IκBα（批號：2859S）、IκBα（批號：4814S）、p65（批號：8242S）及p-p65（批號：3033S）均購自美國Cell Signaling Technology公司。

1.3 ?主要儀器

CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱、高速冷凍離心機(jī)（上海賽默飛世爾科技有限公司，型號：371、Sorvall ST 16R）；蛋白電泳儀（上海伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司，型號：Bio-Rad 1658029）；化學(xué)發(fā)光熒光成像儀（上海天能科技有限公司，型號：5200Multi）；醫(yī)用低溫保存箱（青島海爾特種電器有限公司，型號：HYC-198S）；潔凈工作臺（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司，型號：SW-CJ-2FD）。

2 方法

2.1 ?細(xì)胞培養(yǎng)及傳代

RAW264.7細(xì)胞在37 ℃下于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM中培養(yǎng)，細(xì)胞在37 ℃、5% CO2空氣環(huán)境中生長。待細(xì)胞密度長至90%時進(jìn)行傳代，用細(xì)胞刮刀將貼壁細(xì)胞刮下，然后吹勻使細(xì)胞成單個懸浮狀態(tài)，再轉(zhuǎn)移至15 mL離心管，1000 r/min（離心半徑8 cm），離心5 min，棄上清液，加入新的培養(yǎng)基重懸，按照1∶3進(jìn)行接種。

2.2 ?細(xì)胞分組及細(xì)胞存活率檢測

取對數(shù)生長的細(xì)胞，按照1×106個/mL接種于6孔板，設(shè)置正常對照組、模型組（0.01、0.1、1、10 μg/mL）、PUE給藥組（7.5、12.5、25、50、100 μmol/L）。待細(xì)胞貼壁過夜，正常對照組加入新鮮培養(yǎng)基，PUE給藥組加入不同濃度PUE，每組設(shè)3個復(fù)孔，培養(yǎng)24 h；每孔加入20 μL CCK-8，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育4 h，用酶標(biāo)儀測定在450 nm處的吸光度（OD）值，計(jì)算細(xì)胞存活率。

2.3 ?細(xì)胞上清液中NO釋放量的檢測

取對數(shù)生長期的細(xì)胞，按照1×106個/mL接種于96孔板，設(shè)置正常對照組、模型組（1 μg/mL）、PUE給藥組（12.5、25、50 μmol/L），待細(xì)胞貼壁過夜，PUE給藥組加入PUE預(yù)處理0.5 h，除正常對照組，其余各組加入LPS（1 μg/mL）培養(yǎng)24 h。吸取各組細(xì)胞上清液50 μL，與Griess試劑混合，并在室溫下孵育15 min。使用NaNO2作為標(biāo)準(zhǔn)，在540 nm波長處測定NO濃度。

2.4 ?細(xì)胞上清液中炎性細(xì)胞因子的檢測

取對數(shù)生長期的細(xì)胞，按照1×106個/mL接種于6孔板，分組及處理同“2.3”，收集細(xì)胞上清液，按照ELISA試劑盒說明書定量檢測培養(yǎng)基中腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α， TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β， IL-1β）、IL-6的含量。

2.5 ?COX mRNA水平的檢測

細(xì)胞分組及給藥方法同“2.3”，收集細(xì)胞，使用TRIzol試劑提取總RNA，應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒制備cDNA。所有引物均由上海Invitrogen公司合成，使用Primer-BLAST（www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast）平臺設(shè)計(jì)COX-2、GAPDH引物序列（見表1）。使用RT-PCR試劑盒在羅氏LightCycler480實(shí)時系統(tǒng)（德國Roche Diagnostics公司）中進(jìn)行qRT-PCR分析。

2.6 ?iNOS、COX-2、NF-κB信號通路蛋白表達(dá)的檢測

細(xì)胞分組及給藥方法同“2.3”，待細(xì)胞貼壁過夜，各給藥組加入PUE預(yù)處理0.5 h，除正常對照組，其余各組加入LPS（1 μg/mL）培養(yǎng)30 min，收集細(xì)胞，加入含有磷酸酶抑制劑和蛋白酶抑制劑的裂解液冰浴裂解30 min，在4 ℃條件下12 753 r/min離心15 min，離心半徑8 cm；收集上清后，按照BCA蛋白定量試劑盒說明進(jìn)行蛋白定量，吸取部分蛋白液與5×蛋白質(zhì)上樣緩沖液混勻，97 ℃金屬浴煮5 min，通過10%的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis， SDS-PAGE）分離蛋白質(zhì)提取物，并轉(zhuǎn)移至PVDF膜。脫脂奶粉封閉2 h，再加入iNOS、COX-2、p-IκBα、IκBα、NF-κB/p65、p-p65抗體稀釋液，4 ℃孵育過夜。用TBST洗滌3次，并與在封閉溶液中稀釋的過氧化物酶偶聯(lián)的二抗在室溫下孵育2 h，洗滌后，使用ECL發(fā)光液檢測蛋白質(zhì)。

3 結(jié)果

3.1 ?LPS對RAW264.7細(xì)胞活性的影響

為了評估LPS對RAW264.7細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用，將細(xì)胞與不同濃度的LPS（0.01、0.1、1、10 μg/mL）孵育24 h。CCK-8結(jié)果顯示，與正常對照組比較，在24 h內(nèi)，LPS的濃度為0.01、0.1、1、10 μg/mL時，RAW264.7細(xì)胞存活率降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），說明各濃度下LPS對細(xì)胞無毒性或毒性不明顯。詳見表2。

3.2 ?PUE對RAW264.7細(xì)胞活性的影響

為了評估PUE對RAW264.7細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用，將細(xì)胞與不同濃度的PUE（7.5、12.5、25、50、100 μmol/L）孵育24 h。CCK-8結(jié)果顯示，與正常對照組比較，在24 h內(nèi)，PUE給藥組濃度為7.5、12.5、25、50、100 μmol/L時，RAW264.7細(xì)胞存活率逐漸降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），說明各濃度下PUE對細(xì)胞無毒性或毒性不明顯。詳見表3。最后，選擇12.5、25、50 μmol/L作為PUE的給藥濃度，用于進(jìn)一步研究。

3.3 ?LPS對RAW264.7細(xì)胞中炎癥因子表達(dá)的影響

與正常對照組比較，除模型組（0.01 μg/mL）外，其余3個濃度（0.1、1、10 μg/mL）均可明顯誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6（P＜0.05），并呈現(xiàn)一定的濃度依賴關(guān)系。但由于1 μg/mL和10 μg/mL濃度之間誘導(dǎo)炎癥因子水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），故選擇1 μg/mL的LPS作為造模濃度。詳見表4。

3.4 ?PUE對LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞中炎癥因子表達(dá)的影響

與正常對照組比較，模型組上清液中的TNF-α、IL-1β和IL-6水平明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，PUE給藥組上清液中TNF-α、IL-1β和IL-6的水平呈濃度依賴性降低（P＜0.05）。詳見表5。

3.5 ?PUE對LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞中NO和iNOS表達(dá)的影響

與正常對照組比較，模型組中NO的產(chǎn)生以及iNOS的表達(dá)明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，PUE給藥組LPS誘導(dǎo)的RAW264.7中NO的產(chǎn)生以及iNOS的蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05）。詳見表6、圖1。

3.6 ?PUE對LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞中COX-2表達(dá)的影響

與正常對照組比較，模型組中COX-2的mRNA和蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.05）；與模型組相比，PUE給藥組COX-2的mRNA和蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.05）。詳見圖2、表7。

3.7 ?PUE對NF-κB信號通路的影響

與正常對照組比較，模型組NF-κB信號通路中p-p65和p-IκBα表達(dá)明顯增加（P＜0.05）；與模型組相比，PUE給藥組p-p65和p-IκBα水平呈濃度依賴性降低（P＜0.05）。詳見圖3。

4 討論

炎癥是病原體、受損細(xì)胞或刺激物攻擊機(jī)體產(chǎn)生的基本防御機(jī)制。炎癥反應(yīng)有多種生理目的，如宿主防御、組織修復(fù)反應(yīng)和穩(wěn)態(tài)恢復(fù)。然而，這種反應(yīng)會產(chǎn)生病理后果，導(dǎo)致炎癥組織損傷、化生和穩(wěn)態(tài)設(shè)定點(diǎn)的改變。因此，機(jī)體需要對炎癥反應(yīng)進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)。一些有害刺激，如病原體、受損細(xì)胞或刺激物可刺激機(jī)體產(chǎn)生NO，但過量產(chǎn)生NO會在巨噬細(xì)胞中誘導(dǎo)慢性炎癥反應(yīng)[14]。慢性NO過量產(chǎn)生也涉及其他負(fù)面的細(xì)胞生理功能，如DNA損傷和誘變[15]。在本研究中，PUE抑制LPS刺激的RAW264.7細(xì)胞中NO的產(chǎn)生。其次，PUE還以劑量依賴的方式抑制LPS誘導(dǎo)的iNOS蛋白水平升高。這些結(jié)果表明，PUE可能是一種潛在的抗炎化學(xué)物質(zhì)。前列腺素（prostaglandin， PG）是來源于花生四烯酸的類脂化合物。NO、iNOS和PG維持體內(nèi)平衡功能并介導(dǎo)致病機(jī)制，包括炎癥反應(yīng)。由促炎刺激物、細(xì)胞因子、激素和生長因子誘導(dǎo)的COX-2是炎癥中PG形成的重要來源[16-18]。COX-2酶抑制劑被開發(fā)用于治療與關(guān)節(jié)炎相關(guān)的炎癥[19-20]和疼痛[21-22]。促炎細(xì)胞因子往往會通過誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生發(fā)熱、炎癥、組織破壞或全身炎癥使疾病惡化。IL-6是一種關(guān)鍵的炎癥細(xì)胞因子，在誘導(dǎo)下游炎癥反應(yīng)中起著重要作用。在這項(xiàng)研究中，我們發(fā)現(xiàn)PUE抑制LPS誘導(dǎo)的TNF-？琢、IL-1？茁和IL-6的上調(diào)。PUE處理以劑量依賴的方式減少LPS誘導(dǎo)的NO釋放。此外，PUE下調(diào)LPS誘導(dǎo)的iNOS、COX-2、p-IκBα、p-p65的表達(dá)。NF-κB可與κB的抑制劑IκBα結(jié)合，當(dāng)給予誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的刺激時，NF-κB被IκBα降解激活，并導(dǎo)致其易位到細(xì)胞核中，以促進(jìn)炎癥基因的表達(dá)，包括iNOS、COX-2和IL-6。

綜上所述，體外實(shí)驗(yàn)表明PUE可能是一種具有潛在抗炎作用的天然活性化合物，可以抑制炎癥因子的產(chǎn)生以及炎癥反應(yīng)，這種抑制作用可能與調(diào)控NF-κB信號通路密切相關(guān)。本研究結(jié)果可為PUE用于治療相關(guān)炎癥性疾病以及進(jìn)一步的研究利用提供科學(xué)參考。

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〔收稿日期〕2022-11-25

〔基金項(xiàng)目〕廣東省粵深青年聯(lián)合基金項(xiàng)目（2019A1515111192）。

〔第一作者〕孫 ?輝，男，碩士研究生，研究方向：中藥藥理研究。

〔通信作者〕*梁 ?奇，男，主任中藥師，E-mail：liangqi70@gzucm.edu.cn。