張燕斌,王永東,胡 南,仇曉鈺,丁德馨*

(1.鈾礦冶生物技術(shù)國防重點學科實驗室,湖南 衡陽 421001;2.南華大學 極貧鈾資源 綠色開發(fā)技術(shù)湖南省重點實驗室,湖南 衡陽 421001)

0 引 言

1 材料與方法

1.1 菌種和低pH值地浸鈾礦山地下水樣品

1.1.1 菌種

實驗的所用的菌種為瓊氏不動桿菌(AcinetobacterJunii)和伯克霍爾德菌(Burkholderiasp)，購自中國菌種保藏中心。

1.1.2 低pH值地浸鈾礦山地下水

低pH值地浸鈾礦山地下水樣品取自新疆某地浸鈾礦山，pH值為3.0，其主要污染物的種類和含量見表1。

表1 新疆某地浸鈾礦山地下水主要物質(zhì)的種類和含量Table 1 Types and contents of main substances in groundwater of an in-situ leaching uranium mine in Xinjiang 單位：mg·L-1

1.2 菌種的擴大培養(yǎng)

瓊氏不動桿菌和伯克霍爾德菌的擴大培養(yǎng)均采用LB培養(yǎng)基，其配方如下：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L，pH值為7.0，121 ℃高壓滅菌20 min后備用。

將培養(yǎng)基置于培養(yǎng)裝置中(見圖1)，然后按2%的體積比接種菌懸液，往廣口瓶中通氮氣50 min后密封瓶口，將其置于恒溫箱內(nèi)靜置培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為30 ℃。

圖1 培養(yǎng)裝置Fig.1 Cultivation device

1.3 微生物的耐酸馴化

將低pH值地浸鈾礦山地下水過濾除菌，將其pH值調(diào)整為7.0，按2%的體積比分別接種瓊氏不動桿菌和伯克霍爾德菌，在恒溫箱內(nèi)進行厭氧培養(yǎng)，溫度設(shè)置為30 ℃。培養(yǎng)過程中每隔4 h測定OD600值，待其達到對數(shù)生長期后取菌懸液按2%的體積比接種到pH值為6.0的經(jīng)過濾除菌的低pH值地浸鈾礦山地下水中，然后依次按照pH值5.0、4.0和3.0的順序進行梯度馴化。為穩(wěn)定馴化菌的耐酸性能，在每個pH值均轉(zhuǎn)接馴化3次，接種的菌懸液均為上一次馴化的對數(shù)期菌懸液。

1.4 馴化前后瓊氏不動桿菌的生長特性及其去除的性能變化

1.5 馴化前后伯克霍爾德菌的生長特性及其水解植酸鈉的性能變化

1.6 統(tǒng)計分析

本實驗采用SPSS 26.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)采用t檢驗(P<0.05)。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌種馴化

由表2與表3可知，馴化過程中，隨著pH的降低，瓊氏不動桿菌和伯克霍爾德菌生長到對數(shù)期的時間也逐漸延長，但在同一pH值下進行第2次和第3次轉(zhuǎn)接馴化時，兩株細菌的生長速度較第1次馴化明顯提高。采用在pH為3.0馴化得到的菌株開展后續(xù)研究。

表2 pH值和馴化次數(shù)對瓊氏不動桿菌生長的影響Table 2 The influence of pH value and the number of acclimatization on the growth of Acinetobacter janesi 單位：h

表3 pH值和馴化次數(shù)對伯克霍爾德菌生長的影響Table 3 The influence of pH value and the number of acclimatization on the growth of Burkholderia 單位：h

2.2 微生物在不同pH值條件下的生長特性

2.2.1 瓊氏不動桿菌在不同pH值條件下的生長特性

如圖2所示，在pH為7.0和6.0時，瓊氏不動桿菌原始菌株的遲緩期短，瓊氏不動桿菌能夠快速進入對數(shù)生長期，其OD600值最高分別達到0.98、0.88。而當pH為5.0和4.0時，瓊氏不動桿菌的生長速度變緩，遲緩期變長，分別為25 h和33 h，其OD600值最高分別為0.56、0.36。當pH為3.0時，瓊氏不動桿菌的遲緩期達到60 h以上，且其OD600值最高僅為0.10。

圖2 馴化前后的瓊氏不動桿菌在不同pH值地浸鈾礦山地下水中的生長情況Fig.2 The growth of Acinetobacter joneii in the groundwater of in-situ leaching uranium mines with different pH values before and after domestication

瓊氏不動桿菌馴化菌株在pH值為4.0至7.0時，其生物量與原始菌株相比沒有明顯變化。但在pH為3.0至5.0時，瓊氏不動桿菌馴化菌株進入對數(shù)生長期的時間比原始菌株提前10 h以上。當pH值為3.0時，瓊氏不動桿菌馴化菌株的OD600值最高為0.25，與原始菌株相比有明顯提高(P<0.05)。

2.2.2 伯克霍爾德菌在不同pH值條件下的生長特性

如圖3所示，在pH為7.0和6.0時，伯克霍爾德菌原始菌株的遲緩期分別為12 h、19 h，其OD600值最高分別為0.98、0.82。而當pH為5.0和4.0時，伯克霍爾德菌的生長速度變緩，遲緩期變長，分別為23 h和41 h，其OD600值最高分別為0.57、0.39。當pH為3.0時，伯克霍爾德菌幾乎不生長，且其OD600值最高僅為0.02。

圖3 馴化前后的伯克霍爾德菌在不同pH值地浸鈾礦山地下水中的生長情況Fig.3 The growth of Burkholderia spp before and after domestication in the groundwater of in-situ leaching uranium mines with different pH values

馴化后，在pH為7.0和6.0時，伯克霍爾德菌馴化菌株的遲緩期縮短，分別為6 h、9 h,其OD600值最高分別為0.98、0.86。當pH為5.0和4.0時，伯克霍爾德菌的遲緩期分別為22 h和40 h，與原始菌株無明顯區(qū)別，其OD600值最高分別為0.68、0.50。當pH為3.0時，伯克霍爾德菌的遲緩期為67 h，且其OD600值最高為0.36，與原始菌株相比有明顯提高(P<0.05)。

瓊氏不動桿菌能還原硝酸鹽，可用于含硝酸鹽水體的修復。而伯克霍爾德菌是一種解磷菌，可以將植酸鹽水解，生成正磷酸鹽。正磷酸鹽能與鈾結(jié)合生成微溶礦物，從而達到去除水體中鈾的目的。地浸礦山地下水含有較高濃度的硝酸鹽和鈾，可以考慮采用這兩種細菌進行修復。但這兩種細菌的最適生長pH值均為7.0左右，在低pH值條件下，其生長會受到抑制。pH值對微生物生長繁殖的影響有以下幾個方面：一是影響酶的活性，當pH值過低會抑制菌體中某些酶的活性，進而阻礙菌體的新陳代謝；二是影響微生物細胞膜所帶電荷的狀態(tài)，通過改變細胞膜的通透性，影響微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收及對代謝產(chǎn)物的排泄；三是pH值不同，會引起菌體代謝過程的不同，從而使代謝產(chǎn)物的質(zhì)量和比例發(fā)生改變[19]。地浸鈾礦山地下水的pH值通常較低，不利于細菌的生長。如本研究中的地浸鈾礦山地下水的pH值為3.0，瓊氏不動桿菌在此pH值條件下生長時的生物量僅為pH為7.0時的1/10。

菌種馴化一般是指通過人工措施使微生物逐步適應某一條件，而定向選育微生物的方法。通過馴化可以得到具有較高耐受力及活動能力的菌株。本試驗通過耐酸馴化使瓊氏不動桿菌和伯克霍爾德菌適應低pH值的環(huán)境。細胞膜是微生物在低pH環(huán)境中生理脅迫的首要侵襲目標，細胞膜中脂肪酸的組成和比例的變化是其對外部環(huán)境脅迫的一般性應答。經(jīng)過梯度耐酸馴化，微生物細胞膜中單不飽和脂肪酸的含量和碳鏈長度比例增加，降低了細胞膜對H+的透過性，防止細胞膜內(nèi)的pH迅速下降，以維持細胞正常的生理功能[20]，從而能夠在低pH值的環(huán)境中生存。本研究的結(jié)果也證明了采取馴化方法可以提高瓊氏不動桿菌和伯克霍爾德菌對低pH值環(huán)境的適應能力。

2.3 馴化前后瓊氏不動桿菌去除的性能變化

圖4 馴化前后瓊氏不動桿菌對不同pH值 地浸鈾礦山地下水中的去除率Fig.4 Nitrate removal rate of Acinetobacter joneii before and after domestication in groundwater of in-situ leaching uranium mines with different pH values

2.4 馴化前后伯克霍爾德菌的生長特性及其水解植酸鈉的性能變化

如圖5所示，在pH為7.0時，伯克霍爾德菌原始菌株的植酸鈉水解率為79.45%；在pH為6.0、5.0時，伯克霍爾德菌的植酸鈉水解率分別下降到41.35%、26.32%；在pH為4.0時，伯克霍爾德菌的植酸鈉水解率為5.36%；在pH為3.0時，伯克霍爾德菌植酸鈉水解率僅為0.2%。

圖5 馴化前后伯克霍爾德菌對不同pH值 地浸鈾礦山地下水中植酸鈉的水解率Fig.5 The hydrolysis rate of Burkholderia spp. before and after domestication on sodium phytate in groundwater of in-situ leaching uranium mines with different pH values

馴化后，伯克霍爾德菌在pH為7.0時，植酸鈉水解率提高到83.71%；在pH為6.0、5.0時，伯克霍爾德菌的植酸鈉水解率分別提高到45.36%、30.21%；在pH為4.0時，伯克霍爾德菌的植酸鈉水解率提高到16.71%；在pH為3.0時,伯克霍爾德菌植酸鈉水解率為9.73%。

在相同pH值的條件下，伯克霍爾德菌馴化菌株的植酸鈉水解率始終高于原始菌株。此外，隨著pH值的減小，馴化菌株與原始菌株植酸鈉水解能力的差異越來越大。在pH為3.0時，馴化菌株植酸鈉水解率提高了約47.6倍，且與原始組菌株植酸鈉水解能力相比具有顯著差異(P<0.05)。以上結(jié)果表明，通過馴化，伯克霍爾德菌在pH為3.0的地浸鈾礦山地下水中水解植酸鈉的能力得到了顯著提高。

3 結(jié) 論