宋心怡，厲安洋，李艷梅，徐淑慧，夏乾峰，

（1.海南醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生與全健康國際學(xué)院，海南 ?？?571199；2.海南醫(yī)學(xué)院熱帶醫(yī)學(xué)院，海南 ?？?571199）

類鼻疽伯克霍爾德菌（burkholderia pseudomallei，B.pseudomallei）是一種兼性的細胞內(nèi)革蘭氏陰性桿菌，是類鼻疽（Melioidosis）的病原體［1］。B.pseudomallei多流行于熱帶，亞熱帶地區(qū)，特別是東南亞和北澳大利亞多見，我國的疫源地為海南、廣東、廣西、福建、臺灣等地，以海南省的發(fā)病率最高［2］。主要通過受污染的水源和土壤以及破損的皮膚入侵人體，病例以肺部感染和敗血癥為主，是本地居民或外來旅游人群感染的主要風(fēng)險，未經(jīng)治療的類鼻疽患者致死率可高達40%［3，4］。目前類鼻疽伯克霍爾德菌致病機理和宿主的免疫保護機制尚不完全清楚，且無有效疫苗［5］。

細菌小RNA（sRNA）是一類具有重要調(diào)控功能的非編碼RNA，一般長度在50～500 nt 之間，不編碼蛋白，通過與靶標基因 mRNA 堿基互補配對，在轉(zhuǎn)錄水平影響對基因的表達進行調(diào)節(jié)，與細菌的生長、代謝、應(yīng)激反應(yīng)和致病性等密切相關(guān)［6］。在前期工作中，課題組表達出促進sRNA 表達的分子伴侶蛋白Hfq，通過Hfq 蛋白為基礎(chǔ)的免疫共沉淀技術(shù)和RNA-seq 測序分析，發(fā)現(xiàn)并鑒定了9 種新的類鼻疽伯克霍爾德菌sRNA［7］。本研究選定了其中一種sRNA，位于HNBP001 的2 號染色體上sRNA 基因片段（Sequence ID：CP038806.1，556 924 bp～557 397 bp），暫將其命名為sRNA9，通過生物學(xué)實驗對該sRNA 在B.pseudomallei致病過程中的重要生物學(xué)功能和作用機制進行初步探索，為抗B.pseudomallei感染提供新的分子靶標，同時也對類鼻疽的防治和診斷提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要菌株、質(zhì)粒及細胞 類鼻疽伯克霍爾德菌野生株HNBP001 來源于課題組分離保存菌株［8］、質(zhì)粒TPR-pK18mobSacB 由課題組改造增加甲氧芐啶抗性片段，本實驗室保存［9］、大腸桿菌S17-λpair 感受態(tài)細胞、DH5ɑ 感受態(tài)細胞購于北京莊盟國際生物基因科技有限公司。

1.1.2 主要試劑和儀器 細菌基因組DNA 提取試劑盒、PCR 產(chǎn)物純化試劑盒、膠回收試劑盒及質(zhì)粒提取試劑盒，天根；限制性內(nèi)切酶（BamHⅠ、XbalⅠ、HindⅢ）和T4DNA 連接酶（Biolabs 公司）；甲氧芐啶、慶大霉素、卡那霉素，Biosharp；普通PCR 儀，Biorad；多功能酶標儀，Bioteck；凝膠成像分析系統(tǒng)，君意。

1.1.3 培養(yǎng)基 LB 固體培養(yǎng)基（g/L）：胰蛋白胨10 g、酵母5 g、氯化鈉10 g、瓊脂粉16 g；15%蔗糖固體培養(yǎng)基（g/L）：胰蛋白胨10 g、酵母5 g、蔗糖150 g、瓊脂粉16 g。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計 根據(jù)本實驗室上傳至NCBI 中類鼻疽伯克霍爾德菌HNBP001 的基因序列，針對編碼sRNA9 的上下游同源臂序列設(shè)計引物：9sF/9sR、9xF/9xR（圖A），用于擴增目的sRNA 的同源臂，R1/F1 引物用來驗證基因敲除株。所有引物均由生工生物工程公司合成，引物序列詳見表1。

表1 PCR 引物序列Tab 1 PCR primer sequence

1.2.2 載體構(gòu)建 提取HNBP001 的基因組，使用引物9sF/9sR、9xF/9xR 分別進行上、下游同源臂PCR 擴增，酶切后連接。以質(zhì)粒TPR-pK18mob-SacB 為模板，使用HindⅢ和BamHⅠ進行雙酶切，純化，酶切體系見表2。使用T4 連接酶對上、下游同源臂與質(zhì)粒的酶切產(chǎn)物于16 ℃連接數(shù)小時。將連接后產(chǎn)物加入DH5ɑ 感受態(tài)細胞，按照標準程序進行熱激轉(zhuǎn)化，涂布含抗生素的平板。培養(yǎng)12 h后，挑取單菌落于含抗生素的LB 液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜后使用Plasmid min kit 試劑盒進行質(zhì)粒提取，隨后將質(zhì)粒進行酶切驗證。

表2 酶切體系Tab 2 System of enzyme digestion

1.2.3 ΔsRNA9 敲除株的構(gòu)建與鑒定 取適量酶切驗證后的質(zhì)粒稀釋，轉(zhuǎn)化S17-1 感受態(tài)細胞，感受態(tài)細胞經(jīng)復(fù)蘇后，涂布抗生素LB 固體平板，培養(yǎng)12 h。挑取平板上的單菌落于含抗生素的LB 液體培養(yǎng)基，同時挑取HNBP001 的單菌落于無抗LB 培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜。轉(zhuǎn)化后S17-1 和HNBP001 菌液各取1 mL，離心取上清，取500 μL 培養(yǎng)基重懸沉淀物，取重懸后的菌液混勻滴加于濾膜上，培養(yǎng)數(shù)小時。吸取適量LB 液體培養(yǎng)基清洗菌體，稀釋不同濃度梯度（10-1、10-2）后涂布含抗生素的平板，培養(yǎng)36～48 h。挑取抗生素LB 固體平板上單菌落于含抗生素的LB 液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜。提取菌液基因組，PCR 驗證，獲得結(jié)合成功的菌液。將結(jié)合成功的菌液取50 μL 加入無抗LB 培養(yǎng)基中，培養(yǎng)過夜。將菌液稀釋涂布于LB 固體篩選培養(yǎng)基。挑取平板上單菌落，以引物R1/F1 驗證HNBP001 是否敲除成功，HNBP001 作為陽性對照，擴增純化后送測序，比對測序序列，將敲除成功的菌株暫命名為sRNA9。

1.2.4 生長曲線測定 提前一晚挑取野生株HNBP001 和敲除株sRNA9 的單菌落加入新鮮LB 培養(yǎng)基中，將細菌培養(yǎng)至生長對數(shù)期。將生長對數(shù)期的菌液稀釋至OD600=0.1，按照200 μL/孔的液體量加入96 孔板，每個樣本設(shè)置5 個重復(fù)，使用多功能酶標儀程序設(shè)置為37°C、雙軌道震蕩、間隔時間2 h，連續(xù)檢測72 h 在OD600的吸光度，保存實驗結(jié)果，重復(fù)3 次實驗，使用GraphPad 8.0.2 軟件繪制生長曲線。

1.2.5 細菌的泳動性實驗 配置3%的LB 軟瓊脂培養(yǎng)基，提前一晚準備好新鮮野生株HNBP001 和敲除株sRNA9 單菌落平板，挑取單菌落在LB 培養(yǎng)基中培養(yǎng)至生長對數(shù)期。將菌液稀釋至OD600=0.1，吸取2.5 μL 稀釋后菌液懸空滴至3%LB 軟瓊脂培養(yǎng)基，設(shè)置3 個重復(fù)，晾干10～15 min，放入37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，測量細菌抑菌圈的直徑。

1.2.6 生物被膜實驗 細菌培養(yǎng)方法同前，將野生株HNBP001、敲除株sRNA9 的菌液濃度調(diào)整至OD600=0.1，取5 mL 玻璃試管分別加入3 mL 稀釋后的HNBP001、sRNA9 菌液，設(shè)置3 個重復(fù)，將玻璃試管放入37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，觀察到明顯區(qū)別。移液器吸出玻璃管中菌液，1 × PBS 清洗殘余雜質(zhì)，加入4 mL 1%的結(jié)晶紫染色30 min。吸出結(jié)晶紫溶液，1 × PBS 再次清洗試管，加入3 mL 30% 乙酸反應(yīng)20 min，測OD595吸光度值。

1.2.7 藥敏實驗 使用珠海迪爾非發(fā)酵菌/氧化酶陽性革蘭氏陰性桿菌鑒定藥敏試劑板，嚴格按照說明書操作。提前準備好新鮮單菌落平板，挑取適宜大小單菌落加入稀釋液瓶內(nèi)研磨混勻制備成細菌懸液，吸取細菌懸液50 μL，加入M-H 肉湯培養(yǎng)基，混勻后加入抗菌藥物孔中，100 μL/孔，18 h 后判讀抗菌藥物MIC 測定結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

使用GraphPad 8.0.2 軟件進行繪圖及統(tǒng)計分析，運用Wilcoxon 符號秩檢驗對配對樣本進行差異性分析，運用Mann-WhitneyU檢驗對非配對樣本進行差異性分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 敲除株ΔsRNA9 的構(gòu)建及驗證

2.1.1 目的基因上下臂PCR 擴增結(jié)果 以HNBP001 的DNA 為模板，使用引物9sF/R、9xF/R 分別PCR 擴增上下臂片段，得到682 bp，793 bp 長度條帶，電泳結(jié)果見圖1。

圖1 目的基因PCR 擴增結(jié)果Fig 1 PCR amplification results of the up and down stream sequences of the target gene

2.1.2 重組載體TPR-pK18mobSacB-sRNA9 的酶切驗證 將sRNA9 上、下臂片段連接到質(zhì)粒TPR-pK18mobSacB 上，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5ɑ，涂布至含甲氧芐啶的平板，挑取單菌落提取質(zhì)粒后用HindⅢ、BamHⅠ雙酶切驗證，結(jié)果見圖2。

圖2 重組載體TPR-pK18mobSacB-sRNA9 的雙酶切驗證Fig 2 Verification of recombinant plasmid TPR-pK18mobSacB-sRNA9 by double enzyme digestion

2.1.3 類鼻疽伯克霍爾德菌sRNA9 敲除株的驗證 將 構(gòu) 建 好 的 重 組 質(zhì) 粒TPR-pK18mobSacB-sRNA9 轉(zhuǎn)化S17-1 感受態(tài)細胞，與HNBP001 進行雙交換，通過甲氧芐啶和慶大霉素雙抗板和15%蔗糖板進行篩選，若雙抗板不生長，15%蔗糖板生長，則挑取單菌落PCR 驗證，得到類鼻疽伯克霍爾德菌sRNA9 敲除株，并提取基因組送往測序公司進一步驗證。野生株HNBP001 和敲除株△sRNA9 使用驗證引物R1/F1 進行PCR 擴增，HNBP001 包含sRNA9敲除目的片段，擴增大小為2 227 bp，△sRNA9不含sRNA9敲除目的片段，擴增產(chǎn)物大小為1 753 bp，凝膠電泳結(jié)果見圖3，敲除株構(gòu)建成功。

圖3 sRNA9 敲除株驗證Fig 3 Validation of gene sRNA9 knock-out mutant

2.2 生長曲線

提前準備好單菌落平板，挑取單菌落過夜培養(yǎng)至生長對數(shù)期，將菌液稀釋至OD600=0.1，多功能酶標儀的程序設(shè)置為每間隔4 h 測定OD600吸光度。生長曲線在不同時間段重復(fù)3 次，每組設(shè)置3 個重復(fù)樣本。以HNBP001 菌株作為對照，繪制生長曲線圖，結(jié)果見圖4。野生株HNBP001 和敲除株△sRNA9 均在8 h 進入生長對數(shù)期，生長對數(shù)期后敲除株△sRNA9 生長速率顯著低于野生株HNBP001。結(jié)果表明，敲除sRNA9 片段會影響B(tài).pseudomallei在LB 培養(yǎng)基中的生長。

圖4 類鼻疽伯克霍爾德菌野生株HNBP001 與敲除株△sRNA9 生長曲線Fig 4 Growth curve of B.pseudomallei HNBP001 WT and△sRNA9

2.3 細菌的泳動實驗

在類鼻疽伯克霍爾德菌獲取營養(yǎng)和侵襲宿主細胞時，其泳動能力起重要作用。本實驗通過觀察細菌在3%的軟瓊脂培養(yǎng)基的泳動環(huán)直徑大小來判斷敲除sRNA9 基因后的泳動能力。以野生株HNBP001 作為參照對象，發(fā)現(xiàn)△sRNA9 泳動環(huán)直徑減小，表明sRNA9 基因敲除后泳動能力減弱，結(jié)果見圖5。

圖5 類鼻疽伯克霍爾德菌野生株HNBP001 與敲除株△sRNA9 泳動性Fig 5 Mobility of B.pseudomallei HNBP001 WT and △sRNA9

2.4 生物被膜形成實驗

生物被膜的形成對細菌起著重要的自我防護作用，保護細菌抵御極端的外界環(huán)境。將類鼻疽伯克霍爾德菌野生株HNBP001 與敲除株△sRNA9 菌液加入試管中培養(yǎng)48 h，觀察其生物被膜厚度，經(jīng)過PBS 洗滌、結(jié)晶紫染色、乙酸溶解等步驟，吸取200 μL 液體加入96 孔板進行OD595 吸光度檢測，得到生物被膜結(jié)果。肉眼觀察，敲除株△sRNA9 相較于野生株HNBP001 生物被膜更為稀疏。染色后檢測OD595吸光度，敲除株△sRNA9 顯著低于野生株HNBP001，結(jié)果見圖6。實驗結(jié)果表明，敲除sRNA9 影響其生物被膜的形成。

圖6 類鼻疽伯克霍爾德菌野生株HNBP001 與敲除株△sRNA9 生物被膜形成實驗Fig 6 Biofilm of B.pseudomallei HNBP001 WT and △sRNA9

2.5 藥敏實驗

通過抗菌藥物MIC 測定實驗分析野生株HNBP001 與敲除株△sRNA9 對20 種抗生素的敏感程度，△sRNA9 對所有抗生素MIC 無變化，結(jié)果見表3。實驗結(jié)果表明敲除sRNA9 對B.pseudomallei的耐藥性無明顯改變。

表3 野生株HNBP001 與敲除株△sRNA9 的MIC 值Tab 3 MIC of B.pseudomallei HNBP001 WT and △sRNA9

3 討論

細菌的基因表達由多種分子進行調(diào)控，sRNA通過修飾核糖體和mRNA 的穩(wěn)定性起到抑制或促進作用，從而介導(dǎo)調(diào)控功能的多樣性［10］。大量研究證明sRNA 與細菌毒力、宿主-病原體信息傳遞、抗菌能力和耐藥性等密切相關(guān)［11］。包括調(diào)節(jié)細胞膜的蛋白質(zhì)組成［12］，生物膜形成［12］，含氮化合物的代謝［13］，糖代謝［14］，染色體外DNA 元件的調(diào)節(jié)［15］，轉(zhuǎn)錄和RNA 降解的控制［16］，以及在感染期間細菌毒力的調(diào)節(jié)和宿主生物的相互作用［17］，sRNA 過與靶基因的mRNA 結(jié)合，被證實參與轉(zhuǎn)錄后的細菌毒力水平和環(huán)境壓力適應(yīng)的調(diào)節(jié)

sRNA 已經(jīng)在多種細菌中鑒定出來，并發(fā)現(xiàn)在許多過程中起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。法國學(xué)者發(fā)現(xiàn)一種名為SprD 的sRNA 在金黃色葡萄球菌中發(fā)揮著毒力調(diào)節(jié)作用，并找到其分子靶標Sbi 蛋白，表明sRNA 對細菌的致病性起重要作用［18］。在大腸桿菌中，SgrS 通過下調(diào)PtsG 轉(zhuǎn)運蛋白參與細菌磷酸葡萄糖代謝的應(yīng)激過程，抵抗細菌內(nèi)葡萄糖磷酸化的堆積［19］。目前關(guān)于類鼻疽伯克霍爾德菌中sRNA 的機制研究較少，泰國學(xué)者預(yù)測了1 306 個B.pseudomallei的sRNA 基因，通過實驗篩選出8 個新型sRNA，未進一步驗證其功能［20］。馬來西亞學(xué)者通過模擬不同營養(yǎng)環(huán)境，預(yù)測了12 種差異表達的順式編碼sRNA 的表達譜，該12 種sRNA 可能與B.pseudomallei適應(yīng)營養(yǎng)缺乏環(huán)境有關(guān)［21］。

既往研究證實了sRNA 在其他細菌中的調(diào)控作用，如SmsR4 促進含山梨糖醇培養(yǎng)基中的變形鏈球菌生長［22］，ArcZ、CsrB 和OxyS 等sRNA 通過調(diào)控鞭毛調(diào)節(jié)因子的表達影響生物膜的形成［23］，DicF 通過調(diào)節(jié)腸細胞脫落位點基因和志賀毒素表達調(diào)控大腸桿菌的毒力［24］。本研究以課題組前期表達純化的sRNA 伴侶蛋白Hfq 蛋白為基礎(chǔ)，通過免疫共沉淀的方法篩選出與Hfq 互作的9 種sRNA，運用TPR-pK18mobSacB 自殺性質(zhì)粒載體系統(tǒng)構(gòu)建sRNA9 敲除株。敲除目的sRNA9 基因片段后，細菌平臺期的生長速度低于野生株，但泳動能力和生物被膜形成能力均下降，耐藥性與野生株相比較無差異，以上實驗結(jié)果表明sRNA9可能在類鼻疽伯克霍爾德菌HNBP001的生長和毒力中扮演了重要角色。

綜上所述，通過構(gòu)建類鼻疽伯克霍爾德菌sRNA 敲除株，對其生物學(xué)功能進行初步評價，為后續(xù)研究sRNA 在B.pseudomallei致病過程中的分子機制提供了重要基礎(chǔ)。