梁海云，李 琪，2，3，黃莉雅，王麗芳，周向東，2，3

（1.海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，海南 海口 570102；2.海南醫(yī)學(xué)院國家衛(wèi)健委熱帶病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 ?？?70102；3.海南省呼吸疾病中心，海南 ?？?570100）

類鼻疽是由類鼻疽伯克霍爾德菌（Burkholderia pseudomallei）感染所致的傳染病，是人獸共患病，發(fā)病區(qū)域一般都在北緯20°至南緯20°之間，在我國主要分布在海南、廣西、廣東、福建等地［1，2］。主要因接觸污染的土壤或水而感染，皮膚接觸和吸入為主要的感染途徑，也可經(jīng)過母親的母乳傳播給嬰兒［3］。本病一般散發(fā)，無明顯季節(jié)性，但在雨季、洪澇及臺(tái)風(fēng)天發(fā)病率較高［4，5］。人群普遍易感，其中與土地接觸多的農(nóng)民、糖尿病患者、免疫力低下者發(fā)病率高，其中2 型糖尿病已證實(shí)是類鼻疽的獨(dú)立危險(xiǎn)因素［6］。

類鼻疽感染的患者無特異性臨床表現(xiàn)，感染可累及多個(gè)系統(tǒng)，故又稱“似百樣病”（great mimicker），85%導(dǎo)致急性感染，11%導(dǎo)致持續(xù)數(shù)月至數(shù)年的慢性感染，而5%導(dǎo)致隱匿性感染。急性感染以類鼻疽肺炎、類鼻疽敗血病較為常見，多伴有全身多臟器膿腫（脾臟75%、肝臟45%），重癥患者常并發(fā)膿毒血癥、膿毒性休克［7］。其中肺部感染的影像學(xué)改變與空洞性肺結(jié)核、肺膿腫、高毒力肺炎克雷伯桿菌所致肺炎類似［8］，非疫源地區(qū)早期漏診誤診率高，類鼻疽伯克霍爾德菌的天然耐藥機(jī)制及免疫逃逸使其對(duì)多種抗生素耐藥［9］，病情進(jìn)展迅速。

因類鼻疽上述特征，充分認(rèn)識(shí)類鼻疽菌研究其致病機(jī)制及耐藥機(jī)制尤為重要。本文探討類鼻疽伯克霍爾德菌的致病機(jī)制及耐藥機(jī)制，以期為疾病診斷、治療以及疫苗的研究提供思路。

1 類鼻疽菌胞外運(yùn)動(dòng)的機(jī)制

類鼻疽伯克霍爾德菌是土壤腐生菌，為革蘭染色陰性、機(jī)會(huì)性、兼性胞內(nèi)寄生菌。有鞭毛，無芽胞，無莢膜，需氧，在普通培養(yǎng)基上生長良好［10］。Thomas 等［11］在模型小鼠上進(jìn)行類鼻疽定殖實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)小液滴（1 μm）中的細(xì)菌定殖于下呼吸道上皮，而大液滴（12 μm）中的細(xì)菌主要與鼻黏膜和鼻相關(guān)淋巴組織（NALT）有關(guān)。但無論最初的定植部位如何，類鼻疽菌的感染在72 h 內(nèi)迅速在全身擴(kuò)散，遠(yuǎn)端器官可見定植。而類鼻疽在宿主細(xì)胞外游走及黏附在宿主細(xì)胞主要依賴以下結(jié)構(gòu)：

1.1 鞭毛

細(xì)菌的鞭毛不僅允許細(xì)菌在環(huán)境中移動(dòng)，而且在許多物種中，它是入侵宿主細(xì)胞所必需的。類鼻疽菌的鞭毛蛋白亞基由fliC 編碼（BPSL3319）。該基因的缺失或失活在實(shí)驗(yàn)中導(dǎo)致了非運(yùn)動(dòng)性菌株［12-15］。Inglis 等［16］發(fā)現(xiàn)缺乏鞭毛的類鼻疽菌的突變菌株無法附著在棘阿米巴的滋養(yǎng)體上，考慮鞭毛使類鼻疽菌可早期黏附在細(xì)胞上。并且可能起到天然性抗原的作用。

1.2 Ⅳ型菌毛

Ⅳ型菌毛因其黏附作用，是大多數(shù)革蘭陰性桿菌的重要毒力因子，是細(xì)菌初期黏附宿主細(xì)胞的先決條件。當(dāng)類鼻疽菌到達(dá)宿主細(xì)胞膜表面，其Ⅳ型菌毛通過絲聚合和解聚合收縮和伸展［17］，沿著表面移動(dòng)并與宿主細(xì)胞密切接觸，與宿主上皮細(xì)胞結(jié)合起到黏附作用［18］。這導(dǎo)致了類鼻疽菌可以感染全身多處臟器。Ⅳ型菌毛的特殊結(jié)構(gòu)蛋白 PliA，當(dāng)類鼻疽菌缺失了 PliA，細(xì)菌對(duì)宿主細(xì)胞的黏附、損傷作用明顯降低［18］。

2 類鼻疽菌的毒力因子

2.1 BimA

類鼻疽菌在宿主細(xì)胞內(nèi)的胞內(nèi)運(yùn)動(dòng)，以宿主肌動(dòng)蛋白為媒介進(jìn)行。胞內(nèi)動(dòng)力相關(guān)蛋白（BimA），是類鼻疽菌分泌的肌動(dòng)蛋白。類鼻疽菌粘附在宿主細(xì)胞后分泌BimA，BimA 誘導(dǎo)宿主肌動(dòng)蛋白聚集，使細(xì)菌穿過細(xì)胞膜到達(dá)胞內(nèi)［19］。誘導(dǎo)形成的肌動(dòng)蛋白絲讓類鼻疽菌可以在胞內(nèi)移動(dòng)，同時(shí)形成以肌動(dòng)蛋白為基礎(chǔ)的細(xì)胞膜突出結(jié)構(gòu)，使類鼻疽菌可在細(xì)胞間移動(dòng)，并感染其他細(xì)胞，促成了多核巨細(xì)胞（multi-nucleatedgiantcells，MNGC）的形成，類鼻疽菌在胞內(nèi)的生存空間變大，同時(shí)可逃避機(jī)體免疫細(xì)胞的吞噬，并全身擴(kuò)散［20，21］。同時(shí)，BimA 被證實(shí)與肺炎的發(fā)生有關(guān)，BimA 基因的變異，即BimABm變異，與類鼻疽腦脊髓炎發(fā)病有關(guān)，亞洲菌株中尚未發(fā)現(xiàn)此類變異，該地區(qū)腦脊髓炎發(fā)病率低。

2.2 Ⅲ型分泌系統(tǒng)

Ⅲ型分泌系統(tǒng)（type Ⅲ secretion system，T3SS），是由多種蛋白質(zhì)分子組成的一個(gè)復(fù)合結(jié)構(gòu)，類鼻疽菌已知有3 套T3SS，其中僅T3SS-3 為主要有效成分［22］。T3SS 的主要作用是，在類鼻疽菌粘附在宿主細(xì)胞后，可誘導(dǎo)宿主肌動(dòng)蛋白重排，使細(xì)菌可以快速逃逸到細(xì)胞質(zhì)中，主導(dǎo)了類鼻疽菌在宿主細(xì)胞的吞噬逃逸。T3SS 可分泌一種特殊的效應(yīng)蛋白-BopC，Gong 等［23］的實(shí)驗(yàn)證明BopC 的失活會(huì)導(dǎo)致吞噬體中的細(xì)菌存活減少［24］。

2.3 Ⅵ型分泌系統(tǒng)

Ⅵ 型分泌系統(tǒng)（type Ⅵ secretion system，T6SS），是廣泛存在于革蘭氏陰性菌中的一種細(xì)菌分泌系統(tǒng)［25］。在類鼻疽伯克霍爾德菌的T6SS 命名為 tss-5［26］。T6SS 是一個(gè)多基因編碼的多分子復(fù)合物，由膜復(fù)合物、基板復(fù)合物、噬菌體樣結(jié)構(gòu)組成。噬菌體樣結(jié)構(gòu)中的纈氨酸-甘氨酸重蛋白G（VgrG）、溶血素調(diào)節(jié)蛋白（Hcp）起到關(guān)鍵作用［27］。當(dāng)T6SS 被激活，噬菌體中的VgrG，可穿破細(xì)胞膜，并釋放多種效應(yīng)蛋白；效應(yīng)蛋白及其他小分子的毒力，通過Hcp 直接進(jìn)入靶細(xì)胞中，可導(dǎo)致細(xì)胞膜空泡化，抑制細(xì)胞生長，破壞細(xì)菌細(xì)胞形態(tài)［28］。

T6SS 在促進(jìn)MNGC 形成中也起到關(guān)鍵作用，有研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)類鼻疽菌喪失了Hcp、VgrG 后，無法形成MNGC，無法進(jìn)行細(xì)胞融合［29，30］。缺乏T6SS，導(dǎo)致類鼻疽菌在細(xì)胞間傳播減少，是類鼻疽菌重要的毒力因子。

2.4 莢膜多糖（CPS）

在鏡下觀察類鼻疽菌生長時(shí)，可見細(xì)菌外部附有一層呈放射性生長的絲狀物，這是類鼻疽菌的莢膜多糖，研究表明莢膜多糖可保護(hù)類鼻疽菌，使其不被吞噬細(xì)菌吞噬，主要是莢膜多糖有抗溶菌酶體作用［31］。已知類鼻疽菌可潛伏感染幾個(gè)月甚至數(shù)年之久，這可能是導(dǎo)致類鼻疽菌潛伏感染的機(jī)制［32］。

2.5 類鼻疽伯克霍爾德致死因子1

類鼻疽伯克霍爾德致死因子1（burkholderia lethal factor 1，BLF1），是類鼻疽菌第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的致死因子，使宿主細(xì)胞失去mRNA 的解旋酶活性，抑制蛋白質(zhì)的翻譯起始階段，蛋白質(zhì)的合成受到抑制，細(xì)胞受損失去活性［32，33］。

3 耐藥機(jī)制

類鼻疽菌擁有最大的細(xì)菌基因組之一（7.2 Mb），包含大量毒力決定因子［34］，使其臨床表現(xiàn)多樣化，缺乏特異性，對(duì)其耐藥機(jī)制的研究進(jìn)展困難。現(xiàn)已知，類鼻疽菌有天然耐藥機(jī)制，對(duì)臨床上多種常見抗生素如喹諾酮類、一代及二代頭孢、青霉素類等耐藥。實(shí)驗(yàn)條件下，可見類鼻疽菌對(duì)頭孢他啶、碳青霉烯類抗生素等敏感，隨著診療時(shí)間的延長，抗生素選擇不當(dāng)，可導(dǎo)致類鼻疽菌對(duì)四環(huán)素等的耐藥性增加。其中，頭孢他啶作為類鼻疽菌首選用藥［35］，早期一線使用可讓患者臨床癥狀明顯減輕，這可作為與高毒力肺炎克雷伯桿菌所致肺炎相鑒別要點(diǎn)。目前類鼻疽伯克霍爾德菌耐藥機(jī)制尚未明確，可能與外排泵、抗生素靶位點(diǎn)的改變有關(guān)［36，37］。

3.1 外排泵

細(xì)菌的外排作用是產(chǎn)生耐藥性的重要機(jī)制，外排系統(tǒng)目前被劃分為六個(gè)超級(jí)家族，其中類鼻疽細(xì)胞 膜 上 存 在 3 個(gè) 外 排 泵 AmrAB-OprA，BpeAB-OprB，and BpeEF-OprC，均為RND（耐藥節(jié)結(jié)化細(xì)胞分化家族）型外排泵［38，39］。外排泵通過改變其自身的調(diào)節(jié)因子，使類鼻疽菌對(duì)某種類型抗生素產(chǎn)生耐藥，amrA 和amrB 基因是AmrAB-OprA的重要組成基因，AmrAB-OprA 可使氨基糖苷類藥物及大環(huán)內(nèi)酯類藥物外排［40］。其余外排泵耐藥機(jī)制尚未研究清楚。

3.2 抗生素靶位點(diǎn)改變及其他

在Shafiq 等［41］的研究中，從2018～2019 年廣東省獲得了8 株類鼻疽菌臨床分離株，采用Illumina NovaSeq 平臺(tái)測序，多位點(diǎn)序列分型（MLST）和單核苷酸多態(tài)性（SNP）分析，分析菌株的多樣性和流行病學(xué)特征。實(shí)驗(yàn)得出類鼻疽菌對(duì)頭孢他啶的耐藥性可能是由A 類β-內(nèi)酰胺酶PenA（編碼高度保守的A 類β-內(nèi)酰胺酶的基因）的突變引起；外膜蛋白Omp38，是類鼻疽菌細(xì)胞膜外膜上的一種孔道蛋白，參與編碼類鼻疽菌的外膜孔，外層膜孔的結(jié)構(gòu)降低類鼻疽菌對(duì)β-內(nèi)酰胺的滲透性；在所有菌株中均發(fā)現(xiàn)了基因gyrA，Viktorov 等研究證實(shí)gyrA 的突變是導(dǎo)致喹諾酮類藥物耐藥的原因。

4 討論

以上是類鼻疽菌的致病及耐藥機(jī)制，類鼻疽菌慢性潛伏及急性起病的方式，于宿主之間關(guān)系仍有待驗(yàn)證。目前相關(guān)研究顯示，類鼻疽菌在宿主細(xì)胞中長期存活可能與類鼻疽菌可引起宿主細(xì)胞自噬有關(guān)。夏瑀培等［42］通過實(shí)驗(yàn)將類鼻疽菌感染THP-1 細(xì)胞后，在感染2 h 后觀察宿主細(xì)胞線粒體受損情況，經(jīng)觀察發(fā)現(xiàn)經(jīng)感染后的宿主細(xì)胞線粒體，自噬小體GFP-LC3 共定位明顯增多（P＜0.01），提示類鼻疽菌感染后，誘導(dǎo)了宿主細(xì)胞線粒體自噬的發(fā)生。如何阻止上述機(jī)制發(fā)生，仍有待進(jìn)一步研究。

從類鼻疽菌初次發(fā)現(xiàn)至今，尚未能明確其感染以及耐藥的機(jī)制，隨交通方式的便捷化，非疫區(qū)發(fā)病率在逐漸升高，因缺乏對(duì)該細(xì)菌的認(rèn)知，誤診率隨之上升［2］。其中針對(duì)T6SS 中的結(jié)構(gòu)，溶血素調(diào)節(jié)蛋白（Hcp）特異性的IgG 抗體檢測，是目前重要的早期篩查指標(biāo)［43］。雖然 Hcp1 特異性的IgG 抗體檢測，是重要靶標(biāo)，但 在感染早期、重度感染、免疫力低下人群中易出現(xiàn)假陰性［44］。二代及三代細(xì)菌基因測序手段（NGS）等提高了類鼻疽病確診率［45］。臨床采集標(biāo)本中，以肺泡灌洗液陽性率高。

借此綜述，對(duì)當(dāng)前類鼻疽菌的致病及耐藥機(jī)制進(jìn)行論述。未來對(duì)類鼻疽菌的診治及研究展望：（1）利用NGS 等測序手段，較快速明確診斷。宏基因二代測序（mNGS），在早期可快速明確感染病原體，并進(jìn)行耐藥檢測［46］。（2）采用宏基因組學(xué)的方式，可更全面的挖掘細(xì)菌的新型基因組學(xué)，進(jìn)一步的抗菌藥物佐劑研發(fā)。（3）針對(duì)類鼻疽菌可導(dǎo)致免疫逃逸的T3SS、T6SS、BimA 等機(jī)制，是否可進(jìn)行進(jìn)一步的干擾及疫苗的研究。（4）莢膜多糖的溶菌酶作用可能是導(dǎo)致類鼻疽菌潛伏感染的機(jī)制，可進(jìn)一步進(jìn)行針對(duì)該結(jié)構(gòu)的分子探針的研究，已期進(jìn)行疾病的初篩。（5）臨床上可見類鼻疽合并鐵超載的情況，似乎與類鼻疽的發(fā)病率增加有關(guān)，可能表明鐵在發(fā)病機(jī)制中起著比已知的更重要的作用，可針對(duì)此進(jìn)行更進(jìn)一步研究。